CN104749363A - 幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置及制法 - Google Patents

幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置及制法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置及制法。由固相有纯化的高特异性鼠抗人IgM、IgG抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体的硝酸纤维素膜、吸附有胶体金标记幽门螺杆菌尿素酶抗原和鼠IgG的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成。优点在于：结构简单，构思新颖，将抗人IgM与IgG抗体包被于硝酸纤维膜膜上，特异性强，既能同时检测标本中幽门螺杆菌尿素酶IgM和IgG抗体，又没有增加生产操作的复杂度。通过配合合适的喷金缓冲液和样品垫处理液，可保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。检测装置灵敏度高、特异性强、操作简便省时、实用性强。

Description

幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置及制法
技术领域
本发明涉及医疗检测设备领域，特别涉及一种幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置及制法，可实现幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG的灵敏、特异、快速检测。
背景技术
幽门螺杆菌（Hp）感染在慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等消化道疾病致病中起重要作用。流行病学调查证明，我国成人HP感染率在50%以上。在幽门螺杆菌感染的检测中，细菌培养、组织病理学检查、尿素酶试验、呼气试验等方法或因为给患者造成的侵入性痛苦，或需要一定的条件和技术，或因为需要特殊仪器，或因为费用昂贵等，其临床推广及多次重复追踪复查受到限制。而血清学检测因其非侵入性、快速、准确，可同时处理大量标本，检测不同类型的抗体，在临床检验、基础研究中倍受青睐。20世纪80年代兴起的胶体金免疫层析检测，操作简单快捷、结果清晰易于判断、无需复杂的实验技能和特殊设备，具有广泛应用前景。
感染Hp后，多数人症状较轻或无症状，不加治疗和延缓治疗的病情会严重，因此研究Hp感染在早期检测具有重要意义。根据抗体产生规律，血清IgM在幽门螺杆菌感染后2~4周出现，然后IgG在6~8周出现。IgM一般在2~6个月后完全消失。IgG通常缓慢减少。因此检测IgM抗体有助于对疾病早期诊断。传统幽门螺杆菌尿素酶抗体检测方法只能检测针对幽门螺杆菌尿素酶抗体，不能对抗体进行分类。
发明内容
本发明的目的在于提供一种幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置及制法，解决了现有技术存在的上述问题。本发明由固相有纯化的高特异性鼠抗人IgM、IgG抗体(检测线T1、T2)和羊抗鼠IgG多克隆抗体(对照线)的硝酸纤维素膜、吸附有胶体金标记幽门螺杆菌尿素酶抗原（HP Ure-Ag）和鼠IgG的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成。由于疾病不同阶段，机体抗体表达存在不同，本发明可同时检测患者体内抗幽门螺杆菌尿素酶IgM和IgG抗体，具有特异、快速、灵敏的特点。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置，样品垫1、免疫胶体金玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫胶体金玻璃纤维膜2搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述硝酸纤维素膜3上设置第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C；所述的第一检测线T1上固相有纯化的高特异性鼠抗人IgM抗体；所述的第二检测线T2上固相有纯化的高特异性鼠抗人IgG抗体；所述的质控线C上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体。
所述的第一检测线T1距离硝酸纤维素膜3的边缘3~15mm。
所述的第二检测线T2距离硝酸纤维素膜3的边缘5~17mm。
所述的质控线C距离硝酸纤维素膜3的边缘10~18mm。
本发明的另一目的在于提供一种幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置的制备方法，包括如下步骤：
（a）采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
（b）采用步骤（a）中制得的胶体金标记幽门螺杆菌尿素酶B抗原获得免疫胶体金；
（c）采用喷金缓冲液稀释步骤（b）的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体玻璃纤维膜；
（d）在硝酸纤维膜的检测线喷点抗人IgM和IgG抗体，在质控线上喷点羊抗鼠IgG，制得免疫硝酸纤维素膜；
（e）将预处理的样品垫、步骤（c）制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤（d）制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
步骤（a）所述的采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒粒径为20~60nm。
步骤（c）所述的喷金缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白（BSA）组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5~20%，海藻糖浓度为1~5%，BSA浓度为0.5~1% 。
步骤（d）所述的在硝酸纤维膜的检测线喷点抗人IgM和IgG抗体，其中抗人IgM在前，IgG在后，IgM检测线距硝酸纤维素膜上缘距离3~15mm，IgG检测线距硝酸纤维素膜上缘距离5~17mm；质控线上喷点羊抗鼠IgG距硝酸纤维素膜上缘10~18mm。
步骤（e）所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂S17组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5~1%，酪蛋白浓度为0.1~0.2%、表面活性剂S17浓度为0.5~1%。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的检测装置结构简单，构思新颖，将抗人IgM与IgG抗体包被于硝酸纤维膜膜上，特异性强，既能同时检测标本中幽门螺杆菌尿素酶IgM和IgG抗体，又没有增加生产操作的复杂度。
2、免疫胶体金制备步骤中，通过配合合适的喷金缓冲液和样品垫处理液，可保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。
3、本发明的检测装置不需要任何特殊仪器设备， 检测成本低。
4、本发明的检测装置操作简便， 不需要专业人员操作。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明的结构示意图。
图中：1、样品垫；2、免疫胶体金玻璃纤维膜；3、硝酸纤维素膜；4、吸收垫；5、塑料板；T1、第一检测线；T2、第二检测线；C、质控线。
具体实施方式
下面结合附图进一步说明本发明的详细内容及其具体实施方式。
参见图1所示，本发明的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置，包括样品垫1、免疫胶体金玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸收垫4、塑料板5、第一检测线T1、第二检测线T2、质控线C，所述样品垫1、免疫胶体金玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫胶体金玻璃纤维膜2搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述硝酸纤维素膜3上设置第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C；所述的第一检测线T1上固相有纯化的高特异性鼠抗人IgM抗体；所述的第二检测线T2上固相有纯化的高特异性鼠抗人IgG抗体；所述的质控线C上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体。
所述的第一检测线T1距离硝酸纤维素膜3的边缘3~15mm。
所述的第二检测线T2距离硝酸纤维素膜3的边缘5~17mm。
所述的质控线C距离硝酸纤维素膜3的边缘10~18mm。
本发明所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置的制备方法，包括固相有纯化的高特异性鼠抗人IgM、IgG抗体(检测线T1、T2)和羊抗鼠IgG多克隆抗体(对照线)的硝酸纤维素膜、吸附有胶体金标记幽门螺杆菌尿素酶抗原（HP Ure-Ag）和鼠IgG的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料因此粘贴制成。具体如下步骤：
（a）采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
（b）采用步骤（a）中制得的胶体金标记幽门螺杆菌尿素酶B抗原获得免疫胶体金；
（c）采用喷金缓冲液稀释步骤（b）的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体玻璃纤维膜；
（d）在硝酸纤维膜的检测线喷点抗人IgM和IgG抗体，在质控线上喷点羊抗鼠IgG，制得免疫硝酸纤维素膜；
（e）将预处理的样品垫、步骤（c）制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤（d）制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
步骤（a）所述的采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒粒径为20~60nm。
步骤（c）所述的喷金缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白（BSA）组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5~20%，海藻糖浓度为1~5%，BSA浓度为0.5~1% 。
步骤（d）所述的在硝酸纤维膜的检测线喷点抗人IgM和IgG抗体，其中抗人IgM在前，IgG在后，IgM检测线距硝酸纤维素膜上缘距离3~15mm，IgG检测线距硝酸纤维素膜上缘距离5~17mm；质控线上喷点羊抗鼠IgG距硝酸纤维素膜上缘10~18mm。
步骤（e）所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白、表面活性剂S17组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5~1%，酪蛋白浓度为0.1~0.2%、表面活性剂S17浓度为0.5~1%。
    实施例：
    幽门螺杆菌尿素酶胶体金的制备
    1、胶体金溶液制备
在加热的100ml纯化水中快速加入氯化金，待溶液再次沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠，氯化金：柠檬酸三钠1：（0.5-2），继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续加热10分钟即可。胶体金颗粒为20-60nm，选取30nm胶体金进行下一步实验。
    2、免疫胶体金制备
1)分别取100毫升30nm胶体金溶液，加入pH调节剂 140μl，混匀；静置5min；
2)在30nm胶体金溶液中，按照每毫升胶体金溶液14μg的比例加入幽门螺杆菌尿素酶，共1.4mg，混匀；静置5min；
3)分别按照0.4%的比例加入胶体金稳定剂 0.4毫升，混匀，静置5分钟；
4)10000、12000、14000rpm离心10min，分别收集沉淀，合并三次收集的沉淀。
    3、采用优化在喷金缓冲液（浓度为0.02mol/L Tris-HCL液、浓度为5-20%的蔗糖、浓度为1-5%的海藻糖、浓度为1%的BSA，PH为8.5）稀释免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体玻璃纤维膜。
    4、固相硝酸纤维素膜
    4.1对照线喷液量的选择
将纯化好的羊抗鼠IgG多克隆抗体稀释到浓度为1mg/ml，用自动喷膜机喷涂质控线，喷膜量分别为1.6μl/cm、1.4μl/cm、1.2μl/cm，比较用不同喷膜量所得的划线效果。结果表明1.4μl/cm喷膜量时所划线边缘整齐，线条精细。
    4.2硝酸纤维素膜检测线与对照线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将抗人IgM抗体和抗人IgG抗体稀释至1.5mg/ml，对照线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与对照线。室温干燥过夜。储存备用。硝酸纤维膜的检测线喷点抗人IgM和IgG抗体，其中抗人IgM在前，IgG在后，IgM检测线距硝酸纤维素膜上缘距离3-15mm，IgG检测线距硝酸纤维素膜上缘距离5-17mm；质控线上喷点羊抗鼠IgG距硝酸纤维素膜上缘10-18mm。其中本检测装置选择最佳距离IgM检测线距硝酸纤维素膜上缘距离6mm，IgG检测线距硝酸纤维素膜上缘距离11mm，羊抗鼠IgG距硝酸纤维素膜上缘16mm.
    4.3样品垫预处理
    将玻璃纤维用样品垫处理液（浓度为0.1mol/L Tris-HCL液、浓度为0.5-1%的牛血清白蛋白BSA、浓度为0.1-0.2%的酪蛋白、浓度为0.5-1%的表面活性剂S17）浸泡10min,37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度。
 5、检测装置的组装
样品垫（1）、免疫胶体金玻璃纤维膜（2）、硝酸纤维素膜（3）、吸收垫（4）分别粘贴在塑料板（5），所述硝酸纤维素膜（3）的两端分别与吸收垫（4）、免疫胶体金玻璃纤维膜（2）搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜（2）的另一端与样品垫（1）搭接；所述硝酸纤维素膜（3）上设置第一检测线（T1）、第二检测线（T2）和质控线（C）；所述的第一检测线（T1）上固相有纯化的高特异性鼠抗人IgM抗体；所述的第二检测线（T2）上固相有纯化的高特异性鼠抗人IgG抗体；所述的质控线（C）上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体，见图1。切成 5mm 宽小条，装于塑料壳中，用铝箔袋密封保存。常温保存，有效期一年。
    6、临床检测应用：
选择吉林省前卫医院16例消化科就诊患者，留取血清检测：
其中，2例结果IgM和IgG双阳性，该患者有为初始患者，检测结果与临床表现相符。
     12例患者IgG阳性，临床均为有胃炎病史，结果与临床相符。
     2例患者阴性。
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明， 本发明的范围由所附权利要求书限定。本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置，其特征在于：样品垫（1）、免疫胶体金玻璃纤维膜（2）、硝酸纤维素膜（3）、吸收垫（4）分别粘贴在塑料板（5），所述硝酸纤维素膜（3）的两端分别与吸收垫（4）、免疫胶体金玻璃纤维膜（2）搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜（2）的另一端与样品垫（1）搭接；所述硝酸纤维素膜（3）上设置第一检测线（T1）、第二检测线（T2）和质控线（C）；所述的第一检测线（T1）上固相有纯化的高特异性鼠抗人IgM抗体；所述的第二检测线（T2）上固相有纯化的高特异性鼠抗人IgG抗体；所述的质控线（C）上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置，其特征在于：所述的第一检测线（T1）距离硝酸纤维素膜（3）的边缘3~15mm。
3.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置，其特征在于：所述的第二检测线（T2）距离硝酸纤维素膜（3）的边缘5~17mm。
4.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置，其特征在于：所述的质控线（C）距离硝酸纤维素膜（3）的边缘10~18mm。
5.一种幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（a）采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
（b）采用步骤（a）中制得的胶体金标记幽门螺杆菌尿素酶B抗原获得免疫胶体金；
（c）采用喷金缓冲液稀释步骤（b）的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体玻璃纤维膜；
（d）在硝酸纤维膜的检测线喷点抗人IgM和IgG抗体，在质控线上喷点羊抗鼠IgG，制得免疫硝酸纤维素膜；
（e）将预处理的样品垫、步骤（c）制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤（d）制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
6.根据权利要求5所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤（a）所述的采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒粒径为20~60nm。
7.根据权利要求5所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤（c）所述的喷金缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白（BSA）组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5~20%，海藻糖浓度为1~5%，BSA浓度为0.5~1% 。
8.根据权利要求5所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤（d）所述的在硝酸纤维膜的检测线喷点抗人IgM和IgG抗体，其中抗人IgM在前，IgG在后，IgM检测线距硝酸纤维素膜上缘距离3~15mm，IgG检测线距硝酸纤维素膜上缘距离5~17mm；质控线上喷点羊抗鼠IgG距硝酸纤维素膜上缘10~18mm。
9.根据权利要求5所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤（e）所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白、表面活性剂S17组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5~1%，酪蛋白浓度为0.1~0.2%、表面活性剂S17浓度为0.5~1%。
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