CN110045130A - 一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组分：包被有Pep16特异性抗体的酶标板、Pep16蛋白标准品、酶标记鼠抗Pep16单抗、10×洗涤液、显色剂和反应终止液。本发明的试剂盒检测稳定、快速、敏感、准确，特异性强，灵敏度高，可以定量检测出与IgA肾病相关的多肽Pep16的含量。

Description

一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒。
背景技术
IgA肾病是以肾穿刺免疫荧光检查肾小球系膜区有大量颗粒状IgA沉积为特征的原发性肾小球疾病，是儿童慢性肾脏病的常见原因，有报道20%～30%的病例在15年～30年后发展为终末期肾脏病，需要耗费大量的医疗资源进行透析或肾移植以维系生命，给患儿家庭和社会带来了巨大的经济压力和沉重的心理负担。
Ig A 肾病临床表现千变万化，肾脏的病理活检成为其确诊的“金标准”。但是众所周知，肾活检是一项有创性的操作，并且具有绝对及相对禁忌症，术后亦可能出现穿刺部位出血、血肿、感染等并发症；此外，肾活检不利于反复穿刺，不利于对疾病治疗效果的动态监测，因此，寻找一种无创、稳定、可靠的实验室检测指标是IgA肾病诊断研究领域的重要方向。
我们前期采用LC-MS/MS技术鉴定一种多肽（序列为：EETKENEGFTVTAEGK）在儿童IgA肾病患者组与健康对照组差异显著，结果表明该多肽可做为IgA肾病诊断标志物。本发明利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测该多肽在IgA肾病的含量，为IgA肾病早期诊断提供无创、快速、高效、敏感的检测方法。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒，该试剂盒检测稳定、快速、敏感、准确，特异性强，灵敏度高，可以定量检测出与IgA肾病相关的多肽Pep16的含量。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组分：包被有Pep16特异性抗体的酶标板、Pep16蛋白标准品、酶标记鼠抗Pep16单抗、10×洗涤液、显色剂和反应终止液。
优选的，所述Pep16特异性抗体是指识别Pep16至少一个抗原表位的多克隆抗体。
另一优选的，所述Pep16特异性抗体是指识别Pep16至少一个抗原表位的单克隆抗体。
优选的，所述酶标记鼠抗Pep16单抗是指辣根过氧化物酶标记的鼠抗Pep16单克隆抗体。
优选的，当包被的抗体是单克隆抗体时，其抗原表位与酶标记单克隆抗体的抗原表位不同。
优选的，所述Pep16蛋白标准品为人工合成的序列为EETKENEGFTVTAEGK的多肽。
优选的，所述10×洗涤液是含有Tween20的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中Tween20的体积分数为0.5%，磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.5mol/L，pH值为7.4。
优选的，所述显色剂为过氧化氢/TMB显色液，由显色液A和显色液B组成。
优选的，所述显色液A和显色液B的体积比为1：1。
优选的，所述终止液是摩尔浓度为2mol/L的硫酸溶液。
本发明的有益效果在于：本发明的单克隆抗体针对IgA肾病多肽标志物抗原的特异性强，灵敏度高，且操作步骤简便快捷，利于临床检测。
本发明的试剂盒检测稳定、快速、敏感、准确，特异性强，灵敏度高，可以定量检测出与IgA肾病相关的多肽Pep16的含量。
附图说明
图1为多肽标志物抗原标准品绘制的标准曲线。
图2为本发明试剂盒检测病例血清中多肽标志物抗原的结果。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1-2对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1 检测试剂盒的制备
所述检测试剂盒优选为酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒。
A、预先包被多肽标志物抗原的特异性抗体的酶标板制备：
A1、多肽标志物抗原多克隆抗体的制备：
将人工合成的多肽标志物抗原（序列为EETKENEGFTVTAEGK）与载体蛋白匙孔血蓝蛋白（KLH）偶联，然后将偶联物作为免疫原，免疫家兔。采集免疫后的兔抗血清并测定效价。
A2、预包被抗体的酶标板制备：
将制备的多肽标志物抗原的多克隆抗体用包被缓冲液分别稀释到10ng/μL升，然后以100μL/孔的量包被于96孔酶标板中，4℃过夜后洗板3次。每孔加入200μL含有1％（体积分数）牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育1h后洗板3次，晾干，用密封袋封装酶标板，4℃保存备用。
B、酶标记鼠抗多肽标志物抗原的制备：
B1、单克隆抗体制备：
将人工合成的多肽标志物抗原与载体蛋白匙孔血蓝蛋白（KLH）偶联，然后将偶联物作为免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后筛选出杂交瘤细胞株。培养杂交瘤细胞，并用G蛋白纯化柱纯化其培养上清，获得高纯度的多肽标志物抗原单克隆抗体。
B2、辣根过氧化物酶（HRP）标记：
将纯化好的多肽标志物抗原单克隆抗体采用过碘酸钠法进行HRP标记，具体方法如下：
1）取5mg HRP溶于1mL蒸馏水中，加入0.2mL新配制的摩尔浓度为0.1mol/L的高碘酸钠（NaIO4）水溶液（称取24.1mg NaIO4溶于1mL蒸馏水中），室温下避光搅拌20min，加入摩尔浓度为0.16mol/L的乙二醇水溶液（0.09mL乙二醇溶于10mL蒸馏水）0.5mL，混匀，静置30min。
2）将上述溶液装入透析袋中，对摩尔浓度为1mol/L、pH为4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
3）加入20μL摩尔浓度为0.2mol/L、pH为9.5的碳酸缓冲液，使以上醛基化的HRP的pH升高到9.0-9.5，然后立即加入2mg多肽标志物抗原单克隆抗体在1mL摩尔浓度为0.01mol/L的碳酸缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2h。
4）加入0.1mL新配的NaBH4溶液（质量浓度为5mg/mL），混匀，置4℃，2h；
5）将上述液转入透析袋中，对摩尔浓度为0.15mol/L、pH为7.4的磷酸缓冲液透析，4℃过夜。
6）效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。
C、其他试剂的制备：
多肽标志物抗原标准品：人工合成的多肽蛋白，质量浓度为25μg/mL，使用时用磷酸盐缓冲液进行梯度稀释。
包被缓冲液（摩尔浓度为0.1mol/L、pH为9.6的碳酸盐缓冲液）：1000mL蒸馏水中加入3.18g碳酸钠（Na2CO3）和5.86g碳酸氢钠（NaHCO3），溶解混匀。
磷酸盐缓冲液（摩尔浓度为0.05mol/L，pH为7.4）：1000mL蒸馏水中加入40g氯化钠（NaCl），1.0g磷酸二氢钾（KH2PO4），14.5g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）和1.0g氯化钾（KCl），溶解混匀。
10×洗涤液：1000mL蒸馏水中加入400g氯化钠（NaCl），10g磷酸二氢钾（KH2PO4），145g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）和10g氯化钾（KCl），溶解混匀，然后加入5mLTween20，混匀。
显色液A：摩尔浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液（21g/1000mL）122mL，摩尔浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液（71.63g Na2HPO4•12H2O/1000mL）128mL，蒸馏水250mL，四甲基联苯胺（TMB）2mg。
显色液B：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，质量分数为30％的双氧水0.3mL，加蒸馏水至500mL。
终止液：摩尔浓度为2mol/L的硫酸溶液。
实施例2 多肽标志物抗原的ELISA检测方法
样本：取IgA肾病患者血清和健康人血清。
标准曲线制作：
1、将包被有多肽标志物抗原的特异性抗体的酶标板的酶标板取出，室温平衡30min。
2、将多肽标志物抗原利用磷酸盐缓冲液稀释成质量浓度分别为250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.6ng/mL，7.8ng/mL和0ng/mL按100μL/孔分别加入96孔板中，37℃温育1h。
3、清洗：轻轻倒尽孔中液体，按200μL/孔加入1×洗涤液，洗涤3次，每次间隔3min。
4、杂交：按100μL/孔加入加入工作浓度的HRP标记的酶标记鼠抗多肽标志物抗原的单克隆抗体（按1：5000稀释），37℃温育1h。
5、清洗：轻轻倒尽孔中液体，按200μL/孔加入1×洗涤液，洗涤3次，每次间隔5min。
6、显色：按100μL/孔加入显色剂（显色液A和显色液A按体积比1：1混合），37℃避光温育10min。
7、终止反应和读数：按100μL/孔加入终止液，并在5min内在酶联检测仪上读取OD450nm值。
本发明的检测试剂盒的检测原理为：将抗Pep16的特异性抗体包被在酶标板上，加入待检测样品或Pep16标准品，样品或标准品中的Pep16蛋白就跟固相载体上的抗Pep16特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物，用洗涤液去除无关的成分，然后加入酶标记的鼠抗Pep16单克隆抗体，酶标抗体与酶标板上的抗原-抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，通过洗涤出去未结合的酶标记物，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与标准品中含Pep16蛋白的量呈正相关，用不同浓度梯度的标准品溶液制作标准曲线，即可计算出样品中Pep16的含量。
临床样本检测：
取IgA肾病患者血清和健康人血清100μL，分别加入到包被有多肽标志物抗原的特异性抗体的酶标板孔中，然后按照上述标准品检测方法进行操作，最后将测得的OD450 nm值根据标准曲线（如图1所示）计算出样本中多肽的含量。图2为本发明试剂盒检测病例血清中多肽标志物抗原的结果，可以看出，本发明的试剂盒检测稳定、快速、敏感、准确，特异性强，灵敏度高，可以定量检测出与IgA肾病相关的多肽Pep16的含量。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如下组分：包被有Pep16特异性抗体的酶标板、Pep16蛋白标准品、酶标记鼠抗Pep16单抗、10×洗涤液、显色剂和反应终止液。
2.根据权利要求1所述的一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒，其特征在于：所述Pep16特异性抗体是指识别Pep16至少一个抗原表位的多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒，其特征在于：所述Pep16特异性抗体是指识别Pep16至少一个抗原表位的单克隆抗体。
4.根据权利要求2或3所述的一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒，其特征在于：所述酶标记鼠抗Pep16单抗是指辣根过氧化物酶标记的鼠抗Pep16单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒，其特征在于：当包被的抗体是单克隆抗体时，其抗原表位与酶标记单克隆抗体的抗原表位不同。
6.根据权利要求1所述的一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒，其特征在于：所述Pep16蛋白标准品为人工合成的序列为EETKENEGFTVTAEGK的多肽。
7.根据权利要求1所述的一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒，其特征在于：所述10×洗涤液是含有Tween20的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中Tween20的体积分数为0.5%，磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.5mol/L，pH值为7.4。
8.根据权利要求1所述的一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒，其特征在于：所述显色剂为过氧化氢/TMB显色液，由显色液A和显色液B组成。
9.根据权利要求8所述的一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒，其特征在于：所述显色液A和显色液B的体积比为1：1。
10.根据权利要求1所述的一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒，其特征在于：所述终止液是摩尔浓度为2mol/L的硫酸溶液。
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