CN105044362A - 柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置及制法 - Google Patents

柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置及制法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置及制法，属于医疗检测设备领域。粘贴在塑料板上的硝酸纤维素膜分别与吸收垫、免疫胶体金玻璃纤维膜搭接，免疫胶体金玻璃纤维膜另一端与样品垫搭接；硝酸纤维素膜上设置固相有纯化的高特异CA16抗原的第一检测线、固相有纯化的高特异性EV71的第二检测线、喷点羊抗鼠IgM多克隆抗体的质控线上。优点在于：结构简单，构思新颖，特异性强，既能同时检测标本中的CA16和EV71的IgM抗体，又没有增加生产操作的复杂度。可保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本；灵敏度高、特异性强、操作简便省时、实用性强。

Description

柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置及制法
技术领域
本发明涉及医疗检测设备领域，特别涉及一种柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置及制法，可实现柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71)IgM抗体的灵敏、特异、快速检测。
背景技术
手足口病（HFMD）是一种以手足皮肤和口腔黏膜疱疹为主要症状的小儿急性传染病。本病在国外1957年已有报道，1981年中国上海首次报告了手足口病疫情。近年来，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势，引发HFMD的肠道病毒有20多种（型），其中柯萨奇病毒A16型（CA16）和肠道病毒71型（EV71）最为常见。通常情况下，CA16感染引起的HFMD在临床症状等方面与EV71感染所引起的HFMD难以区别。不同的是CA16感染所致的患者可引发心肌炎、心包炎等并发症，而EV71感染容易引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎及由此引发急性弛缓性瘫痪、肺水肿和出血等严重并发症，死亡率较高。由于患者为婴幼儿，病情发展快，所以更需要早期、及时诊断疾病。疾病的早期和及时诊断，可以准确鉴别两种病毒，并对疾病的诊疗和预后判断有重要的临床意义，因此建立HFMD快速分型检测方法尤为重要。
手足口病的临床诊断主要依据三个方面：一是临床表现，二是血清学证据，三是病原学证据，其中血清学检测和病原学检测是目前最主要的依据。病原学检测方法中，病毒分离是最早用于CA16和EV71病毒的检测诊断的方法，这种方法具有较高的特异性，但由于技术操作难度大、周期长，不适合临床使用。RT-PCR技术用于检测病毒RNA，具有快速、简便的优点，而且还有很高的灵敏度和特异性。但其灵敏度一方面依赖于患者携带的病毒与所用引物的匹配性，另一方面也受到扩增片断的高级结构的很大影响。另外，RT-PCR本身对于操作环境及操作人员的要求较高，并且价格昂贵，因此难以在广大基层单位中使用。目前市场上仅少数单位具备RT-PCR能力，且难以找到通用引物，目前所用引物具基因型特异性。HFMD血清学检测可采用酶联免疫吸附实验，检测CA16和EV71病毒IgM临床意义较大，主要用于对早期感染的诊断，可作为临床检测和的初筛指标。CA16和EV71病毒IgM抗体联合检测对初步鉴别诊断早期患者有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置及制法，解决了现有技术存在的上述问题。本发明由固相有纯化的高特异性柯萨奇病毒A16型(CA16)抗原、肠道病毒71型(EV71)抗原(检测线T1、T2)和羊抗鼠IgG多克隆抗体(对照线)的硝酸纤维素膜、吸附有胶体金标记鼠抗人IgM的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成。可实现柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71)IgM抗体的灵敏、特异、快速检测，适应于基层医院对大量手足口病患者标本的早期筛查。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置，样品垫1、免疫胶体金玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5上，所述硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫胶体金玻璃纤维膜2搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述硝酸纤维素膜3上设置第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C；所述的第一检测线T1上固相有纯化的高特异柯萨奇病毒A16型抗原；所述的第二检测线T2上固相有纯化的高特异性肠道病毒71型抗原；所述的质控线C上喷点羊抗鼠IgM多克隆抗体。
所述的第一检测线T1距离硝酸纤维素膜3的边缘3~15mm。
所述的第二检测线T2距离硝酸纤维素膜3的边缘5~17mm。
所述的质控线C距离硝酸纤维素膜3的边缘10~18mm。
本发明的另一目的在于提供一种柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置的制备方法，包括如下步骤：
（a）采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
（b）采用步骤（a）中制得的胶体金标记鼠抗人IgM抗体获得免疫胶体金；
（c）采用喷金缓冲液稀释步骤（b）的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金玻璃纤维膜；
（d）在硝酸纤维膜的第一检测线、第二检测线上分别喷点柯萨奇病毒A16型抗原和肠道病毒71型抗原，在质控线上喷点羊抗鼠IgM，制得免疫硝酸纤维素膜；
（e）将预处理的样品垫、步骤（c）制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤（d）制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在塑料板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
步骤（a）所述的采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒粒径为20~60nm。
步骤（c）所述的喷金缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5~20%，海藻糖浓度为1~5%，BSA浓度为0.5~1%。
步骤（d）所述的在硝酸纤维膜的第一检测线、第二检测线分别喷点柯萨奇病毒A16型抗原和肠道病毒71型抗原，其中柯萨奇病毒A16型抗原在前，肠道病毒71型抗原在后，柯萨奇病毒A16型检测线距离硝酸纤维素膜的上缘3~15mm，肠道病毒71型检测线距硝酸纤维素膜上缘距离5~17mm；质控线上喷点羊抗鼠IgM距硝酸纤维素膜上缘10~18mm。
步骤（e）所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液处理，所述样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂S17组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5~1%，酪蛋白浓度为0.1~0.2%，表面活性剂S17浓度为0.5~1%。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的检测装置结构简单，构思新颖，将柯萨奇病毒A16型(CA16)抗原和肠道病毒71型(EV71)抗原包被于硝酸纤维膜膜上，特异性强，既能同时检测标本中柯萨奇病毒A16型(CA16)抗原和肠道病毒71型(EV71)IgM抗体，又没有增加生产操作的复杂度。
2、免疫胶体金制备步骤中，通过配合合适的喷金缓冲液和样品垫处理液，可保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。
3、本发明的检测装置不需要任何特殊仪器设备，检测成本低。
4、本发明的检测装置不需要专业人员操作，操作简便省时，灵敏度高、特异性强。实用性强。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明的结构示意图。
图中：1、样品垫；2、免疫胶体金玻璃纤维膜；3、硝酸纤维素膜；4、吸收垫；5、塑料板；T1、第一检测线；T2、第二检测线；C、质控线。
具体实施方式
下面结合附图进一步说明本发明的详细内容及其具体实施方式。
参见图1所示，本发明的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置，其结构包括样品垫1、免疫胶体金玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸收垫4、塑料板5，其中，所述样品垫1、免疫胶体金玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫胶体金玻璃纤维膜2搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述硝酸纤维素膜3上设置第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C；所述的第一检测线T1上固相有纯化的高特异性柯萨奇病毒A16型(CA16)抗原；所述的第二检测线T2上固相有纯化的高特异性肠道病毒71型(EV71)抗原；所述的质控线C上喷点羊抗鼠IgM多克隆抗体。
所述的第一检测线T1距离硝酸纤维素膜3的边缘3~15mm。
所述的第二检测线T2距离硝酸纤维素膜3的边缘5~17mm。
所述的质控线C距离硝酸纤维素膜3的边缘10~18mm。
本发明的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置的制备方法，包括固相有纯化的高特异性柯萨奇病毒A16型(CA16)抗原和肠道病毒71型(EV71)抗原(检测线T1、T2)和羊抗鼠IgM多克隆抗体(对照线)的硝酸纤维素膜、吸附有胶体金标记鼠抗人IgM的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料因此粘贴制成。具体步骤如下：
（a）采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
（b）采用步骤（a）中制得的胶体金标记鼠抗人IgM获得免疫胶体金；
（c）采用喷金缓冲液稀释步骤（b）的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金玻璃纤维膜；
（d）在硝酸纤维膜的检测线喷点柯萨奇病毒A16型(CA16)抗原和肠道病毒71型(EV71)抗原，在质控线上喷点羊抗鼠IgM，制得免疫硝酸纤维素膜；
（e）将预处理的样品垫、步骤（c）制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤（d）制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在塑料板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
步骤（a）所述的采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒粒径为20~60nm。
步骤（c）所述的喷金缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白（BSA）组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5~20%，海藻糖浓度为1~5%，BSA浓度为0.5~1%。
步骤（d）所述的在硝酸纤维膜的检测线喷点柯萨奇病毒A16型(CA16)抗原和肠道病毒71型(EV71)抗原，其中柯萨奇病毒A16型(CA16)抗原在前，肠道病毒71型(EV71)抗原在后，柯萨奇病毒A16型(CA16)检测线距硝酸纤维素膜上缘距离3~15mm，肠道病毒71型(EV71)检测线距硝酸纤维素膜上缘距离5~17mm；质控线上喷点羊抗鼠IgM距硝酸纤维素膜上缘10~18mm。
步骤（e）所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂S17组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5~1%，酪蛋白浓度为0.1~0.2%、表面活性剂S17浓度为0.5~1%。
实施例：
柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71)IgM抗体联合检测装置
1、胶体金溶液制备
在加热的100ml纯化水中快速加入氯化金，待溶液再次沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠，氯化金：柠檬酸三钠1：（0.5-2），继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续加热10分钟即可。胶体金颗粒为20-60nm，本实施例选取30nm胶体金进行下一步实验。
2、免疫胶体金制备
1)分别取100毫升30nm胶体金溶液，加入pH调节剂140μl，混匀；静置5min；
2)在30nm胶体金溶液中，按照每毫升胶体金溶液14μg的比例加入鼠抗人IgM，共1.4mg，混匀；静置5min；
3)分别按照0.4%的比例加入胶体金稳定剂0.4毫升，混匀，静置5分钟；
4)10000、12000、14000rpm离心10min，分别收集沉淀，合并三次收集的沉淀。
3、采用优化在喷金缓冲液（浓度为0.02mol/L的Tris-HCL液、浓度为5-20%的蔗糖、浓度为1-5%的海藻糖、浓度为1%的BSA，PH为8.5）稀释免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体玻璃纤维膜。
4、固相硝酸纤维素膜
4.1对照线喷液量的选择
将纯化好的羊抗鼠IgM多克隆抗体稀释到浓度为1mg/ml，用自动喷膜机喷涂质控线，喷膜量分别为1.6μl/cm、1.4μl/cm、1.2μl/cm，比较用不同喷膜量所得的划线效果。结果表明1.4μl/cm喷膜量时所划线边缘整齐，线条精细。
4.2硝酸纤维素膜检测线与对照线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71)抗原稀释至1.5mg/ml，对照线羊抗鼠IgM抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与对照线。室温干燥过夜。储存备用。在硝酸纤维膜的检测线喷点柯萨奇病毒A16型(CA16)抗原和肠道病毒71型(EV71)抗原，其中柯萨奇病毒A16型(CA16)抗原在前，肠道病毒71型(EV71)抗原在后，柯萨奇病毒A16型(CA16)检测线距硝酸纤维素膜上缘距离3~15mm，肠道病毒71型(EV71)检测线距硝酸纤维素膜上缘距离5~17mm；质控线上喷点羊抗鼠IgM距硝酸纤维素膜上缘10~18mm。其中本检测装置选择最佳距离CA16检测线距硝酸纤维素膜上缘距离6mm，EV71检测线距硝酸纤维素膜上缘距离11mm，羊抗鼠IgM距硝酸纤维素膜上缘16mm。
4.3样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液（浓度为0.1mol/L的Tris-HCL液、浓度为0.5-1%的牛血清白蛋白BSA、浓度为0.1-0.2%的酪蛋白、浓度为0.5-1%的表面活性剂S17）浸泡10min，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度。
5、检测装置的组装
参见图1所示，样品垫1、免疫胶体金玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫胶体金玻璃纤维膜2搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述硝酸纤维素膜3上设置第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C；所述的第一检测线T1上固相有纯化的高特异性柯萨奇病毒A16型(CA16)抗原；所述的第二检测线T2上固相有纯化的高特异性肠道病毒71型(EV71)抗原；所述的质控线C上喷点羊抗鼠IgM多克隆抗体。切成4mm宽小条，装于塑料壳中，用铝箔袋密封保存。常温保存，有效期18个月。
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置，其特征在于：样品垫（1）、免疫胶体金玻璃纤维膜（2）、硝酸纤维素膜（3）、吸收垫（4）分别粘贴在塑料板（5）上，所述硝酸纤维素膜（3）的两端分别与吸收垫（4）、免疫胶体金玻璃纤维膜（2）搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜（2）的另一端与样品垫（1）搭接；所述硝酸纤维素膜（3）上设置第一检测线（T1）、第二检测线（T2）和质控线（C）；所述的第一检测线（T1）上固相有纯化的高特异柯萨奇病毒A16型抗原；所述的第二检测线（T2）上固相有纯化的高特异性肠道病毒71型抗原；所述的质控线（C）上喷点羊抗鼠IgM多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置，其特征在于：所述的第一检测线（T1）距离硝酸纤维素膜（3）的边缘3~15mm。
3.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置，其特征在于：所述的第二检测线（T2）距离硝酸纤维素膜（3）的边缘5~17mm。
4.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置，其特征在于：所述的质控线（C）距离硝酸纤维素膜（3）的边缘10~18mm。
5.一种柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（a）采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
（b）采用步骤（a）中制得的胶体金标记鼠抗人IgM抗体获得免疫胶体金；
（c）采用喷金缓冲液稀释步骤（b）的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金玻璃纤维膜；
（d）在硝酸纤维膜的第一检测线、第二检测线上分别喷点柯萨奇病毒A16型抗原和肠道病毒71型抗原，在质控线上喷点羊抗鼠IgM，制得免疫硝酸纤维素膜；
（e）将预处理的样品垫、步骤（c）制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤（d）制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在塑料板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
6.根据权利要求5所述的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤（a）所述的采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒粒径为20~60nm。
7.根据权利要求5所述的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤（c）所述的喷金缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5~20%，海藻糖浓度为1~5%，BSA浓度为0.5~1%。
8.根据权利要求5所述的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤（d）所述的在硝酸纤维膜的第一检测线、第二检测线分别喷点柯萨奇病毒A16型抗原和肠道病毒71型抗原，其中柯萨奇病毒A16型抗原在前，肠道病毒71型抗原在后，柯萨奇病毒A16型检测线距离硝酸纤维素膜的上缘3~15mm，肠道病毒71型检测线距硝酸纤维素膜上缘距离5~17mm；质控线上喷点羊抗鼠IgM距硝酸纤维素膜上缘10~18mm。
9.根据权利要求5所述的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤（e）所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液处理，所述样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂S17组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5~1%，酪蛋白浓度为0.1~0.2%，表面活性剂S17浓度为0.5~1%。
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