CN104897889B

CN104897889B - 荧光SiO2胶体试剂的制备方法及使用荧光SiO2胶体试剂的试纸

Info

Publication number: CN104897889B
Application number: CN201510283348.0A
Authority: CN
Inventors: 姜国胜; 刁玉涛; 张华�; 刘振东; 成丽娟; 孙尚文; 王舒健
Original assignee: INSTITUTE OF BASIC MEDICINE SAMS
Current assignee: Shandong Shuoke Biotechnology Co ltd
Priority date: 2015-05-28
Filing date: 2015-05-28
Publication date: 2017-03-01
Anticipated expiration: 2035-05-28
Also published as: CN104897889A

Abstract

本发明公开了荧光SiO₂胶体试剂的制备方法及使用荧光SiO₂胶体试剂的试纸，制备方法包括制备氨基修饰的荧光SiO₂纳米粒子；SiO₂纳米氨基的羧基化；通过羧基化荧光SiO₂纳米粒子与抗体蛋白的偶联，得到荧光SiO₂纳米粒子。本发明的有益效果是：通过制备氨基修饰的荧光SiO₂纳米粒子、羧基化荧光SiO₂纳米粒子和将羧基化LDS粒子与抗体蛋白的偶联来制造荧光SiO₂胶体试剂，制作过程简易可行；利用荧光SiO₂胶体试剂与免疫层析技术相结合，制备的检测试纸，可以实现定性检测有色和无色样品，扩大了常规胶体金标记试纸的应用领域。

Description

荧光SiO2胶体试剂的制备方法及使用荧光SiO2胶体试剂的试纸

技术领域

本发明涉及荧光SiO₂胶体试剂的制备方法及使用荧光SiO₂胶体试剂的试纸。

背景技术

免疫层析技术目前最常用的方法为免疫胶体金层析技术，其基本过程是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。

免疫胶体金层析技术自从上世纪70年代被提出以来，已在生物医学，特别是医学检验领域获得了飞跃式发展，目前已有各种试纸条的开发和面市。作为诊断试剂，免疫胶体金试纸条具有结构简单、使用方便、灵敏度和准确度较高等特点。这类试纸条的基本特点是依靠胶体金特殊聚集状态下的颜色对检测结果作出判断，应用的前提是被检物本身的颜色不能干扰胶体金条带的颜色，否则难以对结果作出明确判断。但在实际应用过程中所接触到的大部分待检样品为有色液体，如酿造行业中的酱油、食醋等均具有较深的颜色，大多数农产品和加工食品的提取液也不是无色透明的液体，医学检验时所用人体体液(血清、尿液等)也具有特定颜色，这些待检样本自身固有颜色会掩盖胶体金条带的颜色，严重时无法读取检测结果。因此，为了扩大该技术方法的应用领域和范围，特提出本发明，其基本特征是以免疫荧光SiO₂纳米粒子胶体代替免疫金胶体，以荧光代替纳米金粒子的自身显色，突破了传统免疫胶体金试纸无法检测有色样品的限制，扩大了应用领域并提高了检测灵敏度。

发明内容

本发明的目的是提供荧光SiO₂胶体试剂的制备方法，以及使用荧光SiO₂胶体试剂制作检测灵敏度高、能够检测有色样品的免疫层析试纸。

为了达成上述目的，本发明采用如下技术方案：

荧光SiO₂胶体试剂的制备方法

包括以下步骤：

1)制备氨基修饰的荧光SiO₂纳米粒子：利用聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X100)、环己烷、正己醇和水形成微乳体系的液体，在微乳体系中加入二氯化三联吡啶钌六水合物([Ru(bpy)₃]²⁺Cl^- ₂·6H₂O)溶液后搅拌，继续加入正硅酸四乙酯(TEOS)、氨水之后，形成核壳结构，继续加入正硅酸乙酯(TEOS)和3-氨基丙基三乙氧基硅烷(triethoxysilane)，得到氨基修饰的SiO₂纳米粒子溶液，经过破乳、清洗、干燥后得到荧光SiO₂纳米粒子；

2)SiO₂纳米氨基的羧基化：利用N,N-二甲基甲酰胺对步骤1)中得到的纳米粒子进行清洗、搅拌得到羧基化的荧光SiO₂纳米粒子；

3)通过羧基化荧光SiO₂纳米粒子与抗体蛋白的偶联，得到抗体致敏的荧光SiO₂纳米粒子。

步骤1)的具体步骤如下：

1-1)利用Triton-X100、环己烷、正己醇和水在搅拌设定时间后形成微乳体系；

1-2)在步骤1-1)得到的微乳体系中加入浓度为100mg/ml的[Ru(bpy)₃]²⁺Cl^- ₂·6H₂O水溶液后，进行搅拌，[Ru(bpy)₃]²⁺Cl^- ₂·6H₂O水溶液与步骤1-1)中加入水的体积比是1:2；

1-3)在步骤1-2)得到的溶液中加入与步骤1-2)中[Ru(bpy)₃]²⁺Cl^- ₂·6H₂O同体积的TEOS后进行搅拌，加入氨水后，在室温条件下，搅拌，使得溶液中形成核壳结构，进行静置；

1-4)向步骤1-3)中得到的溶液中加入步骤1-3)中TEOS体积3/5的TEOS和步骤1-3)中TEOS体积3/5的triethoxysilane，在室温条件下，继续搅拌后，得到氨基修饰的SiO₂纳米粒子；

1-5)在步骤1-4)中得到的溶液中加入丙酮，进行破乳，分别用乙醇和PBS(pH＝6.8)对破乳后的溶液清洗数次，得到纳米粒子，将得到的纳米粒子真空冷冻干燥。

步骤2)的具体步骤如下：

2-1)将步骤1)中得到的SiO₂纳米粒子，在氮气的保护下，加入质量浓度在8％-15％的琥珀酸酐N,N-二甲基甲酰胺溶液；

2-2)持续通氮气，连续搅拌反应，得到离心的羧基化SiO₂纳米粒子；

2-3)将步骤2-2)得到的离心的羧基化SiO₂纳米粒子沉淀，对其充分干燥。

步骤3)的具体步骤如下：

3-1)取设定质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶液使之充分溶解，形成I液；

3-2)取设定质量的羧基化的荧光SiO₂纳米粒子，用PBS溶液溶解，形成II液；

3-3)取待标记抗体蛋白,溶于PBS中，形成III液；

3-4)将步骤3-2)获得的II液和步骤3-3)获得的III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入步骤3-1)获得的部分I液；

3-5)在室温条件下，对步骤3-4)获得的溶液在避光条件下，继续逐滴加入余下的I液；

3-6)在4℃的条件下，对步骤3-5)获得的溶液搅拌；

3-7)在4℃的条件下，对步骤3-6)获得的溶液静置；

3-8)用设定浓度的PBS溶液对3-7)获得的物质清洗三次，干燥后，获得抗体致敏的荧光SiO₂胶体试剂。

步骤1-1)中Triton-X100、环己烷、正己醇和水的体积比是17.7:75:16:2。

步骤3-1)中的EDC的质量与所述步骤3-2)中荧光SiO₂纳米粒子的质量比是4:1。

荧光SiO₂胶体免疫层析试纸的装配：

在底衬上依次贴下端样品吸收垫、硝酸纤维素膜和上端样品吸收垫，底衬为透明PVC底衬，在下端样品吸收垫与硝酸纤维素膜之间搭接荧光SiO₂胶体结合垫，在硝酸纤维素膜上设有两条平行的检测线T和质控线C，在下端样品吸收垫上依次设置检测液面下线和检测液面上限，用于使用时提示操作者正常的浸渍范围。

在所述荧光SiO₂胶体结合垫内含有对待检物的特异性抗体的致敏荧光SiO₂粒子复合物。

检测线T包含待检物-BSA(牛血清白蛋白)载体复合物。

质控线C内含兔抗鼠IgG二抗。

本发明的有益效果

1)通过制备氨基修饰的荧光SiO₂纳米粒子、羧基化荧光SiO₂纳米粒子和将羧基化LDS粒子与抗体蛋白的偶联来制造荧光SiO₂胶体试剂，制作过程简易可行；

2)利用荧光SiO₂胶体试剂与免疫层析技术相结合，制备的检测试纸，可以实现定性检测和定量检测；

3)该试纸能检测有色样品，扩大了应用领域；

4)该试纸检测结果条带为荧光显示，故能排除背景颜色的干扰，提高检测的灵敏度，无机SiO₂胶体荧光基团性质稳定，发光效率高，耐储存。

附图说明

图1是本发明中试纸结构原理图；

图2是本发明检测效果图；

其中，1.检测液面下限；2.下端样品吸收垫；3.检测液面上限；4.荧光SiO₂胶体结合垫；5.检测线T；6.硝酸纤维素膜；7.质控线C；8.透明PVC底板；9.上端样品吸收垫。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

Triton-X100(聚乙二醇辛基苯基醚，生工生物工程(上海)有限公司)；

环己烷(天津市瑞金特化学品有限公司)；

正己醇(莱阳经济技术开发区精细化工厂)；

[Ru(bpy)₃]²⁺Cl^- ₂·6H₂O(二氯化三联吡啶钌六水合物，ALDRICH)；

TEOS(正硅酸四乙酯，天津市瑞金特化学品有限公司)；

氨水(天津市化学试剂三厂)；

triethoxysilane(3-氨基丙基三乙氧基硅烷，ALDRICH)；

丙酮(国药集团化学试剂有限公司)；

琥珀酸酐(国药集团化学试剂有限公司)；

EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(上海思域化工科技有限公司)

琥珀酸酐N,N-二甲基甲酰胺溶液：将琥珀酸酐溶解到N,N-二甲基甲酰胺溶剂当中。

荧光SiO₂胶体试剂的制作步骤

1.制备氨基修饰的荧光SiO₂纳米粒子(LDS)

首先取1.77mlTriton-X100、7.5ml环己烷、1.6ml正己醇和200μl水于室温下磁力搅拌10min后形成微乳体系，然后在此体系中加入100μl浓度为100mg/ml的[Ru(bpy)₃]²⁺Cl^- ₂·6H₂O水溶液搅拌5min，加入100μl TEOS搅拌30min后加入60μl氨水在室温下搅拌用于引发形成核壳结构。24hr后向体系中加入50μl TEOS和50μl(3-aminopropyl)triethoxysilane在室温下继续搅拌12hr可以得到氨基修饰的SiO₂纳米粒子。反应完成后，用丙酮破乳，分别用乙醇和水(PBS,pH6.8)洗3次得纳米颗粒，经真空冷冻干燥后备用，产量约32mg。

2.SiO₂纳米氨基的羧基化

32mg氨基修饰的SiO₂纳米粒子沉淀用N,N-二甲基甲酰胺洗涤一次，在氮气保护下加入20ml浓度为10％的琥珀酸酐N,N-二甲基甲酰胺溶液，继续通氮气连续搅拌反应6hr。离心得羧基化的LDS粒子沉淀约30mg，充分干燥备用。

3.羧基化LDS粒子与抗体蛋白的偶联

3-1)取EDC 4mg,用pH＝8.0的10m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解，形成I液；

3-2)取羧基化的LDS粒子1mg,用10m mol/L PBS溶液2ml溶解，形成II液；

3-3)取待标记抗体蛋白150μg,溶于10mmol/L PBS(pH＝8.0)液中，形成III液；

3-4)将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液(余下0.5ml)；

3-5)室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液；

3-6)在4℃的条件下，4度搅拌12小时；

3-7)在4℃的条件下，静置10小时；

3-8)用10m mol/L PBS溶液对3-7)获得的物质清洗三次，干燥后，获得抗体致敏的荧光SiO₂胶体试剂。

(二)检测试纸条的制作

在底衬上依次贴下端样品吸收垫2、硝酸纤维素膜6和上端样品吸收垫9，底衬为透明PVC底板8，在下端样品吸收垫2与硝酸纤维素膜6之间搭接荧光SiO₂胶体结合垫4，在硝酸纤维素膜6上设有两条平行的检测线T5和质控线C7，在下端样品吸收垫2上依次设置检测液面下线1和检测液面上限3，二者间隔设定的距离，用于使用时提示操作者正常的浸渍范围。

检测线T包含待检物-BSA(牛血清白蛋白)载体复合物。

质控线C内含兔抗鼠IgG二抗。

检测试纸条的装配模式图见附图1。将制得的抗体致敏的荧光SiO₂胶体试剂包被在结合垫上，真空冷干后于4℃存放。将样品吸收垫、胶体结合垫分别粘贴在带NC膜的PVC衬板上，用划膜仪将人工竞争抗原，如待检物-BSA(牛血清白蛋白)载体复合物和二抗包被在硝酸纤维素膜(NC)(预先粘附于PVC衬板)上，分别形成间隔0.5cm的测试线(T线)和质控线(C线)，室温晾干并封闭。用切割机切成3-5mm宽的条状，即制成试纸条，置于4℃避光干燥保存。

在使用本发明中的试纸时，取待检物适量，将试纸条的下端样品吸收垫浸入液面以下，使液面位于试纸条在检测液面下限和检测液面上限之间，待液面上升并进入上端样品吸收垫后取出试纸条，放置到紫外灯箱下，确保试纸条正面朝向紫外灯管方向，开启紫外灯电源观察条带显色情况，通过试验，使用该试纸检测酱油，如图2所示，试纸检测结果条带为荧光显示，故能排除背景颜色(黑色)的干扰，提高了检测的灵敏度且发光效率高。

以上所述，仅为本发明的具体实施方案，但本发明的保护范围并不局限于此，任何未违背本发明的精神实质与原理下所作的变化或替换，都包含在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims

1.荧光SiO₂胶体试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）制备氨基修饰的荧光SiO₂纳米粒子：利用Triton-X100、环己烷、正己醇和水形成微乳体系的液体，在微乳体系中加入二氯化三联吡啶钌六水合物溶液后搅拌，继续加入正硅酸四乙酯、氨水之后，形成核壳结构，继续加入正硅酸乙酯和3-氨基丙基三乙氧基硅烷，得到氨基修饰的SiO₂纳米粒子溶液，经过破乳、清洗、干燥后得到荧光SiO₂纳米粒子；

2）SiO₂纳米氨基的羧基化：利用N,N-二甲基甲酰胺对步骤1）中得到的纳米粒子进行清洗、搅拌得到羧基化的荧光SiO₂纳米粒子；

3）通过羧基化荧光SiO₂纳米粒子与抗体蛋白的偶联，得到抗体致敏的荧光SiO₂纳米粒子；

所述步骤1）的具体步骤如下：

1-1）利用Triton-X100、环己烷、正己醇和水在搅拌设定时间后形成微乳体系；

1-2）在步骤1-1）得到的微乳体系中加入浓度为100mg/ml 的[Ru(bpy)₃]²⁺Cl^- ₂· 6H₂O水溶液后，进行搅拌，[Ru(bpy)₃]²⁺Cl^- ₂· 6H₂O水溶液与步骤1-1）中加入水的体积比是1:2；

1-3）在步骤1-2）得到的溶液中加入与步骤1-2）中[Ru(bpy)₃]²⁺Cl^- ₂· 6H₂O 同体积的TEOS后进行搅拌，加入氨水后，在室温条件下，搅拌，使得溶液中形成核壳结构，进行静置；

1-4）向步骤1-3）中得到的溶液中加入步骤1-3）中TEOS体积3/5的TEOS和步骤1-3）中TEOS体积3/5的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在室温条件下，继续搅拌后，得到氨基修饰的SiO₂纳米粒子；

1-5）在步骤1-4）中得到的溶液中加入丙酮，进行破乳，分别用乙醇和设定pH值的PBS对破乳后的溶液清洗数次，得到纳米粒子，将得到的纳米粒子真空冷冻干燥；

所述步骤3）的具体步骤如下：

3-1）取设定质量的EDC，用PBS溶液使之充分溶解，形成I液；

3-2）取设定质量的羧基化的荧光SiO₂纳米粒子，用PBS溶液溶解，形成II液；

3-3）取待标记抗体蛋白, 溶于PBS中，形成III液；

3-4）将步骤3-2）获得的II液和步骤3-3）获得的III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入步骤3-1）获得的部分I液；

3-5）在室温条件下，对步骤3-4）获得的溶液在避光条件下，继续逐滴加入余下的I液；

3-6）在4℃的条件下，对步骤3-5）获得的溶液搅拌；

3-7）在4℃的条件下，对步骤3-6）获得的溶液静置；

3-8）用设定浓度的PBS溶液对3-7）获得的物质清洗三次，干燥后，获得抗体致敏的荧光SiO₂胶体试剂；

所述步骤1-1）中Triton-X100、环己烷、正己醇和水的体积比是17.7:75:16:2；

所述步骤3-1）中的EDC的质量与所述步骤 3-2）中荧光SiO₂纳米粒子的质量比是4:1。

2.如权利要求1所述的荧光SiO₂胶体试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2）的具体步骤如下：

2-1）将步骤1）中得到的SiO₂纳米粒子，在氮气的保护下，加入质量浓度在8%-15%的琥珀酸酐N,N-二甲基甲酰胺溶液；

2-2）持续通氮气，连续搅拌反应，得到离心的羧基化SiO₂纳米粒子；

2-3）将步骤2-2）得到的离心的羧基化SiO₂纳米粒子沉淀，对其充分干燥。

3.一种使用如权利要求1所述的制备方法制备的荧光SiO₂胶体试剂的试纸，其特征在于，在底衬上依次贴下端样品吸收垫、硝酸纤维素膜和上端样品吸收垫，在下端样品吸收垫与硝酸纤维素膜之间搭接荧光SiO₂胶体结合垫，在硝酸纤维素膜上设有两条平行的检测线T和质控线C，在下端样品吸收垫上依次设置检测液面下线和检测液面上限，用于使用时提示操作者正常的浸渍范围。

4.如权利要求3所述的试纸，其特征在于，在所述荧光SiO₂胶体结合垫内含有对待检物的特异性抗体的致敏荧光SiO₂粒子复合物。

5.如权利要求3所述的试纸，其特征在于，所述检测线T包含待检物-BSA载体复合物。

6.如权利要求3所述的试纸，其特征在于，所述质控线C内含兔抗鼠IgG二抗。