CN105092563A - 酶联免疫试剂盒及制备和利用其进行胃蛋白酶检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酶联免疫试剂盒及制备和利用其进行胃蛋白酶检测的方法，所述试剂盒包括：盒体；酶标板，其包括多个微孔，所述微孔内包被有胃蛋白酶单克隆抗体，所述酶标板容置在盒体内；试剂瓶，其容置于盒体内，所述试剂瓶内分别装有工作液、标准溶液、缓冲液、洗涤液及显色液，其中所述工作液含有酶标胃蛋白酶抗体。所述酶标胃蛋白酶抗体的标记物为辣根过氧化物酶，采用过碘酸钠法进行标记。本发明所述酶联免疫试剂盒能够利用化学发光酶联免疫技术对胃蛋白酶进行精确的检测，从而达到无创诊断咽喉反流性疾病的目的。

Description

酶联免疫试剂盒及制备和利用其进行胃蛋白酶检测的方法

技术领域

本发明涉及临床诊断技术领域，更具体地说，本发明涉及一种用于胃蛋白酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒，可进行胃蛋白酶的含量检测，并对咽喉反流性疾病进行无创诊断。

背景技术

咽喉反流性疾病是指胃内容物反流至食管上括约肌以上部位，引起一系列症状和体征的总称，临床表现为声音嘶哑或发音障碍、咽喉肿痛、咽喉部异物感、持续清嗓、慢性长期咳嗽、呼吸困难、喉痉挛等症状，以及声带后连合区域粘膜增生、肥厚，声带弥漫性充血水肿，严重时出现肉芽肿、喉室消失、声门下狭窄等喉部体征。

咽喉反流性疾病是耳鼻咽喉头颈外科一些疾病的源头病因，与慢性喉炎、声带息肉、喉接触性肉芽肿等喉部疾患关系密切。目前，咽喉反流性疾病的诊断一般依据症状和喉镜检查的反流症状指数量表以及反流体征评分量表、24小时喉咽部pH监测和胃蛋白酶试剂盒进行诊断。量表诊断缺乏特异性，准确度差；24小时喉咽部pH监测属于有创检查，不易被患者接受；目前应用的胃蛋白酶试剂盒检测唾液中胃蛋白酶诊断咽喉反流，虽然是无创检查，但其是传统的酶联免疫技术，灵敏度较差，且每天患者咽喉反流次数有限，唾液中的胃蛋白酶含量相对较低，只有在咽喉反流后一段时间内的唾液中才能监测到，漏诊率高。

化学发光免疫分析技术是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项新的免疫测定技术。它将化学发光分析的高灵敏度与抗原抗体反应的高特异性相结合，与目前常用的其他免疫分析法相比具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、测量线性范围宽、稳定性好，可实现自动化、使用简便、安全、无放射性污染等诸多优点，因此倍受人们的青睐，该技术已广泛应用于传染性疾病、肥胖及相关疾病、内分泌系统、遗传病、肿瘤的早期诊断、动植物检验检疫等众多领域。

但是，目前还没有采用化学发光酶联免疫技术检测胃蛋白酶的相关技术，也没有用于胃蛋白酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒。

另外，传统的酶联反应试剂盒结构较为简单和单一，在进行试验操作过程中具有一定的不便利性。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明的另一个目的是，提供一种用于胃蛋白酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒，能够利用化学发光酶联免疫技术对待测样品中的胃蛋白酶进行精确的定量检测。

本发明的另一个目的是，提供一种通过检测口腔或咽喉分泌物中胃蛋白酶含量进行无创诊断咽喉反流性疾病的方法。

本发明还有一个目的是，提供一种结构更为合理的试剂盒，能够提高使用便利性，并有助于提高试验检验的精确度。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，本发明提供了以下技术方案：

一种酶联免疫试剂盒，包括：

盒体；

酶标板，其包括多个微孔，所述微孔内包被有胃蛋白酶单克隆抗体，所述酶标板容置在盒体内；

试剂瓶，其容置于盒体内，所述试剂瓶内分别装有工作液、标准溶液、缓冲液、洗涤液及显色液，其中所述工作液含有酶标胃蛋白酶抗体。

优选的是，所述的酶联免疫试剂盒中，所述酶标胃蛋白酶抗体的标记物为辣根过氧化物酶，采用过碘酸钠法进行标记。

优选的是，所述的酶联免疫试剂盒中，所述标准溶液为梯度浓度的氯霉素系列标准溶液，所述标准溶液内氯霉素的浓度分别为0ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml及100ng/ml；

所述显色液的化学发光底物为鲁米诺；以及

所述胃蛋白酶为人胃蛋白酶。

优选的是，所述的酶联免疫试剂盒中，所述盒体顶部开口，盒体的开口处设置有可抽拉的盖体；

所述盒体内还设置有带有凹槽和多个竖直孔洞的卡板；

所述酶标板水平嵌入在所述卡板的凹槽内，所述试剂瓶分别嵌入在所述卡板的孔洞内。

优选的是，所述的酶联免疫试剂盒中，

所述盖体为透明设置；

所述盖体与盒体的连接方式为：所述盒体开口的两侧设置有第一卡槽，所述盖体两侧设置有与第一卡槽相匹配的凸条，使盖体可沿所述第一卡槽滑动，以使盒体打开或合盖；

其中，所述第一卡槽的两端分别设置有1个限位块；沿所述盖体两侧凸条的外侧开设有第二卡槽，所述第二卡槽内设置有滚珠，使盖体沿所述第一卡槽滑动时所述滚珠能够沿所述第二卡槽同向自由滚动，并在滚珠抵达所述限位块位置及第二卡槽端部时停止，以使所述盖体停止滑动并得到定位；

此外，所述盖体两端分别设置有密封件，所述密封件与所述盖体的两端为90-180°可弯折连接，使密封件向下弯折90°时可贴附所述盒体两侧以将盒体密封；向上弯折时可解除盒体的密封并使盖体进行滑动；

所述盖体两侧沿所述第二卡槽设置有密封条。

优选的是，所述的酶联免疫试剂盒中，所述卡板的孔洞深度大于所述试剂瓶的高度，且所述孔洞底部设置有弹簧，所述试剂瓶底部设置有用于与弹簧相吸附的磁扣，以将试剂瓶与弹簧活动连接；

其中，所述弹簧的高度以其上放置试剂瓶后的自然状态下，试剂瓶顶部高于所述孔洞开口边缘0.8-1.5cm为准；

此外，所述卡板的大小与所述盒体的内部相对应，使卡板可嵌入并固定在盒体内；所述卡板的上表面低于所述盒体开口边缘1.8-2.2cm；以及

所述酶标板上的微孔设置为48或96个，所述酶标板上覆盖有密封膜。

一种酶联免疫试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、胃蛋白酶单克隆抗体的制备，提取人胃粘膜分泌物中的胃蛋白酶，将纯化后的胃蛋白酶免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤融合技术制备得到所述胃蛋白酶单克隆抗体；

步骤二、酶标板的制备，将所得胃蛋白酶单克隆抗体稀释后，加入所述微孔中进行包被，即得所述酶标板；

步骤三、酶标胃蛋白酶抗体的制备，制备辣根过氧化物酶溶液，将胃蛋白酶单克隆抗体与所述辣根过氧化物酶溶液混合反应，然后在得到的反应液中加入NaBH₄溶液后进行超滤，留取超滤截留物即得所述酶标胃蛋白酶抗体。

优选的是，所述的酶联免疫试剂盒的制备方法中，

步骤一中，胃蛋白酶的提取采用离子交换层析和凝胶过滤技术；所述胃蛋白酶单克隆抗体分别通过蛋白质亲和层析技术和凝胶过滤技术进行纯化，然后利用酶联免疫技术筛选得到具有高度特异性的诊断用胃蛋白酶单克隆抗体；

步骤二中，利用所述稀释液对胃蛋白酶单克隆抗体进行稀释，得到单克隆抗体稀释液，然后在3-5℃条件下将单克隆抗体稀释液加入微孔中，放置12-24h后，利用所述洗涤液对微孔进行洗涤，然后加入封闭液，水浴加热后再次洗涤，并依次重复2-4次后拍干，即得所述酶标板，可将酶标板于3-5℃保存；

步骤三中，辣根过氧化物酶溶液的制备方法为：将辣根过氧化物酶溶解于超纯水中制成溶液，将所得溶液于3-5℃条件下静置12-15h后与NaIO₄水溶液混合，在3-5℃条件下避光搅拌，然后在3-5℃条件下进行透析12-15h，调节pH值为7.0-7.2，即得所述辣根过氧化物酶溶液；

此外，可将所得酶标胃蛋白酶抗体与等量甘油混合保持。

一种利用所述的酶联免疫试剂盒进行胃蛋白酶含量检测的方法，包括以下步骤：

步骤一、标准曲线的建立，向酶标板的微孔中分别加入不同浓度的所述氯霉素系列标准溶液，然后分别加入稀释后的酶标抗体，水浴后加入洗涤液，静置，拍干，并依此方法重复洗涤2-5次，然后向微孔中加入发光液，静置，在化学发光检测仪上检测，并得到所述标准曲线；

步骤二、样品的检测，另取一块酶标板，将待检测样品加入微孔中，然后再加入稀释后的酶标抗体，然后按照步骤一中加入稀释后的酶标抗体后方法进行操作，得到待检测样品的检测图，将该检测图与所述标准曲线进行比对计算，即得待检测样品的发光值，并根据发光值计算待检测样品中胃蛋白酶含量。

优选的是，所述的利用酶联免疫试剂盒进行胃蛋白酶含量检测的方法中，可将所述酶联免疫试剂盒用于咽喉反流性疾病的诊断，诊断方法为：

取待检测病人的咽喉或口腔分泌物作为待检测样品，将所述待检测样品按照步骤二中的方法进行检测，根据检测结果判断待检测病人是否患有咽喉反流性疾病，判断方法为：

当待检测样品中含有胃蛋白酶时，判断为待检测病人患有咽喉反流性疾病；

当待检测样品中不含有胃蛋白酶时，判断为待检测病人未患有咽喉反流性疾病。

本发明至少包括以下有益效果：首先，本发明通过在所述试剂盒中设置包被有胃蛋白酶单克隆抗体的酶标板，以及多种装有能够与之发生发光酶联反应的试剂的试剂瓶，其中包括由辣根过氧化物酶标记的胃蛋白酶单克隆抗体，形成双抗体夹心策略，配合化学发光技术，结合不同浓度的标准品，即可实现对待检测样品中胃蛋白酶的定量分析。

其次，本发明通过利用所述试剂盒对待检测病人的口腔或咽喉分泌物进行定量检测，可以方便准确地检测出其中的胃蛋白酶含量，并根据检测结果对病人是否患有咽喉反流性疾病做出准确的诊断，实现咽喉反流性疾病的快速、无创诊断的目的。

最后，本发明通过在盒体内设置带有凹槽及多个竖直孔洞的卡板，能够将酶标板及多个试剂瓶水平固定在盒体内，并通过在孔洞内部设置弹簧，并将试剂瓶底部与弹簧连接，一方面对试剂瓶起到保护作用，另一方面可在试剂使用前向下反复弹压试剂瓶，起到将试剂混匀的效果，提高了实验操作的便利性盒准确性。本发明还通过设置可抽拉的盖体，并在滑动轨道上设置限位块，以及与限位卡相配合的滚珠，可方便及时地对试剂盒进行打开和关闭，并避免盖体从盒体上完全分离。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述的化学发光酶联免疫试剂盒的结构示意图；

图2为本发明所述的酶标板的结构示意图；

图3为本发明所述的试剂瓶嵌入在卡板孔洞内的示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。

如图1-3所示，一种酶联免疫试剂盒，包括：盒体1；酶标板6，其包括多个微孔7，所述微孔7内包被有胃蛋白酶单克隆抗体，所述酶标板6容置在盒体1内；试剂瓶8，其容置于盒体1内，所述试剂瓶8内分别装有工作液、标准溶液、缓冲液、洗涤液及显色液，其中所述工作液含有酶标胃蛋白酶抗体。通过在所述试剂盒中设置包被有胃蛋白酶单克隆抗体的酶标板6，以及多种装有能够与之发生发光酶联反应的试剂的试剂瓶8，其中包括酶标胃蛋白酶单克隆抗体，形成双抗体夹心策略，配合化学发光技术，结合不同浓度的标准品，即可实现对待检测样品中胃蛋白酶的定量分析。

所述的酶联免疫试剂盒中，所述酶标胃蛋白酶抗体的标记物为辣根过氧化物酶，采用过碘酸钠法进行标记。

所述的酶联免疫试剂盒中，所述标准溶液为梯度浓度的氯霉素系列标准溶液，所述标准溶液内氯霉素的浓度分别为0ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml及100ng/ml；所述显色液的化学发光底物为鲁米诺，用三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液配制得到；所述胃蛋白酶为人胃蛋白酶，使其能够特异识别人胃蛋白酶，用于咽喉反流疾病的诊断。

所述的酶联免疫试剂盒中，所述盒体1顶部开口，盒体1的开口处设置有可抽拉的盖体2，能够使试剂盒的开合更加方便。所述盒体1内还设置有带有凹槽4和多个竖直孔洞5的卡板3，卡板3可为塑料或泡沫材质，起到固定的作用。且卡板3可通过卡制或不干胶粘黏固定在盒体1内部。酶标板6，其上设置有多个包被有胃蛋白酶单克隆抗体的微孔7，所述酶标板6水平嵌入在所述卡板3的凹槽4内，从而使酶标板6在盒体1内得到固定。所述试剂瓶8分别嵌入在所述卡板3的孔洞5内，孔洞5的直径比试剂瓶8的直径略大，使试剂瓶8能够在孔洞5内上下活动。试剂瓶8安装所装溶液的不同，包括工作液试剂瓶8、标准溶液试剂瓶8、浓缩缓冲溶液试剂瓶8、浓缩洗涤液试剂瓶8以及显色液试剂瓶8，试剂瓶8按照类别分别固定在卡板3上的孔洞5内，不易造成混淆，造成不必要的错误操作。试剂瓶8可设置在酶标板6的一侧，或环绕在酶标板6的四周。

所述的酶联免疫试剂盒中，所述盖体2为透明设置。所述盖体2与盒体1的连接方式为：所述盒体1开口的两侧设置有第一卡槽，所述盖体2两侧设置有与第一卡槽相匹配的凸条，使盖体2可沿所述第一卡槽滑动，以使盒体1打开或合盖。打开时，将盖体2沿所述第一卡槽向任一边推拉即可，也可根据需要其处于不完全打开状态；反之，反向推拉即可将盒体1封闭。

所述的用于胃蛋白酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒中，所述第一卡槽的两端分别设置有1个限位块，用于防止盖体2与盒体1完全分离。沿所述盖体2两侧凸条的外侧开设有第二卡槽，所述第二卡槽内设置有滚珠，使盖体2沿所述第一卡槽滑动时所述滚珠能够沿所述第二卡槽同向自由滚动，并在滚珠抵达所述限位块位置及第二卡槽端部时停止，以使所述盖体2停止滑动并得到定位，不会脱离盒体1，而且能够使盒体1向两个方向滑动开启，方便试验操作。

所述的用于胃蛋白酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒中，所述盖体2两端分别设置有密封件，所述密封件与所述盖体2的两端为90-180°可弯折连接，使密封件向下弯折90°时可贴附所述盒体1两侧以将盒体1密封；向上弯折时可解除盒体1的密封并使盖体2进行滑动。所述盖体2两侧沿所述第二卡槽设置有密封条，能够增加盖体2的密封性，且密封条的边缘与滚珠的外部齐平，以将凸条与第一卡槽间的缝隙密封。

所述的酶联免疫试剂盒中，所述卡板3的孔洞5深度大于所述试剂瓶8的高度，且所述孔洞5底部设置有弹簧9，所述试剂瓶8底部设置有用于与弹簧9相吸附的磁扣10，以将试剂瓶8与弹簧9活动连接。其中，所述弹簧9的高度以其上放置试剂瓶8后的自然状态下，试剂瓶8顶部高于所述孔洞5开口边缘0.8-1.5cm为准。通过在孔洞5内放置弹簧9，一方面能够在试剂盒受到颠簸或震压的情况下进行一定的缓冲，起到保护作用，另一方面试剂在使用之前往往需要适当摇匀，可通过向下反复弹压试剂瓶8，既能起到将试剂混匀的效果，而不必将试剂瓶8取出，提高了实验操作的便利性盒准确性。

所述卡板3的大小与所述盒体1的内部相对应，使卡板3可嵌入并固定在盒体1内。所述卡板3的上表面低于所述盒体1开口边缘1.8-2.2cm，使试剂瓶8的顶部低于盒体1的开口边缘，在收到压力时能够避免试剂瓶8受力，起到保护作用。所述酶标板6上的微孔7设置为48或96个，所述酶标板6为可拆卸酶标板6，其上覆盖有密封膜，起到密封的作用。

一种酶联免疫试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、胃蛋白酶单克隆抗体的制备，提取人胃粘膜分泌物中的胃蛋白酶，将纯化后的胃蛋白酶免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤融合技术制备得到所述胃蛋白酶单克隆抗体；

步骤二、酶标板6的制备，将所得胃蛋白酶单克隆抗体稀释后，加入所述微孔7中进行包被，即得所述酶标板6；

步骤三、酶标胃蛋白酶抗体的制备，制备辣根过氧化物酶溶液，将胃蛋白酶单克隆抗体与所述辣根过氧化物酶溶液混合反应，然后在得到的反应液中加入NaBH₄溶液后进行超滤，留取超滤截留物即得所述酶标胃蛋白酶抗体。

所述的酶联免疫试剂盒的制备方法中，

步骤一中，胃蛋白酶的提取采用离子交换层析和凝胶过滤技术；所述胃蛋白酶单克隆抗体分别通过蛋白质亲和层析技术和凝胶过滤技术进行纯化，然后利用酶联免疫技术筛选得到具有高度特异性的诊断用胃蛋白酶单克隆抗体；

步骤二中，利用所述稀释液对胃蛋白酶单克隆抗体进行稀释，得到单克隆抗体稀释液，然后在3-5℃条件下将单克隆抗体稀释液加入微孔7中，放置12-24h后，利用所述洗涤液对微孔7进行洗涤，然后加入封闭液，水浴加热后再次洗涤，并依次重复2-4次后拍干，即得所述酶标板6，可将酶标板6于3-5℃保存；

步骤三中，辣根过氧化物酶溶液的制备方法为：将辣根过氧化物酶溶解于超纯水中制成溶液，将所得溶液于3-5℃条件下静置12-15h后与NaIO₄水溶液混合，在3-5℃条件下避光搅拌，然后在3-5℃条件下进行透析12-15h，调节pH值为7.0-7.2，即得所述辣根过氧化物酶溶液；

此外，可将所得酶标胃蛋白酶抗体与等量甘油混合保持。

一种利用酶联免疫试剂盒进行胃蛋白酶含量检测的方法，包括以下步骤：

步骤一、标准曲线的建立，向酶标板6的微孔7中分别加入不同浓度的所述氯霉素系列标准溶液，然后分别加入稀释后的酶标抗体，水浴后加入洗涤液，静置，拍干，并依此方法重复洗涤2-5次，然后向微孔7中加入发光液，静置，在化学发光检测仪上检测，并得到所述标准曲线；

步骤二、样品的检测，另取一块酶标板6，将待检测样品加入微孔7中，然后再加入稀释后的酶标抗体，然后按照步骤一中加入稀释后的酶标抗体后方法进行操作，得到待检测样品的检测图，将该检测图与所述标准曲线进行比对计算，即得待检测样品的发光值，并根据发光值计算待检测样品中胃蛋白酶含量。

所述的利用酶联免疫试剂盒进行胃蛋白酶含量检测的方法中，可将所述酶联免疫试剂盒用于咽喉反流性疾病的诊断，诊断方法为：取待检测病人的咽喉或口腔分泌物作为待检测样品，将所述待检测样品按照步骤二中的方法进行检测，根据检测结果判断待检测病人是否患有咽喉反流性疾病，判断方法为：当待检测样品中含有胃蛋白酶时，判断为待检测病人患有咽喉反流性疾病；当待检测样品中不含有胃蛋白酶时，判断为待检测病人未患有咽喉反流性疾病。

实施例1

制备过程：

步骤一、胃蛋白酶单克隆抗体的制备。采用离子交换层析和凝胶过滤技术分离纯化人胃液中的胃蛋白酶，将纯化的胃蛋白酶免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤融合技术制备针对人胃蛋白酶的单克隆抗体，通过蛋白质亲和层析技术和凝胶过滤技术纯化单克隆抗体；利用酶联免疫技术筛选具有高度特异性的诊断用单克隆抗体。

步骤二、试剂盒中酶标抗体的制备。称取辣根过氧化物酶溶解于超纯水中，配制成溶液，3℃静置过夜，使之充分溶解；次日取上述溶液，并向其中加入新配NaIO₄水溶液，混匀后放置冰箱避光搅拌。取出反应液装入透析袋中，3℃条件下，对反应液透析过夜。次日将透析后的混合物取出，调节混合物pH值为7.1；立即将胃蛋白酶单克隆抗体加入，室温避光搅拌，搅拌时间7min。反应结束后取混合液中加入NaBH₄溶液；然后将混合液超滤加等量甘油保存。

步骤三、酶标板6的制作。将胃蛋白酶单克隆抗体用稀释液稀释至终浓度为1.2mg/ml后，在微孔7中每孔加入稀释液置于3℃包被，次日将包被胃蛋白酶单克隆抗体的酶标板6取出洗涤后每孔加封闭液，37℃水浴20min后再洗涤，重复4次，拍干，密封在3℃下保存。

检测过程：

步骤一、标准曲线建立：向酶标板6中每孔先加入试剂盒所提供6个系列的胃蛋白酶标准溶液，再加入稀释后的酶标抗体，37℃水浴20min后，加入洗涤液，静置，拍干，重复用洗涤液洗涤，然后每孔加入发光液，适当时间后在化学发光检测仪上检测。

步骤二、样品的检测：向酶标板6中每孔先加入处理好的样品，再加入稀释后的酶标抗体，37℃水浴20min后，重复用洗涤液洗涤，每孔加入发光液，适当时间后在化学发光检测仪上检测。以加入待测样品的发光值从标准曲线上计算待测样品中胃蛋白酶的含量。

实施例2

制备过程：

步骤一、胃蛋白酶单克隆抗体的制备。采用离子交换层析和凝胶过滤技术分离纯化人胃液中的胃蛋白酶，将纯化的胃蛋白酶免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤融合技术制备针对人胃蛋白酶的单克隆抗体，通过蛋白质亲和层析技术和凝胶过滤技术纯化单克隆抗体；利用酶联免疫技术筛选具有高度特异性的诊断用单克隆抗体。

步骤二、试剂盒中酶标抗体的制备。称取辣根过氧化物酶溶解于超纯水中，配制成溶液，4℃静置过夜，使之充分溶解；次日取上述溶液，并向其中加入新配NaIO₄水溶液，混匀后放置冰箱避光搅拌。取出反应液装入透析袋中，4℃条件下，对反应液透析过夜。次日将透析后的混合物取出，调节混合物pH值为7.0；立即将胃蛋白酶单克隆抗体加入，室温避光搅拌，搅拌时间5min。反应结束后取混合液中加入NaBH₄溶液；然后将混合液超滤加等量甘油保存。

步骤三、酶标板6的制作。将胃蛋白酶单克隆抗体用稀释液稀释至终浓度为1mg/ml后，在微孔7中每孔加入稀释液置于4℃包被，次日将包被胃蛋白酶单克隆抗体的酶标板6取出洗涤后每孔加封闭液，35℃水浴30min后再洗涤，重复3次，拍干，密封在4℃下保存。

检测过程：

步骤一、标准曲线建立：向酶标板6中每孔先加入试剂盒所提供6个系列的胃蛋白酶标准溶液，再加入稀释后的酶标抗体，35℃水浴30min后，加入洗涤液，静置，拍干，重复用洗涤液洗涤，然后每孔加入发光液，适当时间后在化学发光检测仪上检测。

步骤二、样品的检测：向酶标板6中每孔先加入处理好的样品，再加入稀释后的酶标抗体，35℃水浴30min后，重复用洗涤液洗涤，每孔加入发光液，适当时间后在化学发光检测仪上检测。以加入待测样品的发光值从标准曲线上计算待测样品中胃蛋白酶的含量。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括：

盒体；

酶标板，其包括多个微孔，所述微孔内包被有胃蛋白酶单克隆抗体，所述酶标板容置在盒体内；

试剂瓶，其容置于盒体内，所述试剂瓶内分别装有工作液、标准溶液、缓冲液、洗涤液及显色液，其中所述工作液含有酶标胃蛋白酶抗体。

2.如权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶标胃蛋白酶抗体的标记物为辣根过氧化物酶，采用过碘酸钠法进行标记。

3.如权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述标准溶液为梯度浓度的氯霉素系列标准溶液，所述标准溶液内氯霉素的浓度分别为0ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml及100ng/ml；

所述显色液的化学发光底物为鲁米诺；以及

所述胃蛋白酶为人胃蛋白酶。

4.如权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述盒体顶部开口，盒体的开口处设置有可抽拉的盖体；

所述盒体内还设置有带有凹槽和多个竖直孔洞的卡板；

所述酶标板水平嵌入在所述卡板的凹槽内，所述试剂瓶分别嵌入在所述卡板的孔洞内。

5.如权利要求4所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，

所述盖体为透明设置；

所述盖体与盒体的连接方式为：所述盒体开口的两侧设置有第一卡槽，所述盖体两侧设置有与第一卡槽相匹配的凸条，使盖体可沿所述第一卡槽滑动，以使盒体打开或合盖；

其中，所述第一卡槽的两端分别设置有1个限位块；沿所述盖体两侧凸条的外侧开设有第二卡槽，所述第二卡槽内设置有滚珠，使盖体沿所述第一卡槽滑动时所述滚珠能够沿所述第二卡槽同向自由滚动，并在滚珠抵达所述限位块位置及第二卡槽端部时停止，以使所述盖体停止滑动并得到定位；

此外，所述盖体两端分别设置有密封件，所述密封件与所述盖体的两端为90-180°可弯折连接，使密封件向下弯折90°时可贴附所述盒体两侧以将盒体密封；向上弯折时可解除盒体的密封并使盖体进行滑动；

所述盖体两侧沿所述第二卡槽设置有密封条。

6.如权利要求4所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述卡板的孔洞深度大于所述试剂瓶的高度，且所述孔洞底部设置有弹簧，所述试剂瓶底部设置有用于与弹簧相吸附的磁扣，以将试剂瓶与弹簧活动连接；

其中，所述弹簧的高度以其上放置试剂瓶后的自然状态下，试剂瓶顶部高于所述孔洞开口边缘0.8-1.5cm为准；

此外，所述卡板的大小与所述盒体的内部相对应，使卡板可嵌入并固定在盒体内；所述卡板的上表面低于所述盒体开口边缘1.8-2.2cm；以及

所述酶标板上的微孔设置为48或96个，所述酶标板上覆盖有密封膜。

7.一种如权利要求3所述的酶联免疫试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、胃蛋白酶单克隆抗体的制备，提取人胃粘膜分泌物中的胃蛋白酶，将纯化后的胃蛋白酶免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤融合技术制备得到所述胃蛋白酶单克隆抗体；

步骤二、酶标板的制备，将所得胃蛋白酶单克隆抗体稀释后，加入所述微孔中进行包被，即得所述酶标板；

步骤三、酶标胃蛋白酶抗体的制备，制备辣根过氧化物酶溶液，将胃蛋白酶单克隆抗体与所述辣根过氧化物酶溶液混合反应，然后在得到的反应液中加入NaBH₄溶液后进行超滤，留取超滤截留物即得所述酶标胃蛋白酶抗体。

8.如权利要求7所述的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于，

步骤一中，胃蛋白酶的提取采用离子交换层析和凝胶过滤技术；所述胃蛋白酶单克隆抗体分别通过蛋白质亲和层析技术和凝胶过滤技术进行纯化，然后利用酶联免疫技术筛选得到具有高度特异性的诊断用胃蛋白酶单克隆抗体；

步骤二中，利用所述稀释液对胃蛋白酶单克隆抗体进行稀释，得到单克隆抗体稀释液，然后在3-5℃条件下将单克隆抗体稀释液加入微孔中，放置12-24h后，利用所述洗涤液对微孔进行洗涤，然后加入封闭液，水浴加热后再次洗涤，并依次重复2-4次后拍干，即得所述酶标板，可将酶标板于3-5℃保存；

步骤三中，辣根过氧化物酶溶液的制备方法为：将辣根过氧化物酶溶解于超纯水中制成溶液，将所得溶液于3-5℃条件下静置12-15h后与NaIO₄水溶液混合，在3-5℃条件下避光搅拌，然后在3-5℃条件下进行透析12-15h，调节pH值为7.0-7.2，即得所述辣根过氧化物酶溶液；

此外，可将所得酶标胃蛋白酶抗体与等量甘油混合保持。

9.一种利用如权利要求3所述的酶联免疫试剂盒进行胃蛋白酶含量检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、标准曲线的建立，向酶标板的微孔中分别加入不同浓度的所述氯霉素系列标准溶液，然后分别加入稀释后的酶标抗体，水浴后加入洗涤液，静置，拍干，并依此方法重复洗涤2-5次，然后向微孔中加入发光液，静置，在化学发光检测仪上检测，并得到所述标准曲线；

步骤二、样品的检测，另取一块酶标板，将待检测样品加入微孔中，然后再加入稀释后的酶标抗体，然后按照步骤一中加入稀释后的酶标抗体后方法进行操作，得到待检测样品的检测图，将该检测图与所述标准曲线进行比对计算，即得待检测样品的发光值，并根据发光值计算待检测样品中胃蛋白酶含量。

10.如权利要求9所述的利用酶联免疫试剂盒进行胃蛋白酶含量检测的方法，其特征在于，可将所述酶联免疫试剂盒用于咽喉反流性疾病的诊断，诊断方法为：

取待检测病人的咽喉或口腔分泌物作为待检测样品，将所述待检测样品按照步骤二中的方法进行检测，根据检测结果判断待检测病人是否患有咽喉反流性疾病，判断方法为：

当待检测样品中含有胃蛋白酶时，判断为待检测病人患有咽喉反流性疾病；

当待检测样品中不含有胃蛋白酶时，判断为待检测病人未患有咽喉反流性疾病。