CN115524489B - 一种基于光电双信号的诺如病毒的检测方法、材料及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于光电双信号的诺如病毒的检测方法、材料及应用，所述的检测材料为CuO2@NH2COF，使用该材料检测诺如病毒的方法包括，1)与NoV亲和肽结合；2)催化2,4‑二氯苯酚2,4‑DP和4‑氨基安替比林4‑AP反应显色；3)在电化学检测中，显现出Cu的信号。该生物传感器具有设备简单、无需专业人员操作、无需其他信号标签、低成本、灵敏度较高、可视化检测、耗时较短、较宽的检测范围和较低的检出限等优点。对诺如病毒的检测具有重要的科学意义和临床应用价值，同时也为诺如病毒的实际样品检测提供新的思路。

Description

一种基于光电双信号的诺如病毒的检测方法、材料及应用
技术领域
本发明属于分析化学、材料和生物传感技术领域，具体涉及一种诺如病毒的光电双模式检测方法、免疫分析和生物传感技术领域，具体是NoV作为目标分析物，采用CuO2@NH2COF的复合材料标记亲和肽来构建出一种夹心型免疫传感器。
背景技术
诺如病毒，又称诺瓦克病毒(Norwalk Viruses,NV)是人类杯状病毒科(HumanCalicivirus,HuCV)中诺如病毒(Norovirus,NV)属的一种病毒。是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒为无包膜单股正链RNA病毒，病毒粒子直径约27-40nm，基因组全长约7.5-7.7kb，分为三个开放阅读框(Open Reading Frames,ORFs)，两端是5'和3'非翻译区(Untranslated region,UTR)，3'末端有多聚腺苷酸尾(PolyA)。ORF1编码一个聚蛋白，翻译后被裂解为与复制相关的7个非结构蛋白(Non-structural polyprotein)，其中包括RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)。ORF2和ORF3分别编码主要结构蛋白(VP1)和次要结构蛋白(VP2)。病毒衣壳由180个VP1和几个VP2分子构成，180个衣壳蛋白首先构成90个二聚体，然后形成二十面体对称的病毒粒子。根据蛋白在衣壳中的位置，每个衣壳蛋白可分为两个主要区域，分别为壳区(Shell domain，S区)和突出区(Protruding domain，P区)，二者之间是由8个氨基酸组成的铰链区(Hinge)连接。S区由衣壳蛋白的前225个氨基酸组成，形成病毒内壳，围绕病毒RNA。P区由剩余的氨基酸组成，进一步分为两个亚区P1区和P2区。P区通过二聚体相互作用增加衣壳稳定性并形成电镜下可见的病毒粒子突出端。P2区高度变异，包含潜在的抗原中和位点和受体组织血型抗原(histoblood group antigens,HBGAs)识别位点。VP2位于病毒粒子内部，被认为参与衣壳聚集。诺如病毒分5个基因组(GI～GV)，其中只有GI、GII和GIV可以感染人，而GIII、GV分别感染牛和鼠。我国目前最常见的诺如病毒为GII、GI型。GII型含有至少21个基因亚型，毒株变异较快，其中GII.4基因亚型近10年已引起3次全球性流行，分别由2006年GII.4－2006Minerva变异株、2009年GII.4－2009 New Orleans变异株和GII.4－2012 Sydney变异株所致，成为全球重要的公共卫生问题之一。
诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。美国每年在所有的非细菌性腹泻爆发中，60％-90％是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在中国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒检出率为15％左右，血清抗体水平调查表明中国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。“诺如病毒”感染性腹泻属于自限性疾病，没有疫苗和特效药物，因此对诺如病毒的预防检测非常有必要，以达到预防诺如病毒的目的。目前常用的检测方法是实时荧光定量PCR(RT-PCR)、传统ELISA法和电镜法等，RT-PCR具有高灵敏度、低样本需求量、高通量等优点，但其所用设备昂贵，成本较高、且该方法需要专业技术人员，故应用可能受限；另一常用的检测方法是传统ELISA法，主要以抗原抗体反应为依据，利用二抗上偶联的辣根过氧化物酶(HRP)催化底物显色，实现可视化检测。但由于天然酶在非生理条件下不稳定，容易变性失活，同时天然酶可能存在价格较贵等问题，使得传统的ELISA方法在特异性和灵敏度方面有所欠佳；电镜观察只能用于患病早期病毒大量排除时采集的样本检测，病程2-3天后检出率仅为10％-20％，效果欠佳。
在本发明中，CuO2@NH2 COF作为一种新型复合纳米酶材料，合成简单，能很好分散为水中，稳定性好，且具有结合抗体、适配体、多肽等具有识别作用的生物分子等特点，可与NoV亲和肽结合，而且CuO2@NH2 COF具有很好的漆酶活性，可较快催化2,4-二氯苯酚(2,4-DP)和4-氨基安替比林(4-AP)反应显色，另一方面，CuO2@NH2 COF在电化学检测中，可显现出Cu的信号，可实现对NoV的电化学检测。
NoV的主要结构蛋白(VP1)，VP1蛋白结构上可分为S和P区两个相邻的区域，其中S区形成内壳，构成VP1的底座；P区形成拱样结构突出于内壳外。P区可进一步分为P1和P2两个亚区，后者位于VP1的最外层，高度变异，目前认为是免疫识别和受体结合的关键部位。
因此，我们利用VP1蛋白抗体和亲和肽可以特异性识别结合NoV的特点与复合纳米材料共同作用构建一个操作方便、低成本、耗时较短、无需其他信号标签高、灵敏度、可视化以及高通量检测NoV的光电双模式检测方法。
发明内容
针对当前新型冠状病毒抗原检测成本高、需专业设备及操作人员、等问题，本发明提出一种基于光电双信号的诺如病毒的检测方法，包括如下步骤，
步骤1)将Ab1滴加到96孔板中，并在冰箱中孵育过夜，然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1；
步骤2)将牛血白清蛋白添加到步骤1)处理好的孔板中，在室温下封闭0-90min；封闭结束后，然后用PBS溶液清洗孔板；
步骤3)在步骤2)处理好的孔板中加入不同浓度的NoV，在室温下孵育0-120min，然后用然后用PBS溶液清洗96孔板；
步骤4)在步骤3)处理好的孔板中加入Pep/CuO2@NH2 COF生物探针材料，并在室温下0-150min，并将未结合的生物探针用PBS溶液去除；
步骤5)分别将2,4-DP和4-AP滴加到步骤4)处理好的板中，室温下反应0-150min，用紫外分光光度计测量其在510nm处的吸光度值；
步骤6)将基底材料AuPt-PDA滴加到打磨好的玻碳电极上，室温下干燥，随后加入Ab1滴加到干燥好的电极上，于4℃孵育过夜；
步骤7)用PBS溶液洗去未结合的Ab1，将1-3％的牛血白清蛋白滴加到上述玻碳电极上，室温下封闭0-60min，封闭结束，用PBS溶液洗去未结合的牛血白清蛋白；
步骤8)在步骤7)处理好的玻碳电极上加入不同浓度的NoV，并在室温下孵育0-90min，孵育结束，用PBS溶液洗去未结合的NoV；
步骤9)在步骤8)处理好的玻碳电极上加入Pep/CuO2@NH2 COF生物探针，并在室温下孵育0-150min，孵育结束，用PBS溶液洗去未结合的NoV；
步骤10)以步骤9)处理好的玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在浓度为0.1M的pH＝4.0的醋酸缓冲液中，利用差分脉冲伏安法进行检测，扫描电压为-0.2-0.2V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，脉冲周期为0.5s，记录电流峰值。
具体的详细步骤如下：
步骤1)将50μL的1-10μg·mL-1Ab1滴加到96孔板中，并在冰箱中孵育过夜，然后用含0.01％-2％吐温-20的PBS溶液洗去未结合的Ab1。
步骤2)将50μL 1-3％的牛血白清蛋白添加到步骤(1)处理好的孔板中，在25℃下封闭0-90min。封闭结束后，然后用含0.01％-2％吐温-20的PBS溶液清洗孔板。
步骤3)在步骤2)处理好的孔板中加入50μL不同浓度的NoV，在25℃下孵育0-120min，然后用然后用含0.01％-2％吐温-20的PBS溶液清洗96孔板。
步骤4)在步骤3)处理好的孔板中加入50μL的1-5mg·mL-1Pep/CuO2@NH2 COF生物探针材料，并在25℃下0-150min，并将未结合的生物探针用0.01％-2％吐温-20的PBS溶液去除。
步骤5)分别将50μL的1-5mg·mL-1的2,4-DP和50μL的1-5mg·mL-1 4-AP滴加至添加到步骤(4)处理好的板中，室温下反应0-150min，用紫外分光光度计测量其在510nm处的吸光度值。
步骤6)将10μL的1-3mg·mL-1的基底材料AuPt-PDA滴加到打磨好的玻碳电极上，室温下干燥，随后加入10μL的1-10μg·mL-1Ab1滴加到干燥好的电极上，于4℃孵育过夜。
步骤7)用PBS溶液洗去未结合的Ab1，将10μL的1-3％的牛血白清蛋白滴加到上述玻碳电极上，室温下封闭0-60min，封闭结束，用PBS洗去未结合的牛血白清蛋白。
步骤8)在步骤7)处理好的玻碳电极上加入10μL不同浓度的NoV，并在室温下孵育0-90min，孵育结束，用PBS溶液洗去未结合的NoV。
步骤9)在步骤8)处理好的玻碳电极上加入10μL 1-5mg·mL-1的Pep/CuO2@NH2 COF生物探针，并在室温下孵育0-120min，孵育结束，用PBS溶液洗去未结合的NoV。
步骤10)以步骤9)处理好的玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1M的pH＝4.0的醋酸缓冲液中，利用差分脉冲伏安法进行检测，扫描电压为-0.2-0.2V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，脉冲周期0.5s，记录电流峰值。
本发明所述步骤(4)制备CuO2@NH2 COF复合材料孵化诺如病毒亲和性肽的亲和肽标记物(Pep bioconjugates)包括：
将100μL 1mg·mL-1的NoV亲和性肽加入到1mL 1-5mg·mL-1的CuO2@NH2 COF分散液中并在4℃条件下搅拌过夜。用PBS洗掉游离的抗体后，加入1-3％BSA 100μL反应1-15h。将所得溶液离心分离并将沉淀分散在1-5mL的PBS中以获得1-5mg·mL-1的Pep/CuO2@NH2 COF生物探针材料，将其储存在4℃备用。
本发明所述步骤(4)制备CuO2@NH2 COF复合材料和步骤(6)AuPt-PDA的制备方法，具体步骤如下：
(1)将0.1-0.5g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.01-0.05g的CuCl2·2 H2O，1-10mg NH2COF分散于5mL的水溶液，室温下搅拌30-60min，随后加入0.1-0.5mL的H2O2和1-5mL 0.02M的NaOH，室温下搅拌30-60min，离心收集，去离子水洗3次，真空干燥获得CuO2@NH2 COF。
(2)将1-10μmol的氯金酸(HAuCl4)，1-10μmol的氯铂酸(H2PtCl6)溶解在含有1-2.5mg多巴胺的10-33mL pH为8.5的Tris-HCl缓冲液中，水浴加热60℃，在60S内加入2mL0.01-0.05M的NaBH4，60℃下继续搅拌1-3h，离心，DW洗，冷冻干燥得到AuPt-PDA。
一种基于光电双信号的诺如病毒的检测材料，所述的检测材料为CuO2@NH2 COF。
本发明所述的检测材料CuO2@NH2 COF检测诺如病毒的方法包括，1)与NoV亲和肽结合；2)催化2,4-二氯苯酚2,4-DP和4-氨基安替比林4-AP反应显色；3)在电化学检测中，显现出Cu的信号。
本发明的有益成果：
(1)本发明通过以CuCl2·2H2O、聚乙烯吡咯烷酮、过氧化氢、氯金酸、氯铂酸、NaOH、NaBH4、多巴胺、NH2 COF，在温和条件下制备了CuO2@NH2 COF和AuPt-PDA，然后利用Cu元素锚定生物识别物质亲和肽，合成了探针材料Pep/CuO2@NH2 COF，一方面以CuO2@NH2 COF对2,4-DP和4-AP的催化显色反应，使用96孔板成功构建了三明治型ELISA传感器，实现了对NoV的检测，改进ELISA传感器的检测范围为1-5000copies·mL-1，检出限(LOD)达到了0.125copy/mL(S/N＝3)，表现出了较高的灵敏度，为NoV的检测提供了一个低廉、快速、灵敏和可视化的方法，另一方面，利用Pep/CuO2@NH2 COF在电化学检测中显示的Cu信号，成功构建了三明治型电化学传感器，实现对NoV的快速、灵敏及检测，检测范围为1-5000copies·mL-1，检出限(LOD)达到了0.152copy/mL(S/N＝3)，从而实现了对NoV的光电双模式检测。
(2)本发明使用的酶促比色信号读数和电流峰值读数。
(3)本发明使用了CuO2@NH2 COF，对2,4-DP和4-AP的显色有较好的催化效果。
(4)本发明将ELISA与纳米酶相结合，制备得到基于纳米酶的酶联免疫传感器，用来裸眼检测NoV。该方法具有操作方便、低成本、高灵敏度、可视化以及高通量检测等优点，有望用于实际样品的快速检测。
(5)本发CuO2@NH2 COF在电化学检测中的Cu信号，实现对NoV的无标签信号检测，该方法具有灵敏度好、选择性好和耗时较短等优点。
(6)本设备简单、无需专业人员操作、无需其他信号标签、低成本、灵敏度较高、可视化检测、较宽的检测范围和较低的检出限、耗时较短等优点。对NoV的检测具有重要的科学意义和临床应用价值,同时也为诺如病毒的实际样品检测提供新的思路。
附图说明
图1为CuO2(A)、CuO2@NH2 COF(B)的TEM图；
图2为AuPt-PDA的TEM图(A)、SEM图(B)；
图3为AuPt-PDA(A)、CuO2@NH2 COF(B)的XPS图；
图4为ELISA传感器的pH筛选图(A)、电化学传感器的pH筛选图(B)；
图5为不同浓度NoV的电化学信号谱图(A)和标准曲线(B)；
图6为不同浓度NoV的紫外吸收谱图(A)和标准曲线(B)。
具体实施方式
实施例中所使用的化学试剂和溶剂均为分析纯；原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买；所述搅拌采用磁力搅拌器搅拌方式。
实施例1：
一种基于光电双信号的诺如病毒的检测方法具体步骤如下：
步骤1)用PBS缓冲液稀释NoV主要结构蛋白的一抗(Ab1)至1μg/mL，每孔50μL包被于96孔酶标板，4℃孵育过夜；
步骤2)用0.05％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入50μL 1％BSA，室温封闭50min；
步骤3)用0.05％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入50μL浓度为1-5000copies/mL不同浓度的NoV溶液，室温孵育90min；
步骤4)用0.05％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入50μL 2mg/mL Pep/CuO2@NH2 COF纳米复合探针，室温孵育90min；
步骤5)用0.05％PBST洗涤液清洗孔酶标板3遍，每孔加入适量2-吗啉乙磺酸缓冲溶液(MES)，2,4-DP，4-AP，总体积200μL，室温下反应120min，用紫外分光光度计检测510nm处的吸光度值，绘制标准曲线。
步骤6)将10μL的1mg·mL-1的基底材料AuPt-PDA滴加到打磨好的玻碳电极上，室温下干燥，随后加入10μL的10μg·mL-1Ab1滴加到干燥好的电极上，于4℃孵育过夜。
步骤7)用PBS洗去未结合的Ab1，将10μL的1％的牛血白清蛋白滴加到上述玻碳电极上，室温下孵育40min，孵育结束，用PBS洗去未结合的牛血白清蛋白。
步骤8)在步骤7)处理好的玻碳电极上加入10μL不同浓度的NoV，并在室温下孵育60min，孵育结束，用PBS洗去未结合的NoV。
步骤9)在步骤8)处理好的玻碳电极上加入10μL 2.5mg·mL-1的Pep/CuO2@NH2 COF生物探针，并在室温下孵育90min，孵育结束，用PBS洗去未结合的NoV。
步骤10)以步骤9)处理好的玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1M的pH＝4.0的醋酸缓冲液中，利用差分脉冲伏安法进行检测，扫描电压为-0.2-0.2V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，脉冲周期0.5s记录电流峰值，绘制标准曲线。
实施例2：
一种基于光电双信号的诺如病毒的检测方法具体步骤如下：
步骤1)用PBS缓冲液稀释NoV主要结构蛋白的一抗(Ab1)至2μg/mL，每孔50μL包被于96孔酶标板，4℃孵育过夜；
步骤2)用0.05％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入50μL 1.5％BSA，室温封闭60min；
步骤3)用0.05％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入50μL浓度为50copies/mL的NoV溶液，室温孵育80min；
步骤4)用0.05％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入50μL 2mg/mL Pep/CuO2@NH2 COF纳米复合探针，室温孵育100min；
步骤5)用0.05％PBST洗涤液清洗孔酶标板3遍，每孔加入适量2-吗啉乙磺酸缓冲溶液(MES)，2,4-DP，4-AP，总体积200μL，室温下反应100min，用紫外分光光度计检测510nm处的吸光度值，根据绘制的标准曲线计算得到NoV的浓度为49.01copies/mL。
步骤6)将10μL的1.5mg·mL-1的基底材料AuPt-PDA滴加到打磨好的玻碳电极上，室温下干燥，随后加入10μL的1μg·mL-1Ab1滴加到干燥好的电极上，于4℃孵育过夜。
步骤7)用PBS洗去未结合的Ab1，将10μL的1.5％的牛血白清蛋白滴加到上述玻碳电极上，室温下封闭45min，封闭结束，用PBS洗去未结合的牛血白清蛋白。
步骤8)在步骤7)处理好的玻碳电极上加入10μL 100copies/mL的NoV，并在室温下孵育70min，孵育结束，用PBS洗去未结合的NoV。
步骤9)在步骤8)处理好的玻碳电极上加入10μL 1.5mg·mL-1的Pep/CuO2@NH2 COF生物探针，并在室温下孵育85min，孵育结束，用PBS洗去未结合的NoV。
步骤10)以步骤9)处理好的玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1M的pH＝4.0的醋酸缓冲液中，利用差分脉冲伏安法进行检测，扫描电压为-0.2-0.2V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，脉冲周期0.5s，记录电流峰值，根据绘制的标准曲线计算得到NoV的浓度为98.79copies/mL。
实施例3：
一种基于光电双信号的诺如病毒的检测方法具体步骤如下:
步骤1)用PBS缓冲液稀释NoV主要结构蛋白的一抗(Ab1)至8μg/mL，每孔50μL包被于96孔酶标板，4℃孵育过夜；
步骤2)用0.1％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入50μL 2.5％BSA，室温封闭30min；
步骤3)用0.1％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入100μL浓度为200copies/mL的NoV溶液，室温孵育80min；
步骤4)用0.1％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入50μL 2.0mg/mL Pep/CuO2@NH2 COF纳米复合探针，室温孵育90min；
步骤5)用0.1％PBST洗涤液清洗孔酶标板3遍，每孔加入适量2-吗啉乙磺酸缓冲溶液(MES)，2,4-DP，4-AP，总体积300μL，室温下反应150min，用紫外分光光度计检测510nm处的吸光度值，根据绘制的标准曲线计算得到NoV的浓度为202.3copies/mL。
步骤6)将10μL的1.5mg·mL-1的基底材料AuPt-PDA滴加到打磨好的玻碳电极上，室温下干燥，随后加入10μL的9μg·mL-1Ab1滴加到干燥好的电极上，于4℃孵育过夜。
步骤7)用PBS洗去未结合的Ab1，将10μL的1％的牛血白清蛋白滴加到上述玻碳电极上，室温下封闭50min，封闭结束，用PBS洗去未结合的牛血白清蛋白。
步骤8)在步骤7)处理好的玻碳电极上加入10μL 500copies/mL的NoV，并在室温下孵育80min，孵育结束，用PBS洗去未结合的NoV。
步骤9)在步骤8)处理好的玻碳电极上加入10μL 2.5mg·mL-1的Pep/CuO2@NH2 COF生物探针，并在室温下孵育85min，孵育结束，用PBS洗去未结合的NoV。
步骤10)以步骤9)处理好的玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1M的pH＝4.0的醋酸缓冲液中，利用差分脉冲伏安法进行检测，扫描电压为-0.2-0.2V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，脉冲周期0.5s，记录电流峰值，根据绘制的标准曲线计算得到NoV的浓度为503.9copies/mL。
实施例4：
一种基于光电双信号的诺如病毒的检测方法具体步骤如下:
步骤1)用PBS缓冲液稀释NoV主要结构蛋白的一抗(Ab1)至3μg/mL，每孔50μL包被于96孔酶标板，4℃孵育过夜；
步骤2)用1.5％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入50μL 1.5％BSA，室温封闭40min；
步骤3)用1.5％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入100μL浓度为1000copies/mL的NoV溶液，室温孵育85min；
步骤4)用1.5％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入50μL 2.0mg/mL Pep/CuO2@NH2 COF纳米复合探针，室温孵育90min；
步骤5)用1.5％PBST洗涤液清洗孔酶标板3遍，每孔加入适量2-吗啉乙磺酸缓冲溶液(MES)，2,4-DP，4-AP，总体积300μL，室温下反应110min，用紫外分光光度计检测510nm处的吸光度值，根据绘制的标准曲线计算得到NoV的浓度为998.2copies/mL。
步骤6)将10μL的2.5mg·mL-1的基底材料AuPt-PDA滴加到打磨好的玻碳电极上，室温下干燥，随后加入10μL的5μg·mL-1Ab1滴加到干燥好的电极上，于4℃孵育过夜。
步骤7)用PBS洗去未结合的Ab1，将10μL的2.5％的牛血白清蛋白滴加到上述玻碳电极上，室温下封闭60min，封闭结束，用PBS洗去未结合的牛血白清蛋白。
步骤8)在步骤7)处理好的玻碳电极上加入10μL 500copies/mL的NoV，并在室温下孵育50min，孵育结束，用PBS洗去未结合的NoV。
步骤9)在步骤8)处理好的玻碳电极上加入10μL 3mg·mL-1的Pep/CuO2@NH2 COF生物探针，并在室温下孵育75min，孵育结束，用PBS洗去未结合的NoV。
步骤10)以步骤9)处理好的玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1M的pH＝4.0的醋酸缓冲液中，利用差分脉冲伏安法进行检测，扫描电压为-0.2-0.2V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，脉冲周期0.5s，记录电流峰值，根据绘制的标准曲线计算得到NoV的浓度为1004.9copies/mL。
实施例5：
一种基于光电双信号的诺如病毒的检测方法具体步骤如下:
步骤1)用PBS缓冲液稀释NoV主要结构蛋白的一抗(Ab1)至2μg/mL，每孔50μL包被于96孔酶标板，4℃孵育过夜；
步骤2)用0.08％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入50μL 2％BSA封闭，室温封闭45min；
步骤3)用0.08％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入50μL浓度为1500copies/mL的NoV溶液，室温孵育90min；
步骤4)用0.08％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入50μL 2.5mg/mL Pep/CuO2@NH2 COF纳米复合探针，室温孵育100min；
步骤5)用0.08％PBST洗涤液清洗孔酶标板3遍，每孔加入适量2-吗啉乙磺酸缓冲溶液(MES)，2,4-DP，4-AP，总体积200μL，室温下反应125min，用紫外分光光度计检测510nm处的吸光度值，根据绘制的标准曲线计算得到NoV的浓度为1510.3copies/mL。
步骤6)将10μL的1.5mg·mL-1的基底材料AuPt-PDA滴加到打磨好的玻碳电极上，室温下干燥，随后加入10μL的5μg·mL-1Ab1滴加到干燥好的电极上，于4℃孵育过夜。
步骤7)用PBS洗去未结合的Ab1，将10μL的1.0％的牛血白清蛋白滴加到上述玻碳电极上，室温下孵育80min，孵育结束，用PBS洗去未结合的牛血白清蛋白。
步骤8)在步骤7)处理好的玻碳电极上加入10μL 2000copies/mL的NoV，并在室温下孵育90min，孵育结束，用PBS洗去未结合的NoV。
步骤9)在步骤8)处理好的玻碳电极上加入10μL 1.8mg·mL-1的Pep/CuO2@NH2 COF生物探针，并在室温下孵育95min，孵育结束，用PBS洗去未结合的NoV。
步骤10)以步骤9)处理好的玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1M的pH＝4.0的醋酸缓冲液中，利用差分脉冲伏安法进行检测，扫描电压为-0.2-0.2V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，脉冲周期0.5s，记录电流峰值，根据绘制的标准曲线计算得到NoV的浓度为1994.2copies/mL。
实施例6：
一种基于光电双信号的诺如病毒的检测方法具体步骤如下:
步骤1)用PBS缓冲液稀释NoV主要结构蛋白的一抗(Ab1)至4μg/mL，每孔50μL包被于96孔酶标板，4℃孵育过夜；
步骤2)用1.3％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入50μL 2.5％BSA，室温封闭40min；
步骤3)用1.3％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入100μL浓度为5000copies/mL不同浓度的NoV溶液，室温孵育80min；
步骤4)用1.3％PBST洗涤液清洗96孔酶标板3遍，每孔加入50μL 3.0mg/mL Pep/CuO2@NH2 COF纳米复合探针，室温孵育95min；
步骤5)用1.3％PBST洗涤液清洗孔酶标板3遍，每孔加入适量2-吗啉乙磺酸缓冲溶液(MES)，2,4-DP，4-AP，总体积300μL，室温下反应130min，用紫外分光光度计检测510nm处的吸光度值，根据绘制的标准曲线计算得到NoV的浓度为5009.8copies/mL。
步骤6)将10μL的4.5mg·mL-1的基底材料AuPt-PDA滴加到打磨好的玻碳电极上，室温下干燥，随后加入10μL的7μg·mL-1Ab1滴加到干燥好的电极上，于4℃孵育过夜。
步骤7)用PBS洗去未结合的Ab1，将10μL的2％的牛血白清蛋白滴加到上述玻碳电极上，室温下孵育50min，孵育结束，用PBS洗去未结合的牛血白清蛋白。
步骤8)在步骤7)处理好的玻碳电极上加入10μL 2500copies/mL的NoV，并在室温下孵育65min，孵育结束，用PBS洗去未结合的NoV。
步骤9)在步骤8)处理好的玻碳电极上加入10μL 3.5mg·mL-1的Pep/CuO2@NH2 COF生物探针，并在室温下孵育75min，孵育结束，用PBS洗去未结合的NoV。
步骤10)以步骤9)处理好的玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1M的pH＝4.0的醋酸缓冲液中，利用差分脉冲伏安法进行检测，扫描电压为-0.2-0.2V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，脉冲周期0.5s，记录电流峰值，根据绘制的标准曲线计算得到NoV的浓度为2510.4copies/mL。
对上述制备得到的CuO2@NH2 COF纳米材料进行透射电子显微镜(TEM，图1A、B)、X射线光电子能谱(XPS，图3B)的表征，分别获得CuO2@NH2 COF纳米材料的形貌以及结构和材料表面元素的信息，从而证明CuO2@NH2 COF纳米材料的制备成功。
同时对上述制备得到的AuPt-PDA纳米材料进行透射电子显微镜(TEM，图2A)、扫描电子显微镜(SEM，图2B)、X射线光电子能谱(XPS，图3A)的表征，分别获得AuPt-PDA纳米材料的形貌以及结构、三维形貌及尺寸、材料表面元素及其化学态的信息，从而证明AuPt-PDA纳米材料的成功制备。
图1为CuO2(A)、CuO2@NH2 COF(B)的透射电镜(TEM)图；其中CuO2(图A)为聚集的棉花状结构；而CuO2@NH2 COF的TEM(图B)结果显示，NH2 COF作为基底，CuO2被较好的分散在NH2COF上，与单独合成的CuO2的形貌有明显的区别，这些结果也说明CuO2@NH2 COF复合材料的成功制备。
图2为AuPt-PDA(A)、CuO2@NH2 COF(B)的X射线光电子能谱(XPS)图；其中AuPt-PDA的XPS图谱(图A)显示存在Au、Pt、C、N和O元素，也表明AuPt-PDA的成功制备；CuO2@NH2 COF的XPS图谱(图B)显示存在Cu、C、N和O元素，也表明CuO2@NH2 COF的成功制备。
图3为AuPt-PDA(A)、CuO2@NH2 COF(B)的X射线光电子能谱(XPS)图；其中AuPt-PDA的XPS图谱(图A)显示存在Au、Pt、C、N和O元素，表明AuPt-PDA的成功制备；CuO2@NH2 COF的XPS图谱(图B)显示存在Cu、C、N和O元素，也表明CuO2@NH2 COF的成功制备。
图4为ELISA传感器的pH筛选图谱(图A)；电化学传感器的pH筛选图谱(图B)，pH对纳米酶的催化活性有很大的影响，为了获得最佳的漆酶活性，对反应的pH进行筛选，结果显示，pH为6.8时(图A)，纳米酶具有最优的催化活性；同时pH值对电化学传感器的检测也有较大的影响，为了获得适合的电流响应值，对电化学传感器的检测pH进行筛选，结果显示，pH为4.0时(图B)，电流响应值较大，且溶液酸性较合适。
图5为所制备的电化学传感器不同浓度的电流峰值谱图以及标准曲线。将所构建的电化学传感器使用电化学工作站在醋酸缓冲溶液中对不同浓度的NoV进行检测，随着NoV浓度的增加，电流值逐渐增加(图5A)。如图5B所示，电流值与NoV浓度的对数具有良好的线性关系，相关系数(R2)为0.9968，LOD为0.152copy·mL-1(S/N＝3)，显示出了良好的线性和较低的LOD值。
图6为所制备的ELISA传感器不同浓度的紫外吸收谱图以及标准曲线。将所构建的ELISA传感器使用分光光度计在510nm条件下来对不同浓度的NoV进行检测，随着NoV浓度的增加，吸光度值逐渐增加(图6A)。如图6B所示，吸光度与NoV浓度的对数具有良好的线性关系，相关系数(R2)为0.9981，LOD为0.125copy·mL-1(S/N＝3)，显示出了良好的线性和较低的LOD值。
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例(由于本发明的配方包含数值范围，故实施例不能穷举，本发明所记载的保护范围包含本发明的数值范围和其他技术要点范围)，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述(包括但不仅限于简写、缩写)。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (8)

1.一种非诊断目的的基于光电双信号的诺如病毒的检测方法，其特征在于，该检测方法包括如下步骤，
步骤1)将Ab1滴加到96孔板中，并在冰箱中孵育过夜，然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1；
步骤2)将牛血白清蛋白添加到步骤1)处理好的孔板中，在室温下封闭0-90min；封闭结束后，然后用PBS溶液清洗孔板；
步骤3)在步骤2)处理好的孔板中加入不同浓度的NoV，在室温下孵育0-120min，然后用然后用PBS溶液清洗96孔板；
步骤4)在步骤3)处理好的孔板中加入1-5mg·mL-1Pep/CuO2@NH2 COF生物探针材料，并在室温下孵育0-150min，并将未结合的生物探针用PBS溶液去除；
步骤5)分别将2,4-DP和4-AP滴加到步骤4)处理好的板中，室温下反应0-150min，用紫外分光光度计测量其在510nm处的吸光度值；
步骤6)将基底材料AuPt-PDA滴加到打磨好的玻碳电极上，室温下干燥，随后加入Ab1滴加到干燥好的电极上，于4℃孵育过夜；
步骤7)用PBS溶液洗去未结合的Ab1，将1-3％的牛血白清蛋白滴加到上述玻碳电极上，室温下封闭0-60min，封闭结束，用PBS溶液洗去未结合的牛血白清蛋白；
步骤8)在步骤7)处理好的玻碳电极上加入不同浓度的NoV，并在室温下孵育0-90min，孵育结束，用PBS溶液洗去未结合的NoV；
步骤9)在步骤8)处理好的玻碳电极上加入1-5mg·mL-1Pep/CuO2@NH2COF生物探针，并在室温下孵育0-150min，孵育结束，用PBS溶液洗去未结合的NoV；
步骤10)以步骤9)处理好的玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在浓度为0.1M的pH＝4.0的醋酸缓冲液中，利用差分脉冲伏安法进行检测，扫描电压为-0.2-0.2V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，脉冲周期为0.5s，记录电流峰值；
上述的Pep为NoV亲和性肽。
2.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基于光电双信号的诺如病毒的检测方法，其特征在于，该检测方法包括的步骤具体为，
步骤1)将50μL的1-10μg·mL-1Ab1滴加到96孔板中，并在冰箱中孵育过夜，然后用含0.01％-2％吐温-20的PBS溶液洗去未结合的Ab1；
步骤2)将50μL 0.1-5％的牛血白清蛋白添加到步骤1)处理好的孔板中，在室温下封闭0-90min；封闭结束后，然后用含0.01％-2％吐温-20的PBS溶液清洗孔板；
步骤3)在步骤2)处理好的孔板中加入50μL不同浓度的NoV，在室温下孵育0-120min，然后用然后用含0.01％-2％吐温-20的PBS溶液清洗96孔板；
步骤4)在步骤3)处理好的孔板中加入50μL的1-5mg·mL-1Pep/CuO2@NH2 COF生物探针材料，并在室温下孵育0-150min，并将未结合的生物探针用0.01％-2％吐温-20的PBS溶液去除；
步骤5)分别将50μL的1-5mg·mL-1的2,4-DP和50μL的1-5mg·mL-14-AP滴加到步骤4)处理好的板中，室温下反应0-150min，用紫外分光光度计测量其在510nm处的吸光度值；
步骤6)将10μL的1-5mg·mL-1的基底材料AuPt-PDA滴加到打磨好的玻碳电极上，室温下干燥，随后加入10μL的1-10μg·mL-1Ab1滴加到干燥好的电极上，于4℃孵育过夜；
步骤7)用PBS溶液洗去未结合的Ab1，将10μL的1-3％的牛血白清蛋白滴加到上述玻碳电极上，室温下封闭0-60min，封闭结束，用PBS溶液洗去未结合的牛血白清蛋白；
步骤8)在步骤7)处理好的玻碳电极上加入10μL不同浓度的NoV，并在室温下孵育0-90min，孵育结束，用PBS溶液洗去未结合的NoV；
步骤9)在步骤8)处理好的玻碳电极上加入10μL 1-5mg·mL-1的Pep/CuO2@NH2 COF生物探针，并在室温下孵育0-150min，孵育结束，用PBS溶液洗去未结合的NoV；
步骤10)以步骤9)处理好的玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1M的pH＝4.0的醋酸缓冲液中，利用差分脉冲伏安法进行检测，扫描电压为-0.2-0.2V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，脉冲周期为0.5s，记录电流峰值。
3.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基于光电双信号的诺如病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤4)Pep/CuO2@NH2 COF生物探针材料的制备方法为：将NoV亲和性肽加入到的CuO2@NH2 COF分散液中并在4℃条件下搅拌过夜；用PBS溶液洗掉游离的抗体后，加入BSA反应1-15h；将所得溶液离心分离并将沉淀分散PBS溶液中以获得Pep/CuO2@NH2 COF生物探针材料，将其储存在4℃备用。
4.根据权利要求2所述的一种非诊断目的的基于光电双信号的诺如病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤4)Pep/CuO2@NH2 COF生物探针材料的制备方法为：将100μL 1mg·mL-1的NoV亲和性肽加入到1mL 1-5mg·mL-1的CuO2@NH2 COF分散液中并在4℃条件下搅拌过夜；用PBS溶液洗掉游离的抗体后，加入1-3％BSA 100μL反应1-15h；将所得溶液离心分离并将沉淀分散在1-5mL的PBS溶液中以获得1-5mg·mL-1的Pep/CuO2@NH2 COF生物探针材料，将其储存在4℃备用。
5.根据权利要求3所述的非诊断目的的一种基于光电双信号的诺如病毒的检测方法，其特征在于，所述CuO2@NH2 COF复合材料的制备方法，具体步骤如下：将聚乙烯吡咯烷酮PVP，CuCl2·2H2O，NH2 COF分散于水溶液，室温下搅拌30-60min，随后加入H2O2和NaOH，室温下搅拌30-60min，离心收集，去离子水洗，真空干燥获得CuO2@NH2 COF。
6.根据权利要求4所述的一种非诊断目的的基于光电双信号的诺如病毒的检测方法，其特征在于，所述CuO2@NH2 COF复合材料的制备方法，具体步骤如下：将0.1-0.5g的聚乙烯吡咯烷酮PVP，0.01-0.05g的CuCl2·2H2O，1-10mg NH2 COF分散于5mL的水溶液，室温下搅拌30-60min，随后加入0.1-0.5mL的H2O2和1-5mL 0.02M的NaOH，室温下搅拌30-60min，离心收集，去离子水洗3次，真空干燥获得CuO2@NH2 COF。
7.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基于光电双信号的诺如病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤(6)AuPt-PDA的制备方法为：将氯金酸HAuCl4、氯铂酸H2PtCl6溶解在含有多巴胺的Tris-HCl缓冲液中，水浴加热60℃，加入NaBH4，60℃下继续搅拌1-3h，离心，洗涤，冷冻干燥得到AuPt-PDA。
8.根据权利要求2所述的一种非诊断目的的基于光电双信号的诺如病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤(6)AuPt-PDA的制备方法为：将1-10μmol的氯金酸AuCl4，1-10μmol的氯铂酸H2PtCl6溶解在含有1-2.5mg多巴胺的10-33mL pH为8.5的Tris-HCl缓冲液中，水浴加热60℃，在60S内加入2mL0.01-0.05M的NaBH4，60℃下继续搅拌1-3h，离心，洗涤，冷冻干燥得到AuPt-PDA。
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