CN117250352B - 胃蛋白酶检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了胃蛋白酶检测试剂盒，涉及生物医药技术领域。所述的试剂盒包括金标垫，所述的金标垫的制备包括以下步骤：（1）将金标垫使用预处理液进行预处理；（2）将胃蛋白酶单克隆抗体加入至胶体金溶液中，进行反应；（3）将BSA溶液加入至金标抗体溶液中进行反应，离心，将沉淀物置于复溶液中复溶，得金标抗体溶液；（4）将步骤（3）得到的金标抗体溶液喷涂于步骤（1）预处理后的金标垫；步骤（1）中所述的预处理液按照终浓度计包括0.1‑2mol/L缓冲液、0.5‑2%柠檬酸钠、0.1‑5%甲醇和2‑6%酪蛋白。本发明的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、准确性高的优点，可为胃食管反流病的诊断提供依据。

Description

胃蛋白酶检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及胃蛋白酶检测试剂盒。
背景技术
胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是指胃或十二指肠内容物向上反流入食管、口腔、肺等部位引起的疾病，胃食管反流病的典型症状如烧心、反酸主要由酸反流导致。酸反流不仅损伤食管粘膜，还可以到达咽部、喉部、鼻腔、中耳及气道，并对相应部位产生损伤。目前，临床常用的诊断胃食管反流病的方式包括：胃镜检查、胃食管反流相关问卷如GerdQ、24小时pH-阻抗检测、PPI诊断性试验等。24小时pH-阻抗检测是诊断胃食管反流病的可靠方式，但该检查为侵入性，价格较为昂贵，并且有研究表明其诊断胃食管反流病的灵敏度较差。
胃蛋白酶是胃内容物中的成分之一，是由胃主细胞产生的一种消化酶，它仅由胃内产生当胃食管反流病发生时，胃蛋白酶随其他的内容物进入食管。唾液中胃蛋白酶检测作为较新的诊断胃食管反流病的方式，具有非入侵性和易于检测的优势，获得患者和临床医师的认同。胃蛋白酶的检测方法包括纤维蛋白原法、消解法、蛋白质印迹法、酶联免疫吸附法、胃蛋白酶免疫测定法、Peptest检测方法，具有快速、便捷、无创的优势。
现有技术中公开了使用Peptest检测唾液中胃蛋白酶的方法，将疑似胃食管反流的患者进行内窥镜检查，并被分为非糜烂性反流病和糜烂性食管炎亚组。还招募了一个健康对照组。所有参与者都接受了反流疾病问卷调查，患者得分大于12，对照组得分为零。所有参与者都提供了餐后唾液样本，大多数患者提供了额外的症状后样本用于胃蛋白酶分析。总共招募了1032名年龄在19至78岁之间的参与者。所有中心的结果显示总体胃蛋白酶阳性敏感性为85%，特异性为60%，阳性预测值为82%（Validation in China of a non-invasive salivary pepsin biomarker containing two unique human pepsinmonoclonal antibodies to diagnose gastroesophageal reflux disease, Wang YF,Yang CQ, Chen YX, et al. J Dig Dis, 2019,20(6):278-287.）。
中国专利CN105092563A中公开了酶联免疫试剂盒及其制备和利用其进行胃蛋白酶检测的方法，所述试剂盒包括：盒体；酶标板，其包括多个微孔，所述微孔内包被有胃蛋白酶单克隆抗体，所述酶标板容置在盒体内；试剂瓶，其容置于盒体内，所述试剂瓶内分别装有工作液、标准溶液、缓冲液、洗涤液及显色液，其中所述工作液含有酶标胃蛋白酶抗体。所述酶标胃蛋白酶抗体的标记物为辣根过氧化物酶，采用过碘酸钠法进行标记。该发明所述酶联免疫试剂盒能够利用化学发光酶联免疫技术对胃蛋白酶进行检测，从而达到无创诊断咽喉反流性疾病的目的。
中国专利CN102128928A中公开了一种胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒、及其制备方法。该发明所述的胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒，包括：1）胃蛋白酶抗原校准品；2）样品收集液，pH 2-3；3）样品稀释液，pH 6-8；4）胃蛋白酶抗体包被的微孔板；5）胃蛋白酶抗体标记物；6）化学发光底物液；以及7）浓缩洗涤液。该发明的试剂盒可以检测出胃液中、食管内容物、咽喉部分泌物、鼻咽部分泌物、气管支气管分泌物中的胃蛋白酶含量，并且根据是否可以检出胃蛋白酶来判断是否存在胃食管反流，具有无创、简便、快速、灵敏、稳定等优点，但其检测的准确性较低。
目前，亟需一种检测方法简单、检测准确性高的胃蛋白酶检测试剂盒，能够通过检测唾液中胃蛋白酶进而确定是否患有胃食管反流病的方法，为胃食管反流病的辅助诊断提供依据。
发明内容
本发明的目的是提供胃蛋白酶检测试剂盒，具体是一种准确度和稳定性较高的胃蛋白酶检测试剂盒，解决了现有技术中胃蛋白酶检测试剂盒稳定性差和准确性较低的问题。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种胃蛋白酶检测试剂盒，所述的试剂盒包括金标垫，所述的金标垫的制备包括以下步骤：
（1）将金标垫使用预处理液进行预处理；
（2）将胃蛋白酶单克隆抗体加入至胶体金溶液中，进行反应；
（3）将步骤（2）的溶液离心，将沉淀物置于复溶液中复溶，得金标抗体溶液；
（4）将步骤（3）得到的金标抗体溶液喷涂于步骤（1）预处理后的金标垫；
步骤（1）中所述的预处理液按照终浓度计包括0.1-2mol/L缓冲液、0.5-2%柠檬酸钠、0.1-5%甲醇和2-6%酪蛋白。
进一步地，所述的预处理液按照终浓度计包括1mol/L缓冲液、1%柠檬酸钠、0.5%甲醇和5%酪蛋白。
进一步地，所述的预处理的步骤为：将金标垫在预处理液中浸泡1-10min，烘干。
再进一步地，所述的金标垫在预处理液中浸泡的时间为1min。
优选地，所述的预处理时烘干的温度为25-37℃；进一步地，所述的烘干的温度为37℃。
优选地，步骤（2）所述的胶体金溶液的制备包括以下步骤：
将柠檬酸三钠溶液加入至沸腾的氯金酸溶液中，当溶液的颜色由灰黑色变为酒红色时，继续反应，室温冷却，得胶体金溶液。
优选地，所述的柠檬酸三钠溶液的浓度为0.1-2%；
进一步地，所述的柠檬酸三钠溶液的浓度为1%。
优选地，所述的氯金酸溶液的浓度为1-2%；
进一步地，所述的氯金酸溶液的浓度为1%；
优选地，所述的氯金酸溶液与柠檬酸三钠溶液的体积比为1：（0.1-5）；
进一步地，所述的氯金酸溶液与柠檬酸三钠溶液的体积比为1:1.8。
进一步地，中所述的继续反应的时间为5min。
进一步地，步骤（2）中所述的胶体金溶液的pH为8.5。
再进一步地，调节pH的试剂选自硼酸溶液、碳酸钾溶液中的一种或多种。
更进一步地，调节pH的试剂为碳酸钾溶液。
进一步地，步骤（2）中所述的反应的时间为20-60min；再进一步地，所述的反应的时间为30min。
优选地，步骤（2）中所述的胃蛋白酶单克隆抗体与胶体金溶液的质量体积比为（5-50）μg：1mL。
进一步地，步骤（2）中所述的胃蛋白酶单克隆抗体与胶体金溶液的质量体积比为10μg：1mL。
优选地，所述的离心的条件为4℃，8000-12000rpm下，离心20-40min；
再进一步地，所述的离心的转速为10000rpm，离心的时间为30min。
优选地，步骤（3）中所述的复溶液包括0.10.02-1mol/L缓冲液、0.01-0.10.1-4%吐温、2-6%甘露醇蔗糖和0.1-0.5%槐糖脂0.5%-2%牛血清白蛋白。
进一步地，步骤（3）中所述的复溶液包括0.1mol/L缓冲液、1%吐温、2%蔗糖、1%牛血清白蛋白。
优选地，所述的预处理液和复溶液中的缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种。
进一步地，所述的缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
再进一步地，所述的缓冲液的pH为7-9。
更进一步地，所述的缓冲液的pH为7.4。
优选地，所述的试剂盒包括反应垫，所述的反应垫上包括检测线和质控线。
进一步地，所述的检测线上包被有胃蛋白酶单克隆抗体，所述的质控线上包被有山羊抗小鼠IgG多克隆抗体。
优选地，所述的试剂盒包括检测卡和用于包装检测检测卡的卡盒。
进一步地，所述的检测卡包括底板、样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫。
再进一步地，所述的样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫顺次粘在底板上。
优选地，所述的反应垫的材质为硝酸纤维素膜，所述的硝酸纤维素膜上包括检测线和质控线。
优选地，所述的胃蛋白酶检测试剂盒的检测样本为唾液。
根据本发明的一些实施方式，胃蛋白酶检测试剂盒的制备包括以下步骤：
（1）用胶体金标记的胃蛋白酶单克隆抗体1喷涂预处理的金标垫；
（2）在检测线和质控线上分别喷涂胃蛋白酶单克隆抗体2和山羊抗小鼠IgG多克隆抗体，制得反应垫；
（3）将样品垫、金标垫、反应垫、吸水垫依次粘贴在底板上，制得检测卡；
（4）将检测卡装入卡壳制得检测试剂盒。
优选地，步骤（1）中胶体金标记物溶液喷涂量为1-5μL/mm。
优选地，步骤（2）中检测线的胃蛋白酶单克隆抗体2的浓度为0.8-1.5mg/mL，喷涂量为0.05-2μL/mm；质控线上山羊抗小鼠IgG多克隆抗体的包被浓度为1.0-3.0mg/mL，喷涂量为0.5-5μL/cm。
进一步地，所述的胃蛋白酶单克隆抗体2的浓度为1mg/mL，所述的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体的浓度为2mg/mL。
又一方面，本发明提供了一种胃蛋白酶的检测方法，为使用上述的胃蛋白酶检测试剂盒进行检测，将待测样本加入检测卡样品孔，5-15分钟判读结果。
优选地，所述的试剂盒中待测样本的上样量为50-100μL。
进一步地，所述的待测样本的上样量为80μL。
进一步地，所述的结果分析为：
（1）阳性：当检测线（T）和质控线（C）均显示两条红色条带，判为阳性；
（2）阴性：当检测线（T）不显示红色条带，质控线（C）显示红色条带，判为阴性；
（3）无效：当检测线（T）与质控线（C）均未显示红色条带，判为无效。
又一方面，本发明提供了上述的胃蛋白酶检测试剂盒或上述的制备方法制得的胃蛋白酶检测试剂盒在制备检测胃食管反流病产品中的应用。
本发明试剂盒的检测原理为：当待检唾液样本加入到检测卡的加样孔中，样本向下移动，若样本中含有胃蛋白酶，胃蛋白酶与胶体金标记的胃蛋白酶单克隆抗体结合，在层析作用下继续向前流动。当流动至检测线时，与检测线上包被的胃蛋白酶单克隆抗体结合，形成复合物而显色，并且游离的胶体金标记胃蛋白酶单克隆抗体与质控线包被的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体结合并显色，此结果即为阳性，若检测样本仅在质控线处显色，则判定为阴性。
本发明的有益效果为：
本发明的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、准确性高的优点，并且试剂盒的成本低、操作简单、检测时间短，为非侵入性检测，患者的接受度较高。用本发明的试剂盒检测口腔中的胃蛋白酶的方法便捷、快速、直观、准确、适用范围广，并且可为胃食管反流病的诊断提供依据。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。下述实施例中所使用的原料若无特殊说明，均来源于市售。
实施例1 胃蛋白酶的检测试剂盒的制备
一、胶体金的制备
将1mL 1%氯金酸溶液加入100mL纯水中，加热至沸腾，待溶液沸腾3分钟后，加入0.9 mL 2%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸，当溶液的颜色由灰黑色变为酒红色时，继续反映5min，冷却至室温，得到粒径均一的胶体金溶液，保存于2-8℃备用。
二、金标垫的制备
将金标垫在预处理液中浸泡10min，所述的预处理液按照终浓度计包括1mol/LTris-HCl缓冲液、1%柠檬酸钠、0.5%甲醇和5%酪蛋白，于37℃烘干2小时。
向均一的胶体金溶液中加入K2CO3溶液，调节pH为8.5，向调节好pH的胶体金溶液中边搅拌边加入胃蛋白酶单克隆抗体，胃蛋白酶单克隆抗体与胶体金的质量体积比为30μg：1mL，得到胶体金标记的胃蛋白酶单克隆抗体，反应10min后，离心30min（4℃，10000rpm），将沉淀物置于复溶液中复溶，复溶液包括0.5mol/L Tris-HCl缓冲液、1%吐温、2%蔗糖、1%牛血清白蛋白，即得胶体金标记物溶液。
将胶体金标记物溶液以1.66 μL/mm的喷涂量喷在玻璃纤维膜上，玻璃纤维膜的宽度为5mm，干燥后制得金标垫。
三、样品垫的制备
将玻璃纤维在37℃、湿度＜30%的条件下干燥3h，将玻璃纤维切割为19mm宽，密封于铝箔袋中干燥备用。
四、反应垫的制备
将硝酸纤维素膜裁剪后贴在底板上，用1mg/mL的胃蛋白酶单克隆抗体以喷涂量为1μL/cm喷涂在检测线（T线）上，用1.2mg/mL的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体以喷涂量为1μL/cm喷涂在质控线（C线）上，检测线与质控线相距5mm，干燥3h。
五、试剂盒的组装
在底板上按照样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫的顺序进行粘贴，将其裁剪成4mm宽的检测卡，将裁剪好的检测卡装进盒体内。
实施例2 胃蛋白酶检测试剂盒的制备
一、胶体金的制备
将1mL 2 %氯金酸溶液加入至100mL纯水中，加热至沸腾，待溶液沸腾3分钟后，加入2 mL 1.5%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸，当溶液的颜色由灰黑色变为酒红色时，继续反映5min，冷却至室温，得到粒径均一的胶体金溶液，保存于2-8℃备用。
二、金标垫的制备
将金标垫在预处理液中浸泡10min，所述的预处理液按照终浓度计包括1.5mol/LTris-HCl缓冲液、0.5%柠檬酸钠、0.5%甲醇和2%酪蛋白，于37℃烘干2小时。
向均一的胶体金溶液中加入K2CO3溶液，调节pH为8.5，向调节好pH的胶体金溶液中边搅拌边加入胃蛋白酶单克隆抗体，胃蛋白酶单克隆抗体与胶体金的质量体积比为40μg：1mL，得到胶体金标记的胃蛋白酶单克隆抗体，反应10min后，离心30min（4℃，10000rpm），将沉淀物置于复溶液中复溶，复溶液包括1mol/L Tris缓冲液、1%吐温、2%蔗糖、1%牛血清白蛋白，即得胶体金标记物溶液。
将胶体金标记物溶液以1.66 μL/mm的喷涂量喷在玻璃纤维膜上，玻璃纤维膜的宽度为5mm，干燥后制得金标垫。
试剂盒制备的步骤三-步骤五同实施例1。
实施例3 胃蛋白酶检测试剂盒的制备
一、胶体金的制备
将1mL 1%氯金酸溶液加入至100mL纯水中，加热至沸腾，待溶液沸腾3分钟后，加入0.9 mL 2%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸，当溶液的颜色由灰黑色变为酒红色时，继续反映5min，冷却至室温，得到粒径均一的胶体金溶液，保存于2-8℃备用。
二、金标垫的制备
将金标垫在预处理液中浸泡10min，所述的预处理液按照终浓度计包括2mol/LTris-HCl缓冲液、2%柠檬酸钠、2%甲醇和6%酪蛋白，于37℃烘干2小时。
向均一的胶体金溶液中加入K2CO3溶液，调节pH为8.5，向调节好pH的胶体金溶液中边搅拌边加入胃蛋白酶单克隆抗体，胃蛋白酶单克隆抗体与胶体金的质量体积比为50μg：1mL，得到胶体金标记的胃蛋白酶单克隆抗体，反应10min后，离心30min（4℃，10000rpm），将沉淀物置于复溶液中复溶，复溶液包括1mol/L Tris-HCl缓冲液、1%吐温、2%蔗糖、1%牛血清白蛋白，即得胶体金标记物溶液。
将胶体金标记物溶液以1.66 μL/mm的喷涂量喷在玻璃纤维膜上，玻璃纤维膜的宽度为5mm，干燥后制得金标垫。
试剂盒制备的步骤三-步骤五同实施例1。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于，金标垫的制备过程中，金标垫未经过预处理液处理，其余步骤皆相同。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于，金标垫的预处理液不同，其余皆相同，对比例2中金标垫的预处理液按照终浓度计包括5mol/L Tris-HCl缓冲液、3%柠檬酸钠、5%蔗糖和1%牛血清白蛋白。
对比例3
对比例3与实施例1的区别在于，金标垫的预处理液不同，其余皆相同，对比例3中金标垫的预处理液按照终浓度计包括1mol/L Tris-HCl缓冲液和1%柠檬酸钠。
对比例4
对比例4与实施例1的区别在于，金标垫的预处理液不同，其余皆相同，对比例4中金标垫的预处理液按照终浓度计包括1mol/L Tris-HCl缓冲液、0.5%甲醇和5%酪蛋白。
实施例4 试剂盒的性能检测
1、灵敏度实验
将胃蛋白酶参考品稀释成如下不同浓度：0、2.5μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L，所用的稀释液为pH 7.2的PBS缓冲液。使用实施例1-3和对比例1-4的试剂盒进行检测，每个浓度重复检测3次，将80μL的待检测液滴加到检测卡中，10分钟后进行结果的判读。
当检测线和质控线均显色时，判定结果为阳性。
当质控线显色，检测线不显色，判定结果为阴性。
当质控线不显色时，判定结果为无效。
试剂盒的灵敏度检测结果如下表1所示。
表1 试剂盒的灵敏度
从上表可知，本发明制备的试剂盒具有较高的灵敏性，其灵敏性高于对比例1-4制备的试剂盒。
2、阴性参考品符合率
使用实施例1-3的试剂盒对30份胃蛋白酶阴性参考品进行检测，每个试剂盒检测10份参考品，检测结果如下表2。
表2 检测阴性样本结果
结果表明，实施例1-3制备的试剂盒检测胃蛋白酶阴性样本时，结果均为阴性，阴性符合率为100%。
3、阳性参考品符合率
使用实施例1-3的试剂盒对30份胃蛋白酶阳性参考品进行检测，每个试剂盒检测10份参考品，检测结果如下表3。
表3 检测阳性样本结果
结果表明，实施例1-3制备的试剂盒检测胃蛋白酶阴性样本时，结果均为阳性，阳性符合率为100%。
4、批内和批间重复性实验
实验方法：将采用实施例1的方法制备的同批和不同批次的胃蛋白酶检测试剂盒分别检测2.5μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L浓度的胃蛋白酶标准品。每个浓度检测3次，观察试剂盒的重复性。
实验结果：经检测，试剂盒的批内和批间重复性为100%。
5、特异性实验
实验方法：将胃蛋白酶、胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ、唾液淀粉酶、胰蛋白酶配制成浓度分别为0、5mg/L、10mg/L、20mg/L的标准溶液，利用本发明的实施例1-3和对比例1-4制备的胃蛋白酶检测试剂盒进行检测，每个浓度重复检测3次，结果如下所示。
表4 实施例1-3试剂盒的特异性检测结果
从上表可以看出，使用本发明的试剂盒检测胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ、唾液淀粉酶和胰蛋白酶的检测结果均为阴性，说明本发明的试剂盒具有较好的特异性。
对比例1制备的试剂盒的特异性检测结果如下表5所示。
表5 对比例1试剂盒的特异性检测结果
对比例2制备的试剂盒的特异性检测结果如下表6所示。
表6 对比例2试剂盒的特异性检测结果
对比例3制备的试剂盒的特异性检测结果如下表7所示。
表7 对比例3试剂盒的特异性检测结果
对比例4制备的试剂盒的特异性检测结果如下表8所示。
表8 对比例4试剂盒的特异性检测结果
分别将阿莫西林、铝碳酸镁、兰索拉唑、胃乐宁、铝镁加的标准品配制成以下浓度，利用本发明实施例1-3的胃蛋白酶检测试剂盒进行检测，每个浓度重复检测3次，结果如下所示。
表9.
从上表中可以看出，阿莫西林浓度≤500mg/L、铝碳酸镁浓度≤150mg/L、兰索拉唑浓度≤40mg/L、胃乐宁浓度≤600mg/L、铝镁加浓度≤1.5g/L时，试剂盒的检测结果均为阴性。
6、稳定性实验
将实施例1-3和对比例1-4制备的胃蛋白酶检测试剂盒在37℃保存4周后，检测浓度为0、2.5μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L的胃蛋白酶标准品，所用的稀释液为pH 7.2的PBS缓冲液。每个浓度重复检测3次，将80μL的待检测液滴加到检测卡中，10分钟后进行结果的判读，结果如下表。
表10.
由上述的结果可知，实施例1-3制备的试剂盒的显色正常，灵敏度仍然能达到2.5μg/L，证明其稳定性较好，对比例1-4制备的试剂盒的稳定性较差于实施例1-3。
实施例5 试剂盒的临床性能验证
样本采集要求：
1. 采集前1小时内不可饮用含有咖啡因的饮料、碳酸饮料和吸烟。
2. 采集前24小时不可饮酒。
3. 采集前48小时内不可服用碱性的水或饮料、抗酸药（如铝碳酸镁咀嚼片、铝镁加混悬液、磷酸铝凝胶等药物）及藻酸盐抗酸剂（如含有藻酸和碳酸氢钠的Gaviscon）等。
4. 采集前避免剧烈运动。
5. 样本采集时间于清晨起床未进食前或餐后1小时后，请患者以咳嗽清嗓、从深喉部咯出至少1mL唾液吐到配套使用的样本管中。
6. 采集的样本应在室温（18-30℃）条件下2小时内完成检测，2-8℃放置不可超过3天，在-20℃冷冻保存不超过12个月。
7. 检测前样本必须充分恢复至室温（18-30℃）。冷冻保存的样本需完全恢复至室温、混合均匀后方可使用，反复冻融次数不超过3次。
试剂盒的检测方法：
试剂盒使用前恢复至室温（18-30℃），取出检测卡，将检测卡放置在水平工作台面上，将采集到的样本取80μL滴加到样品孔中，10分钟后进行结果的判读。
实验结果的判定：
（1）当检测线和质控线均显色时，判定结果为阳性。
（2）当质控线显色，检测线不显色，判定结果为阴性。
（3）当质控线不显色时，判定结果为无效。
实验样本：收集40份确认的为食管反流病患者的唾液和40份健康人的唾液，使用实施例1-3和对比例1-4制备的试剂盒对样本进行检测，检测结果如下：
表11 试剂盒的检测结果
从上表中可以看出，实施例1-3制备的试剂盒检测时的总符合率高于对比例1-4试剂盒的总符合率，实施例1-3的试剂盒具有较高的准确性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种胃蛋白酶检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括金标垫，所述的金标垫的制备包括以下步骤：
（1）将金标垫使用预处理液进行预处理；
（2）将胃蛋白酶单克隆抗体加入至胶体金溶液中，进行反应；
（3）将步骤（2）的溶液离心，将沉淀物置于复溶液中复溶，得金标抗体溶液；
（4）将步骤（3）得到的金标抗体溶液喷涂于步骤（1）预处理后的金标垫；
步骤（1）中所述的预处理液按照终浓度计包括1mol/L缓冲液、1%柠檬酸钠、0.5%甲醇和5%酪蛋白；
所述的试剂盒包括反应垫，所述的反应垫上包括检测线和质控线，所述的检测线上包被有胃蛋白酶单克隆抗体，所述的质控线上包被有山羊抗小鼠IgG多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的胃蛋白酶检测试剂盒，其特征在于，步骤（3）中所述的复溶液包括0.02-1mol/L缓冲液、0.1-4%吐温、2-6%蔗糖和0.5%-2%牛血清白蛋白。
3.根据权利要求2所述的胃蛋白酶检测试剂盒，其特征在于，步骤（3）中所述的复溶液包括0.1mol/L缓冲液、1%吐温、2%蔗糖、1%牛血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的胃蛋白酶检测试剂盒，其特征在于，步骤（2）中所述的胃蛋白酶单克隆抗体与胶体金溶液的质量体积比为（5-50）μg：1mL。
5.根据权利要求1-4任一项所述的胃蛋白酶检测试剂盒，其特征在于，所述的胃蛋白酶检测试剂盒的检测样本为唾液。
6.一种胃蛋白酶的检测方法，其特征在于，使用权利要求1-5任一项所述的胃蛋白酶检测试剂盒进行检测，将待测样本加入检测卡样品孔，5-15分钟判读结果，所述的待测样本的上样量为50-100μL。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，判断方法如下：
（1）阳性：当检测线和质控线均显示两条红色条带，判为阳性；
（2）阴性：当检测线不显示红色条带，质控线显示红色条带，判为阴性；
（3）无效：当检测线与质控线均未显示红色条带，判为无效。
8.权利要求1-5任一项所述的胃蛋白酶检测试剂盒在制备检测胃食管反流病产品中的应用。
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