CN114047341A - 一种检测银环蛇毒检测生物探针及生物免疫传感器和基于比例型信号的检测银环蛇毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测银环蛇毒检测生物探针及生物免疫传感器和基于比例型信号的检测银环蛇毒的方法,属于生物免疫传感技术领域。本发明以AuNPs/COF作为信号放大物质,具有大量催化活性位点,用于ELISA酶联免疫吸附法进行检测时对客体信号分子对硝基苯酚具有催化还原作用和富集作用,以此探针构建的比例型化学生物免疫传感器能够实现对银环蛇毒的精准测量,有较好的稳定性、重复性及较宽的检测范围,且检测耗时短、成本低。本发明提供的生物免疫传感器以S‑GQD作为还原剂,能够有效提高传感器的稳定性,同时其还原能力可被金纳米粒子催化提高,S‑GQD与AuNPs/COF两种材料对信号具有协同正反馈放大效果,从而提高传感器的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及生物免疫传感技术领域,特别涉及一种检测银环蛇毒检测生物探针及生物免疫传感器和基于比例型信号的检测银环蛇毒的方法。
背景技术
银环蛇是世界上陆地毒性排名第四的毒蛇,同时也是我国毒性最高的陆栖蛇,广泛分布于中国的安徽、浙江、江苏、江西、福建、台湾、湖北、湖南、广东、广西、海南、贵州、云南等省。银环蛇毒素主要成分为蛋白质和多肽,以神经毒素为主,具有症状隐蔽、毒性大、发病快、致死量小的特点。因此,通过特异性和敏感性的生物标志物和分析工具进行及时的诊断,可以缩短寻找针对性抗毒血清所需时间,从而有效的提高生存率。
目前检测血清中的生物标志物如银环蛇毒等,已有放射性免疫分析、色谱分析等技术。放射性免疫分析具有分析速度快、成本低、灵敏度高的优点,其有效检测范围窄,仅为0.001~1mg/mL。色谱分析具有分析速度快的优点,但其检测耗时长、设备成本相对较高。
发明内容
有鉴于此,本发明目的在于提供一种检测银环蛇毒检测生物探针及生物免疫传感器和基于比例型信号的检测银环蛇毒的方法。本发明提供的检测探针用于检测银环蛇毒时,具有灵敏度高、检测范围广、耗时短、成本低的优点。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针,包括银环蛇β毒素适配体和与所述银环蛇β毒素适配体化学结合的AuNPs/COF纳米复合材料。
本发明提供了上述生物探针的制备方法,包括以下步骤:
(1)将1,3,5-三(4-氨苯基)苯、2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛、醋酸与混合有机溶剂混合,进行溶剂热反应,得到共价有机框架材料;
(2)将所述共价有机框架材料与醇溶剂、HAuCl4、还原剂混合,进行还原反应,得到AuNPs/COF纳米复合材料;
(3)将所述AuNPs/COF纳米复合材料与修饰有巯基的银环蛇β毒素适配体混合,得到基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针。
优选的,所述1,3,5-三(4-氨苯基)苯与2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛的摩尔比为1:1~5。
优选的,所述混合有机溶剂包括1,4-二恶烷、丁醇和甲醇;
所述溶剂热反应的温度为60~80℃,时间为18~30h。
优选的,所述共价有机框架材料与HAuCl4的质量比为15~20:1。
优选的,所述AuNPs/COF纳米复合材料与修饰有巯基的银环蛇β毒素适配体的质量比为2~4:1。
本发明提供了一种检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
将银环蛇β毒素抗体溶液、非特异性蛋白、银环蛇β毒素抗原溶液、上述制备方法制备得到的基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针进行孵育,得到孵育产物;
将所述孵育产物与对硝基苯酚、掺硫石墨烯碳量子点分散液混合,得到检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器。
优选的,所述孵育包括:
将银环蛇β毒素抗体溶液在孵育器中进行第一孵育,洗去未结合物质后得到第一孵育产物;
向所述第一孵育产物中加入非特异性蛋白,进行第二孵育,洗去未结合物质后得到第二孵育产物;
向所述第二孵育产物中加入银环蛇β毒素抗原溶液,进行第三孵育,洗去未结合物质后得到第三孵育产物;
向所述第三孵育产物中加入基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针,进行第四孵育,洗去未结合物质后得到孵育产物。
本发明提供了上述制备方法制备得到的检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器,所述比例型化学生物免疫传感器的检测的检测范围为0.001~100ng/mL,检测下限为300fg/mL。
本发明提供了一种基于比例型双信号的银环蛇毒检测方法,包括以下步骤:
以待测样品替换银环蛇β毒素抗原溶液,按照上述制备方法制备检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器;
取样所述检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器内的液体,测试液体在320nm处、400nm处的吸光度峰值,获得待测样品的吸光度比值,所述吸光度比值为320nm处吸光度与400nm处的吸光度的比值;
根据预定的标准曲线和待测样品的吸光度比值得到待测样品中银环蛇毒浓度;所述标准曲线为银环蛇毒浓度的对数与吸光度比值算数平方根的线性关系曲线。
本发明提供了一种基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针,包括银环蛇β毒素适配体和与所述银环蛇β毒素适配体化学结合的AuNPs/COF纳米复合材料。本发明以金纳米粒子修饰共价有机框架的纳米复合材料 AuNPs/COF作为信号放大物质,具有大量的催化活性位点,对客体信号分子对硝基苯酚具有催化还原作用和富集作用,以本发明提供的银环蛇毒检测探针构建的比例型化学生物免疫传感器能够实现对银环蛇毒的精准测量,有较好的稳定性、重复性及较宽的检测范围,且检测耗时短、成本低。
本发明提供了一种检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器,此生物免疫传感器以掺硫石墨烯碳量子点(S-GQD)作为还原剂,能够有效提高传感器的稳定性,同时其还原能力可被AuNPs/COF纳米复合材料中的金纳米粒子催化提高,S-GQD与AuNPs/COF两种材料对信号具有协同正反馈放大效果,有效地提高了传感器的灵敏度。所得传感器的线性检测范围是 0.001ng/mL~100ng/mL,最低检测下限为300fg/mL(3×10-13摩尔/升),成功地检测了实际血清样品中银环蛇毒的含量,其背景值低、灵敏度高、检测范围广、检测限低,对比传统检测方法具有一定的优越性,为银环蛇毒的检测提供了低成本、高灵敏度、方便快捷的检测方法。
附图说明
图1为实施例3所制得的COF和AuNPs@COF的红外光谱图;
图2为实施例3所制得的S-GQD的XPS图;
图3为实施例3中COF、AuNPs@COF和GQDs的透射电镜图,图3中(A) 为S-GQD的全貌图;(B)为S-GQD的晶格图;(C)为COF;(D)为 AuNPs@COF;
图4为实施例3中COF、AuNPs@COF和GQDs的XPS图;图4中(A)为 S-GQD的总体XPS图,(B)和(C)分别为C1S和S2P的XPS图;(D)为 AuNPs@COF中Au4f的XPS图,(E)为未负载金纳米粒子的COF的总体XPS 图,(F)为AuNPs@COF的总体XPS图;
图5为不同浓度的银环蛇毒浓度的吸光度图;
图6为在图5不同浓度的银环蛇毒吸光度所对应的工作曲线;
图7为实施例3所得传感器各项参数筛选结果;图7中(A)为时间筛选结果,(B)为pH值筛选结果;(C)为该传感器的选择性实验;(D)为此传感器对信号分子的选择性实验图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针,包括银环蛇β毒素适配体和与所述银环蛇β毒素适配体化学结合的AuNPs/COF纳米复合材料。
在本发明中,所述银环蛇β毒素适配体适配体即在3'端修饰巯基的β型适配体,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示: GTTTTCCCCTTGTCGCTTTTGGTTCGTTCTGCCTCTATCT。
在本发明中,银环蛇β毒素适配体具有易于功能化的优点,本发明利用适配体替代抗体,能够提高了生物探针及其传感器的特异性。
在本发明中,所述AuNPs/COF纳米复合材料为负载有金纳米粒子的共价有机框架(COF)纳米片。在本发明中,所述COF纳米片的直径优选为 80~120nm,更优选为100nm;所述金纳米粒子的粒径优选为5~10nm,更优选为6~8nm。
在本发明中,所述基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针的制备方法,包括以下步骤:
(1)将1,3,5-三(4-氨苯基)苯、2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛、醋酸与有机溶剂混合,进行溶剂热反应,得到共价有机框架材料;
(2)将所述共价有机框架材料与醇溶剂、HAuCl4、还原剂混合,进行还原反应,得到AuNPs/COF纳米复合材料;
(3)将所述AuNPs/COF纳米复合材料与修饰有巯基的银环蛇β毒素适配体混合,得到基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针。
本发明将1,3,5-三(4-氨苯基)苯、2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛、醋酸与有机溶剂混合,进行溶剂热反应,得到共价有机框架材料(COF)。在本发明中,所述1,3,5-三(4-氨苯基)苯与2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛的摩尔比优选为1:1~5,更优选为1:2~4。
在本发明中,所述有机溶剂优选为1,4-二恶烷、丁醇和甲醇的混合物,所述1,4-二恶烷、丁醇和甲醇的体积比优选为4:4:1。在本发明中,所述有机溶剂为1,4-二恶烷、丁醇和甲醇的共溶体系,能够良好溶解原料并分散COF,促进COF的均匀形成。
在本发明中,所述混合的方式优选为:
先将1,3,5-三(4-氨苯基)苯、2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛、有机溶剂超声混合,再加入醋酸。在本发明中,所述1,3,5-三(4-氨苯基)苯的物质的量与有机溶剂的体积比优选为1mmol:150mL。在本发明中,所述超声混合的功率优选为400W,时间优选为20~30min。
在本发明中,所述醋酸优选以醋酸水溶液的形式加入,所述醋酸水溶液的浓度优选为12mol/L。在本发明中,所述有机溶剂与醋酸水溶液的体积比优选为9:1。在本发明中,所述醋酸起到提供酸性环境并起到催化合成COF 的效果。
在本发明中,所述溶剂热反应的温度优选为60~80℃,更优选为70℃;时间优选为18~30h,更优选为22~26h。
所述溶剂热反应后,本发明优选对所得溶剂热反应液依次进行固液分离、洗涤和干燥,得到共价有机框架材料。在本发明中,所述固液分离的方式优选为离心;所述洗涤用洗涤剂优选为四氢呋喃和丙酮。在本发明中,所述干燥的方式优选为真空干燥,所述真空干燥的时间优选为24h。
得到所述共价有机框架材料后,本发明将所述共价有机框架材料与醇溶剂、HAuCl4、还原剂混合,进行还原反应,得到AuNPs/COF纳米复合材料。
在本发明中,所述还原剂优选为NaBH4。在本发明中,所述共价有机框架材料与HAuCl4的质量比范围优选为15~20:1,更优选为16~18:1。在本发明中,所述HAuCl4与NaBH4的摩尔比优选为1:25。
在本发明中,所述醇溶剂优选为甲醇。在本发明中,所述共价有机框架材料与醇溶剂混合后,本发明优选调节所得混合液的pH值至3~4,调节pH 值使用的pH值调节剂优选为盐酸。
在本发明中,所述还原反应的温度优选为0~4℃,更优选为1~2℃,时间优选为3~7h,更优选为4~6h。
所述还原反应后,本发明优选对所得还原反应液进行固液分离、洗涤和干燥,得到AuNPs/COF纳米复合材料固体。在本发明中,所述固液分离的方式优选为离心;所述洗涤用洗涤剂优选为甲醇。在本发明中,所述干燥的方式优选为真空干燥,所述真空干燥的温度优选为70℃,时间为24h。
得到所述AuNPs/COF纳米复合材料后,本发明将所述AuNPs/COF纳米复合材料与修饰有巯基的银环蛇β毒素适配体混合,得到基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针。本发明优选将AuNPs/COF纳米复合材料分散于磷酸盐缓冲生理盐水中,再与修饰有巯基的银环蛇β毒素适配体混合。
在本发明中,所述AuNPs/COF纳米复合材料与修饰有巯基的银环蛇β毒素适配体的质量比范围优选为2~4:1,更优选为3:1。
本发明对所述修饰有巯基的银环蛇β毒素适配体的来源没有特殊的要求,使用本领域常规市售的修饰有巯基的银环蛇β毒素适配体或自行制备均可。在本发明中,所述修饰有巯基的银环蛇β毒素适配体购自擎科生物,型号为C107018179,核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示: GTTTTCCCCTTGTCGCTTTTGGTTCGTTCTGCCTCTATCT,在3'端修饰巯基。
在本发明中,所述混合的方式优选为振荡混合,所述混合的时间优选为 8~12h。所述混合后,本发明优选对混合液进行离心,除去未结合的适配体。
在本发明中,所述基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针优选置于 PBS溶液中保存,所述PBS溶液的浓度优选为10mM,pH值优选为7.4,含1%BSA,下同。
本发明提供了一种检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
将银环蛇β毒素抗体溶液、非特异性蛋白、银环蛇β毒素抗原溶液、权利要求1所述的基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针进行孵育,得到孵育产物;
将所述孵育产物与对硝基苯酚、掺硫石墨烯碳量子点分散液混合,得到检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器。
本发明将银环蛇β毒素抗体溶液、非特异性蛋白、银环蛇β毒素抗原溶液、基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针进行孵育,得到孵育产物。在本发明中,所述非特异性蛋白优选为牛血清蛋白。
在本发明中,所述孵育优选包括:
将银环蛇β毒素抗体溶液在孵育器中进行第一孵育,洗去未结合物质后得到第一孵育产物;
向所述第一孵育产物中加入非特异性蛋白,进行第二孵育,洗去未结合物质后得到第二孵育产物;
向所述第二孵育产物中加入银环蛇β毒素抗原溶液,进行第三孵育,洗去未结合物质后得到第三孵育产物;
向所述第三孵育产物中加入基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针,进行第四孵育,洗去未结合物质后得到孵育产物。
在本发明中,所述孵育器优选为96孔酶标板。在所述第一孵育前,本发明优选对所述酶标板进行前处理。在本发明中,所述前处理优选包括:
依次使用纯水、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液进行清洗。
本发明将银环蛇β毒素抗体溶液在酶标板中进行第一孵育,洗去未结合物质后得到第一孵育产物。在本发明中,所述银环蛇β毒素抗体溶液的浓度优选为80~300ng/mL,更优选为100~200ng/mL;加入量优选为50~200μL,更优选为100~150μL。在本发明中,所述第一孵育的温度优选为4℃,时间优选为8~12h。
在本发明中,所述洗去未结合物质的方式优选为磷酸盐缓冲液洗涤,所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为7.2;所述洗涤的次数优选为3次。
本发明向所述第一孵育产物中加入非特异性蛋白,进行第二孵育,洗去未结合物质后得到第二孵育产物。在本发明中,所述非特异性蛋白优选为牛血清蛋白,所述非特异性蛋白的浓度优选为1wt%。
在本发明中,所述第二孵育的温度优选为室温,时间优选为1h。在本发明中,所述洗去未结合物质的方式优选为磷酸盐缓冲液洗涤,所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为7.2;所述洗涤的次数优选为3次。
本发明向所述第二孵育产物中加入银环蛇β毒素抗原溶液,进行第三孵育,洗去未结合物质后得到第三孵育产物。在本发明中,所述银环蛇β毒素抗原溶液的浓度优选为0.001~100ng/mL,加入量优选为100~300μL,更优选为150~200μL。
在本发明中,所述第三孵育的温度优选为25~37℃,更优选为38~32℃;时间优选为1~3h,更优选为2h。
在本发明中,所述洗去未结合物质的方式优选为磷酸盐缓冲液洗涤,所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为7.2;所述洗涤的次数优选为3次。
本发明向所述第三孵育产物中加入基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针,进行第四孵育,洗去未结合物质后得到孵育产物。
在本发明中,所述基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针的浓度优选为0.02mg/mL,加入量优选为50~200μL,更优选为100~150μL。
在本发明中,所述洗去未结合物质的方式优选为磷酸盐缓冲液洗涤,所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为7.2;所述洗涤的次数优选为3次。
所述孵育后,本发明将所述孵育产物与对硝基苯酚、掺硫石墨烯碳量子点分散液混合,得到检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器。在本发明中,所述对硝基苯酚的浓度优选为0.2mmol,加入量优选为100~300μL,更优选为200μL;所述掺硫石墨烯碳量子点分散液的浓度优选为1~2μg/mL,加入量优选为100~300μL,更优选为200μL。
在本发明中,所述掺硫石墨烯碳量子点(S-GQD)的制备方法,优选包括以下步骤:
将巯基丙酸与柠檬酸混合,依次进行热处理、透析和冻干,得到掺硫石墨烯碳量子点。在本发明中,所述巯基丙酸与柠檬酸的质量比优选为1: 5.5~7,优选为1:6。在本发明中,所述热处理的温度优选为200℃,时间优选为45~60min,更优选为50~55min。
在本发明中,所述透析袋的截留分子量优选为1000。在本发明中,所述透析的时间优选为3天,每6~8h换水透析,透析袋内得到掺硫石墨烯碳量子点。
本发明对所述冻干没有特殊的要求,使用本领域技术人员熟知的冻干方式即可。
得到所述掺硫石墨烯碳量子点后,本发明优选将其分散于超纯水中保存。
本发明提供了上述制备方法制备得到的检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器,所述比例型化学生物免疫传感器的检测的检测范围优选为 0.001~100ng/mL,检测下限优选为300fg/mL。
本发明提供了一种基于比例型双信号的银环蛇毒检测方法,包括以下步骤:
以待测样品替换银环蛇β毒素抗原溶液,按照上述制备方法制备检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器;
取样所述检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器内的液体,测试液体在320nm处、400nm处的吸光度峰值,获得待测样品的吸光度比值,所述吸光度比值为320nm处吸光度与400nm处的吸光度的比值;
根据预定的标准曲线和待测样品的吸光度比值得到待测样品中银环蛇毒浓度;所述标准曲线为银环蛇毒浓度的对数与吸光度比值算数平方根的线性关系曲线。
在本发明中,所述待测样品优选为血清样品。在本发明中,所述待测样品的取样量优选为100~300μL,更优选为200μL。在本发明中,制备检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器的方法与上文相同,在此不再赘述。
本发明取样所述检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器内的液体,测试液体在320nm处、400nm处的吸光度峰值,获得待测样品的吸光度比值,所述吸光度比值为320nm处吸光度与400nm处的吸光度的比值。本发明优选使用紫外分光光度计测定吸光度峰值。
本发明根据标准曲线和待测样品的吸光度比值得到待测样品中银环蛇毒浓度;所述标准曲线为银环蛇毒浓度的对数与吸光度比值算数平方根的线性关系曲线。
作为本发明的一个具体实施例,所述标准曲线的绘制方法包括:
提供梯度浓度的银环蛇β毒素的标准品溶液,所述梯度浓度包括0.0032、 0.01、0.1、1、3.2、10、32、100ng/mL;
以梯度浓度的银环蛇β毒素的标准品溶液制备比例型化学生物免疫传感器,获得对应比例型化学生物免疫传感器内样品在320nm处、400nm处的吸光度峰值以及吸光度比值,以银环蛇毒浓度的对数为横坐标,以吸光度比值算数平方根为纵坐标绘图,得到银环蛇毒浓度的对数与吸光度比值算数平方根的线性关系曲线,具体数据见表1。
表1吸光度峰值、吸光度比值以及标准曲线
下面结合实施例对本发明提供的检测银环蛇毒检测生物探针及生物免疫传感器和基于比例型信号的检测银环蛇毒的方法进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器的制备方法,具体步骤如下:
(1)AuNPs@COF的制备:将0.030mmol的1,3,5-三(4-氨苯基)苯和 0.030mmol的2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛一起加入4.5mL的1,4-二恶烷-丁醇- 甲醇(V1/V2/V3,4:4:1)共溶剂体系中。然后,将混合物超声20min,得到均匀的混合溶液。取0.050mL 12M醋酸水溶液滴加后,于室温放置2h,随后加入0.45mL的12M的醋酸水溶液,于70℃加热24h。最后,将产品冷却至室温,并将合成的COF使用四氢呋喃和丙酮洗涤3次,真空干燥24h。取所得COF(0.060g)加入30mL甲醇中,加入盐酸调节pH至4,然后缓慢滴加200μL 1%的HAuCl4·4H2O于混合溶液中,在0℃下搅拌5h,同样条件下加入2mL新鲜制备的NaBH4甲醇溶液(0.20M)搅拌3h,所得沉淀物离心后使用甲醇洗涤三次,在真空干燥箱于70℃下干燥24h即可得到黄色粉末。
(2)β-Apt生物探针复合物的制备:将1mg AuNPs@COF纳米酶分散于5 mL磷酸盐缓冲生理盐水中(PBS,10mM,pH 7.4),超声10min至均匀分散。加入100μL的修饰有巯基的β-Apt溶液(4.5mg/mL),震荡过夜后离心法去除未结合适配体。最后,将纳米酶重新分散在5mL的PBS溶液中(10mM,pH 7.4,含1%BSA),稀释10倍用于下一步ELISA中。
(3)S-GQD的制备:取0.3mL巯基丙酸和1g柠檬酸至高压反应釜中,并于200℃下加热45min后取出,置入已活化好的1000分子量的透析袋中,透析3d,每6~8h换水透析。透析完毕后冷冻干燥,溶于2mL超纯水中,稀释10 倍后可用于下一步检测。
(4)准备标准96孔酶标板,依次使用纯水、pH=7.2的磷酸盐缓冲液进行清洗,将100μL浓度为200ng/mL的银环蛇β毒素抗溶液加入处理过的酶标孔中,在4℃下过夜放置孵育;
(5)使用pH=7.2的磷酸盐缓冲液对(4)中酶标孔缓慢清洗三次,加入 1%的牛血清蛋白(BSA)溶液进行封闭,1h后再次使用pH=7.2的磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次;
(6)将200μL浓度为0.001~100ng/mL的银环蛇毒溶液依次加入(5)处理过的酶标孔中,37℃孵育2h后,使用pH=7.2的磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次;
(7)将100μLβ-Apt金纳米粒子负载共价有机框架纳米复合材料分散液加入(6)所处理的酶标孔中,37℃下孵育1h后,使用pH=7.2的磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次,加入200μL0.2mM对硝基苯酚溶液和100μL 2μg/mL的 S-GQD溶液中,调节pH至7.0,25℃下放置30min。
所述银环蛇毒比例型化学免疫传感器的应用方法,具体步骤如下:
(1)取酶标孔中混合溶液于微量比色皿中,置于紫外分光光度计进行测试,扫描范围为200~500nm,将分别在320nm和400nm范围处出现双峰,记录吸光度峰值;
(2)记录不同浓度下的银环蛇毒所对应的吸光度峰值;
(3)利用标准曲线法取得待测样品中银环蛇毒浓度,不断降低银环蛇毒β毒素浓度进行尝试,直至吸光度变化无明显变化,此时银环蛇毒β毒素浓度为检测下限,为300fg/mL(S/N=3),取吸光度比值平方根呈线性变化的范围即为线性检测范围,为0.001~100ng/mL。
实施例2
一种检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器的制备方法,具体步骤如下:
(1)AuNPs@COF的制备:将0.030mmol的1,3,5-三(4-氨苯基)苯和 0.040mmol的2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛一起加入4.5mL的1,4-二恶烷-丁醇- 甲醇(V1/V2/V3,4:4:1)共溶剂体系中。然后,将混合物超声20min,得到均匀的混合溶液。取0.050mL 12M醋酸水溶液滴加后,于室温放置2h,随后加入0.45mL的12M的醋酸水溶液,于70℃加热24h。最后,将产品冷却至室温,并将合成的COF使用四氢呋喃和丙酮洗涤3次,真空干燥24h。取所得COF(0.060g)加入30mL甲醇中,加入盐酸调节pH至4,然后缓慢滴加200μL 1%的HAuCl4·4H2O于混合溶液中,在0℃下搅拌5h,同样条件下加入2mL新鲜制备的NaBH4甲醇溶液(0.20M)搅拌3h,所得沉淀物离心后使用甲醇洗涤三次,在真空干燥箱于70℃下干燥24h即可得到黄色粉末。
(2)β-Apt生物探针复合物的制备:将1mg AuNPs@COF纳米酶分散于5 mL磷酸盐缓冲生理盐水中(PBS,10mM,pH 7.4)超声10min至均匀分散。加入100μL的修饰有巯基的β-Apt溶液(4.5mg/mL),震荡过夜后离心法去除未结合适配体。最后,将纳米酶重新分散在5mL的PBS溶液中(10mM,pH 7.4,含1%BSA),稀释10倍用于下一步ELISA中。
(3)S-GQD的制备:取0.3mL巯基丙酸和1g柠檬酸至高压反应釜中,并于200℃下加热45min后取出,置入已活化好的1000分子量的透析袋中,透析3d,每6-8h换水透析。透析完毕后冷冻干燥,溶于2mL超纯水中,稀释10 倍后可用于下一步检测。
(4)准备标准96孔酶标板,依次使用纯水、pH=7.2的磷酸盐缓冲液进行清洗,将100μL浓度为200ng/mL的银环蛇β毒素抗溶液加入处理过的酶标孔中,在4℃下过夜放置孵育;
(5)使用pH=7.2的磷酸盐缓冲液对(4)中酶标孔缓慢清洗三次,加入 1%的牛血清蛋白(BSA)溶液进行封闭,1h后再次使用pH=7.2的磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次;
(6)将200μL浓度为0.001~100ng/mL的银环蛇毒溶液依次加入(5)处理过的酶标孔中,37℃孵育2h后,使用pH=7.2的磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次;
(7)将100μLβ-Apt金纳米粒子负载共价有机框架纳米复合材料分散液加入(6)所处理的酶标孔中,37℃下孵育1h后,使用pH=7.2的磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次,加入200μL0.2mM对硝基苯酚溶液和100μL 2μg/mL的 S-GQD溶液中,调节pH至7.0,25℃下放置30min。
本发明所述银环蛇毒比例型化学免疫传感器的应用方法,具体步骤如下:
(1)取酶标孔中混合溶液于微量比色皿中,置于紫外分光光度计进行测试,扫描范围为200~500nm,将分别在320nm和400nm范围处出现双峰,记录吸光度峰值;
(2)记录不同浓度下的银环蛇毒所对应的吸光度峰值;
(3)利用标准曲线法取得待测样品中银环蛇毒浓度,检测范围为 0.001~100ng/mL,LOD达到300fg/mL(S/N=3)。
实施例3
一种检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器的制备方法,具体步骤如下:
(1)AuNPs@COF的制备:将0.030mmol的1,3,5-三(4-氨苯基)苯和 0.045mmol的2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛一起加入4.5mL的1,4-二恶烷-丁醇- 甲醇(V1/V2/V3,4:4:1)共溶剂体系中。然后,将混合物超声20min,得到均匀的混合溶液。取0.050mL 12M醋酸水溶液滴加后,于室温放置2h,随后加入0.45mL的12M的醋酸水溶液,于70℃加热24h。最后,将产品冷却至室温,并将合成的COF使用四氢呋喃和丙酮洗涤3次,真空干燥24h。取所得COF(0.060g)加入30mL甲醇中,加入盐酸调节pH至4,然后缓慢滴加200μL 1%的HAuCl4·4H2O于混合溶液中,在0℃下搅拌5h,同样条件下加入2mL新鲜制备的NaBH4甲醇溶液(0.20M)搅拌3h,所得沉淀物离心后使用甲醇洗涤三次,在真空干燥箱于70℃下干燥24h即可得到黄色粉末。
(2)β-Apt生物探针复合物的制备:将1mg AuNPs@COF纳米酶分散于5 mL磷酸盐缓冲生理盐水中(PBS,10mM,pH 7.4),超声10min至均匀分散。加入100μL的修饰有巯基的β-Apt溶液(4.5mg/mL),震荡过夜后离心法去除未结合适配体。最后,将纳米酶重新分散在5mL的PBS溶液中(10mM,pH 7.4,含1%BSA),稀释10倍用于下一步ELISA中。
(3)S-GQD的制备:取0.3mL巯基丙酸和1g柠檬酸至高压反应釜中,并于200℃下加热45min后取出,置入已活化好的1000分子量的透析袋中,透析3d,每6~8h换水透析。透析完毕后冷冻干燥,溶于2mL超纯水中,稀释 10倍后可用于下一步检测。
(4)准备标准96孔酶标板,依次使用纯水、pH=7.2的磷酸盐缓冲液进行清洗,将100μL浓度为200ng/mL的银环蛇β毒素抗溶液加入处理过的酶标孔中,在4℃下过夜放置孵育;
(5)使用pH=7.2的磷酸盐缓冲液对(4)中酶标孔缓慢清洗三次,加入 1%的牛血清蛋白(BSA)溶液进行封闭,1h后再次使用pH=7.2的磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次;
(6)将200μL浓度为0.001-100ng/mL的银环蛇毒溶液依次加入(5)处理过的酶标孔中,37℃孵育2h后,使用pH=7.2的磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次;
(7)将100μLβ-Apt金纳米粒子负载共价有机框架纳米复合材料分散液加入(6)所处理的酶标孔中,37℃下孵育1h后,使用pH=7.0的磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次,加入200μL0.2mM对硝基苯酚溶液和100μL 2μg/mL的 S-GQD溶液中,调节pH至7.0,25℃下放置30min。
本发明所述银环蛇毒比例型化学免疫传感器的应用方法,具体步骤如下:
(1)取酶标孔中混合溶液于微量比色皿中,置于紫外分光光度计进行测试,扫描范围为200-500nm,将分别在320nm和400nm范围处出现双峰,记录吸光度峰值;
(2)记录不同浓度下的银环蛇毒所对应的吸光度峰值;
(3)利用标准曲线法取得待测样品中银环蛇毒浓度,检测范围为 0.001~100ng/mL,LOD达到300fg/mL(S/N=3)。
图1为实施例3步骤(1)中所制得的COF和AuNPs@COF的红外光谱图。由于COF和AuNPs@COF在红外可见光区都有特征吸收峰,因此红外可见吸收光谱可用于监控该复合物的合成情况。从图1中可知,COF在3420cm-1 (O-H)有吸收峰,AuNPs@COF光谱中显示金纳米粒560cm-1(Au)基团的特征峰,同时也存在3420cm-1(O-H)处的吸收峰,表明AuNPs@COF复合成功。
图2为实施例3步骤(2)中所制得的S-GQD的XPS图,证明其中有晶格存在,说明碳量子点合成成功。其中有尖而高的峰,说明存在一定的团聚现象。
图3为实施例3中COF、AuNPs@COF和GQDs的透射电镜图;图3中A为 S-GQD的全貌图;B为S-GQD的晶格图;C为COF;D为AuNPs@COF;如图 3中A所示,S-GQD呈点状均匀分布于溶液中,其中有部分团聚现象出现;图 3中B可看出其中存在S-GQD的晶格,其为标准的正六边形,边长大约为 0.004pm;图3中C可看出制备的COF呈薄片状结构;图3中D也可以看出在COF表面附有约5nm大小的AuNPs,说明纳米材料AuNPs@COF复合成功。
图4为实施例3中COF、AuNPs@COF和GQDs的XPS图;图4中A为S-GQD 的总体XPS图,B和C分别为C1S和S2P的XPS图;D为AuNPs@COF中Au4f的 XPS图,E为未负载金的COF的总体XPS图,F为AuNPs@COF的总体XPS图。从图4中A可以看出S-GQD中存在C、O、S,证明了掺S的碳量子点的成功合成;从图4中B中知碳原子在其中主要靠C-H和C-C连接(284eV),其中存在 C-S(286eV)说明了硫的成功掺杂;图4中C则说明硫原子在其中主要靠C-S 和S-S连接,都证实了S-GQD的成功合成。图4中D中说明有Au-H的存在,与图4E、4F都证实了Au的成功复合与AuNPs@COF的成功合成。
将实施例3中不同浓度的银环蛇β毒素(BGT)分别取0.0032、0.01、0.1、 1、3.2、10、32、100ng/mL,其他与实施例3相同,制备得到的化学生物免疫传感器的使用方法同实施例3,得到如图5所示的吸光度变化图。其中随着 BGT浓度的增加,320nm处峰值减小,400nm处峰值增加,得益于负载了Apt 的AuNPs@COF的含量的增加,催化了信号分子对硝基苯酚的还原,同时使溶液的pH增加。
取320nm和400nm两处峰值吸光度比值的算术平方根,可得其值在 0.001ng/mL~100ng/mL的浓度范围内与银环蛇β毒素浓度(ng/mL)的对数呈线性关系,如图6所示。基于AuNPs@COF纳米材料具有较大的孔径和良好的生物相容性和对S-GQD还原对硝基苯酚良好的催化性能,制备的比例型免疫传感器具有更低的背景值,更强的分析能力、更好的稳定性和更高的灵敏度。
图7中A和B分别为该比例型传感器的时间筛选和pH筛选。其中A为将实施例3步骤(7)的反应时间分别为1min、10min、20min、30min、40min、50min、 60min、70min、80min、90min、100min、110min、115min和120min时的吸光度值并记录,可以看出反应时间为30min时达到对信号分子对硝基苯酚还原的最快速度,之后还原速度降低,60min后还原速度进一步降低,100min 后几乎不再还原,故取30min为最佳反应时间。B为实施例3步骤将步骤(7)中调节pH分别调节至6.5、7.0、7.4和8.5,记录所得吸光度,观察峰形可得在 pH=7.0时所得峰形较好。
将实施例3中步骤(6)中银环蛇β毒素溶液分别使用超纯水作空白样及浓度均为1mM的牛血清蛋白溶液(BSA)、磷酸缓冲溶液(PBS)、葡萄糖溶液(Glu)、抗坏血酸溶液(AA)、脂肪酶溶液(Lip)、赖氨酸溶液(Lys)、 0.5ng/mL的银环蛇β毒素溶液(BGT)以及上述溶液的混合溶液代替,其他与实施例3相同,制备所得比例型化学生物传感器使用方法同实施例3,记录所得吸光度峰值如图7中C所示,可得该传感器对BGT具有良好的选择性和抗感染能力,具有实际应用潜力。将实施例3中步骤(2)所制得的S-GQD分别与0.2mM的邻硝基苯酚溶液(2-NP)、对硝基甲苯(4-NP)、三硝基苯酚(TNP)、苯酚(phenol)、对硝基苯酚(4-NP)以及上述溶液的混合溶液混合反应,置于紫外分光光度计进行测试,扫描范围为200~500nm,记录320nm处所得吸光度值如图7中D所示,说明S-GQD对4-NP具有良好的选择性,可选择4-NP 作为传感器的信号分子,增加了该传感器的稳定性和抗干扰能力,进一步提升了该设计的实际应用能力和双向选择的应用潜力。
将实施例(3)中步骤(6)中银环蛇β毒素溶液分别替换成含浓度为0.1、 1.0、100.0ng/mL银环蛇β毒素溶液的正常血清样品,其他与实施例3相同,制备所得比例型化学生物传感器使用方法同实施例3,进行加标回收,根据所得吸光度比值平方根和工作曲线计算得血清中银环蛇β毒素溶液浓度,其与标准浓度的偏差如表2所示,可得该传感器误差范围在5%以内,具有实际应用的可能性。
表2比例型传感器检测人工血清标本中β-BGT含量(n=3)
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 云南大学
<120> 一种检测银环蛇毒检测生物探针及生物免疫传感器和基于比例型信号的检测银环蛇毒的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttttcccct tgtcgctttt ggttcgttct gcctctatct 40
Claims (10)
1.一种基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针,包括银环蛇β毒素适配体和与所述银环蛇β毒素适配体化学结合的AuNPs/COF纳米复合材料。
2.权利要求1所述的生物探针的制备方法,包括以下步骤:
(1)将1,3,5-三(4-氨苯基)苯、2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛、醋酸与混合有机溶剂混合,进行溶剂热反应,得到共价有机框架材料;
(2)将所述共价有机框架材料与醇溶剂、HAuCl4、还原剂混合,进行还原反应,得到AuNPs/COF纳米复合材料;
(3)将所述AuNPs/COF纳米复合材料与修饰有巯基的银环蛇β毒素适配体混合,得到基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述1,3,5-三(4-氨苯基)苯与2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛的摩尔比为1:1~5。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述混合有机溶剂包括1,4-二恶烷、丁醇和甲醇;
所述溶剂热反应的温度为60~80℃,时间为18~30h。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述共价有机框架材料与HAuCl4的质量比为15~20:1。
6.根据权利要求2或5所述的制备方法,其特征在于,所述AuNPs/COF纳米复合材料与修饰有巯基的银环蛇β毒素适配体的质量比为2~4:1。
7.一种检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
将银环蛇β毒素抗体溶液、非特异性蛋白、银环蛇β毒素抗原溶液、权利要求1所述的或权利要求2~6任意一项所述制备方法制备得到的基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针进行孵育,得到孵育产物;
将所述孵育产物与对硝基苯酚、掺硫石墨烯碳量子点分散液混合,得到检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述孵育包括:
将银环蛇β毒素抗体溶液在孵育器中进行第一孵育,洗去未结合物质后得到第一孵育产物;
向所述第一孵育产物中加入非特异性蛋白,进行第二孵育,洗去未结合物质后得到第二孵育产物;
向所述第二孵育产物中加入银环蛇β毒素抗原溶液,进行第三孵育,洗去未结合物质后得到第三孵育产物;
向所述第三孵育产物中加入基于比例型双信号的银环蛇毒检测生物探针,进行第四孵育,洗去未结合物质后得到孵育产物。
9.权利要求7或8所述制备方法制备得到的检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器,所述比例型化学生物免疫传感器的检测的检测范围为0.001~100ng/mL,检测下限为300fg/mL。
10.一种基于比例型双信号的银环蛇毒检测方法,包括以下步骤:
以待测样品替换银环蛇β毒素抗原溶液,按照权利要求7或8所述制备方法制备检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器;
取样所述检测银环蛇毒的比例型化学生物免疫传感器内的液体,测试液体在320nm处、400nm处的吸光度峰值,获得待测样品的吸光度比值,所述吸光度比值为320nm处吸光度与400nm处的吸光度的比值;
根据预定的标准曲线和待测样品的吸光度比值得到待测样品中银环蛇毒浓度;所述标准曲线为银环蛇毒浓度的对数与吸光度比值算数平方根的线性关系曲线。
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CN114047341B (zh) | 2022-10-18 |
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