CN105588939A - MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置及制备方法 - Google Patents

MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置及其制备方法，属于医疗检测设备领域。由固相有高特异性MPO、H-FABP和cTnT抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体的硝酸纤维素膜、吸附有胶体金标记MPO、H-FABP和cTnT抗体的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成。采用多聚赖氨酸处理液对硝酸纤维素膜进行预处理，将MPO、H-FABP和cTnT抗体先与二氧化硅纳米颗粒结合再吸附到硝酸纤维素膜上，并配制合适的喷金缓冲液和样品垫处理液，在保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本，既能同时检测标本中MPO、H-FABP和cTnT三种心肌标志物，又没有增加生产操作的复杂度。检测试纸灵敏度高、特异性强、操作简便省时、实用性强。

Description

MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置及制备方法
技术领域
本发明涉及医疗检测设备领域，特别涉及一种MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置及其制备方法。利用胶体金免疫层析技术以及双抗体夹心法原理定量检测临床标本(全血/血清/血浆)中人髓过氧化物酶(MPO)、心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)的检测装置及其制备方法，可实现心肌标志物的灵敏、特异、快速检测。
背景技术
急性心肌梗塞(AMI)是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。随着生活水平的提高，其发病率成逐年上升的趋势，现已对人类健康和生存造成了重大的威胁，是世界上各国面临的社会问题。因而，对于因剧烈胸痛就医的患者，能够早期诊断急性心梗，尽早血运重建，抢救缺血心肌，减少急症病死率，改善患者预后方面有重大的临床意义。近年来诊断时间与治疗效果关系的报道提示，早期抢救缺血心肌可以减低病死率、缩减梗死面积与改善左室收缩功能。同时发现降低存活率的关键因素之一是延误抢救治疗时间。自急性冠状动脉闭塞到心肌发生透壁性坏死的时间约为6小时，这个时间窗内若能够采用适当方法将急性梗塞冠状动脉进行血运重建，濒临坏死心肌就能够得到挽救。相关资料提示，急性心梗发生后1小时内得到有效治疗，死亡率在1％以内，急性心梗发生后6小时内未得到有效治疗，死亡率上升至10-12％，可见6小时是及时诊断与治疗重要的时间窗，因此如何缩短急性心梗诊断的检测时间是医学研究的重要课题。
冠心病诊断检查技术发展迅速，除了ECG、血清生化指标、心肌损伤标志物之外，另有心脏彩超、心血管造影、核磁共振成像、计算机断层扫描等等。但是此类检查手段价格高昂，不适用于动态连续监测。上述各类检查手段中，ECG、心肌损伤标志物检测依然是临床价格最低廉、使用最广泛的方法，可是结果早期诊断急性心梗的特异性仅为90％左右，敏感性仅为45％左右，并且相当部分急性心梗的老年患者的ECG结果不会见到特异性ST-T改变。近年来的临床研究资料提示心肌脂肪酸结合蛋白、髓过氧化酶等标志物变化与急性冠脉综合征患者的诊断和预后相关。它们是新一代早期预警心脏生物标示物。髓过氧化物酶(MPO)是冠状动脉粥样硬化病灶不稳定和中性白细胞应激的标志物，也是早期预警信号。MPO是一种过氧化物酶，炎症时激活的嗜中性粒细胞发生脱颗粒并释放髓过氧化物酶，它能导致冠状动脉粥样硬化病灶不稳定甚至是破裂，使血管内皮下胶原组织暴露，随之发生血小板粘附聚集和血栓形成，造成冠状动脉阻塞，发生急性冠状动脉综合症，甚至是严重的心肌不可逆缺血损伤。大量临床研究资料表明，急性冠状动脉综合症的病人血清中髓过氧化物酶水平显著地升高，是预测冠心病患者发生不良心血管事件的一个新的预测因子。心脏型脂肪酸结合蛋白是一类存在于心肌细胞胞浆内可溶性蛋白质，正常人血浆中含量很低，心肌细胞损伤后，此类结合蛋白将会迅速释放入血，它的血浆浓度会在急性心梗发生后1-3小时内迅速上升，发生约8小时后达到峰值，12-24小时逐步降至正常水平，几乎不受其他组织的干扰；心肌肌钙蛋白(cTn)是组成横纹肌丝的结构蛋白，具有调节肌细胞收缩功能，其由三种不同基因的亚基：心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)和肌钙蛋白C(TnC)组成，在控制心肌收缩中起重要作用。健康者血清cTnT水平较低，在心肌细胞受损后3～4h释放入血，血清cTnT浓度升高10～50倍，甚至上百倍，并持续2周，所以它的有效诊断窗口宽至3小时-14天，是高灵敏度、高特异度的心肌损伤监测指标。
目前检测MPO、H-FABP3、cTnT的方法主要有酶联免疫法、化学发光法、免疫比浊法、金标免疫法等。金标免疫法需要标本量少，简便快速，适合于急性心肌梗死的快速检测，不受时间、地点的限制。MPO可以预警1-2月内心肌梗塞发生风险，但其他炎症也可导致MPO指标的升高。H-FABP仅能表示发生心肌梗塞后1-3小时的情况，不能在心肌梗塞发生前预警。
纵观已有产品和文献报道，它们均是针对单一指标进行控制，只能检测或预警心肌梗塞的某个阶段，而不能全面地、特异性地预警心肌梗塞的发生、发展全程。亟待改进。
胶体金免疫层析技术(goldimmunochromatographyassay，GICA)是一种将胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的固相膜免疫分析技术。胶体金免疫层析技术是一种常用的免疫层析检测方法，由于其操作简单、省时、制造成本较低、结果易判读等特点，非常适合于现场检测，广泛用于生物、医药、食品等领域。由于胶体金免疫层析技术是一步完成检测，因此检测过程的干扰因素较多，其灵敏度低是限制胶体金免疫层析应用范围的主要因素，传统的胶体金免疫层析技术的检测限高于ELISA等方法。
在胶体金免疫层析检测中，蛋白质固着于硝酸纤维素膜(NC膜)作为待测样本的捕获试剂。由于检测结果完全取决于捕获试剂在膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在膜上均一、良好的吸附对胶体金检测结果非常重要。如果NC膜上结合的蛋白量不足或者蛋白结合力不够强，就会出现相当多的问题，在检测结果的检测线上非常明显。如果膜上结合的蛋白量太低，那么在结果中检测线显色较弱而且检测灵敏度降低。如果蛋白不能牢固的吸附于NC膜，那么在蛋白吸附于NC膜以前发生扩散，从而导致检测线较宽、显色较弱而不是鲜艳而清晰，使检测结果难以解释。在极端条件下，如果蛋白与NC膜的物理吸附作用太弱，流过的蛋白检测物和表面活性剂溶液可能将固着的蛋白从NC膜上洗掉，从而显示较宽或者根本不清晰的检测线，难以解释检测结果。
发明内容
本发明提供一种MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置及制备方法，以解决现有技术存在的NC膜吸附蛋白量不足、结合力不强的问题。cTnT的有效诊断窗口宽至3小时-14天，因此发明检测装置对心肌梗塞预警及早期诊断具有重要价值。本发明制备的髓过氧化物酶(MPO)、心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)三合一联合检测装置，可实现心肌标记物的灵敏、特异、快速检测，提高了对急性心肌跟随患者进行心梗风险的合理综合判定，能够快速、准确进行心肌梗塞早期预警及病情风险判断。
本发明采取的技术方案是：
MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置，样品垫1、免疫胶体金玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5上，所述硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫胶体金玻璃纤维膜2搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述硝酸纤维素膜3上设置第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3和质控线C，所述的第一检测线T1上固相有高特异性MPO抗体，所述的第二检测线T2上固相有高特异性H-FABP抗体，所述的第三检测线T3上固相有高特异性cTnT抗体，所述的质控线C上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体。
本发明提供一种MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置的制备方法，包括如下步骤：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
(b)采用步骤(a)中制得的胶体金标记MPO、H-FABP和cTnT抗体，获得免疫胶体金；
(c)采用喷金缓冲液稀释步骤(b)的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理后，喷点与二氧化硅纳米颗粒结合的MPO、H-FABP和cTnT抗体作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
本发明步骤(a)所述的采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒粒径为20～60nm。
本发明步骤(c)所述的喷金缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5～20％，海藻糖浓度为1～5％，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％。
本发明步骤(d)所述的将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理是：用多聚赖氨酸处理液浸泡硝酸纤维素膜1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
本发明步骤(d)所述的二氧化硅纳米颗粒分别结合MPO、H-FABP和cTnT抗体是：以二氧化硅作为载体，分别取1mLMPO、H-FABP和cTnT抗体溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍。
本发明步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂聚氧乙烯月桂醚组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％，酪蛋白浓度为0.1～0.2％、表面活性剂聚氧乙烯月桂醚浓度为0.5～1％。
本发明步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)稀释到浓度为0.5％组成，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)所述的二氧化硅纳米颗粒制备方法：将2.48mL体积分数25的氨水和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35℃左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声5分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散，反复多次洗涤至近中性，最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine,PLL)的结构中含有多个氨基可供偶联,活化过程简单，方便NC膜表面固定蛋白。多聚赖氨酸带有大量的正电荷，可以显著增加NC膜上活性位点的正电荷数量，而抗体在常规包被条件下是带负电荷的，这样单位面积的NC膜上可以结合更多数量的抗体，这可以显著增加抗体的包被效率。常规条件下，单位面积的NC膜上结合抗体的数量是有限的，采用多聚赖氨酸处理之后，可以让单位面积的NC膜上结合抗体数量增加，进而可以实现更高的检测灵敏度。研究发现甲醇具有良好的重润湿性，可以保证在预处理NC膜的时候不产生气泡以免气泡的存在导致NC膜处理局部不充分，同时也能够活化NC膜，让NC膜带正电荷，这个与聚赖氨酸相似，两者协同作用，效果更好。PEG20000可与NC膜的位点发生吸附作用，在蛋白包被后，可以吸收蛋白的结合水，导致蛋白更加疏水，这样蛋白与NC膜的结合更加牢固，通过疏水作用明显提高蛋白的包被效率。综上，多聚赖氨酸、甲醇和PEG20000组合配方，可以从电荷作用和疏水作用两方面来提高NC膜蛋白的包被效率。
在改善NC膜对蛋白吸附基础上，探讨蛋白对NC膜吸附效果也是提高胶体金灵敏度的另一途径。二氧化硅纳米颗粒具有较好的稳定性、易于制备、生物相容性较好及较低的免疫原性等优势，在生物医学领域研究较为广泛。但在胶体金免疫层析技术中尚未有报道应用。本研究探讨了二氧化硅纳米颗粒对NC膜包被抗体的影响，先将划膜用的抗体先与二氧化硅纳米颗粒结合，封闭，离心纯化，去掉未结合的抗体，然后复溶到一定比例，然后划膜，这样一个二氧化硅粒子可以结合多个抗体，从而增加了包被抗体效率，灵敏度也会大大提高。又由于二氧化硅纳米颗粒是无色透明的，所以不会影响显色，只是借助其更大的表面积增加抗体的包被效率，提高胶体金实验的灵敏度。
为了提高胶体金免疫层析技术的灵敏度，我们通过对硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液进行了预处理，将包被NC的抗体与二氧化硅纳米颗粒结合，达到了提高试纸灵敏度的目的。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的检测装置结构新颖，将MPO、H-FABP和cTnT抗体包被于硝酸纤维膜膜上，特异性强，既能同时检测标本中MPO、H-FABP和cTnT，又没有增加生产操作的复杂度。
2、免疫胶体金制备步骤中，通过配合合适的喷金缓冲液和样品垫处理液，可保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。
3、本发明对硝酸纤维素膜进行预处理，对包被硝酸纤维素膜的抗体进行了修饰，提高了检测试纸灵敏度、特异性。
4、本发明的检测装置不需要任何特殊仪器设备，检测成本低。
5、本发明的检测装置操作简便，不需要专业人员操作。实用性强。
附图说明
图1是本发明的结构示意图。
具体实施方式
参见图1所示，本发明的MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置，样品垫1、免疫胶体金玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫胶体金玻璃纤维膜2搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述硝酸纤维素膜3上设置第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3和质控线C；所述的第一检测线T1上固相有高特异性MPO抗体，所述的第二检测线T2上固相有高特异性H-FABP抗体，所述的第三检测线T3上固相有高特异性cTnT抗体，所述的质控线C上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体。
本发明MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置的制备方法，包括下列步骤：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
(b)采用步骤(a)中制得的胶体金标记MPO、H-FABP和cTnT抗体，获得免疫胶体金；
(c)采用喷金缓冲液稀释步骤(b)的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理后，喷点与二氧化硅纳米颗粒结合的MPO、H-FABP和cTnT抗体作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
步骤(a)所述的采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒粒径为20～60nm。
步骤(a)所述的喷金缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5～20％，海藻糖浓度为1～5％，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％。
步骤(d)所述的将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理是：用多聚赖氨酸处理液浸泡硝酸纤维素膜1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
步骤(d)所述的二氧化硅纳米颗粒分别结合MPO、H-FABP和cTnT抗体是：以二氧化硅作为载体，分别取1mLMPO、H-FABP和cTnT抗体溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍。
步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂聚氧乙烯月桂醚组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％，酪蛋白浓度为0.1～0.2％、表面活性剂聚氧乙烯月桂醚浓度为0.5～1％。
步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸稀释到浓度为0.5％组成，经0.22μm滤膜过滤，多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，备用。
步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，经0.22μm滤膜过滤，多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，备用。
步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，备用。
步骤(d)所述的二氧化硅纳米颗粒制备方法：将2.48mL氨水(体积分数25)和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35℃左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声5分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散，反复多次洗涤至近中性，最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
实施例1：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金
在加热的100ml纯化水中快速加入氯化金，待溶液再次沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠，氯化金：柠檬酸三钠1：0.5，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续加热10分钟即可，胶体金颗粒为20nm；
(b)免疫胶体金制备
1)分别取100毫升20nm胶体金溶液，加入pH调节剂140μl，混匀；静置5min；
2)在20nm胶体金溶液中，按照每毫升胶体金溶液14μg的比例分别加入MPO、H-FABP和cTnT抗体，共1.4mg，混匀；静置5min；
3)分别按照0.4％的比例加入胶体金稳定剂0.4毫升，混匀，静置5分钟；
4)10000、12000、14000rpm离心10min，分别收集沉淀，合并三次收集的沉淀；
(c)、采用优化的喷金缓冲液稀释免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体玻璃纤维膜；所述的喷金缓冲液包括：浓度为20mMTris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、BSA浓度为1％，pH为8.5；
(d)、固相硝酸纤维素膜
1)多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜
配制多聚赖氨酸处理液：多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)、浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入多聚赖氨酸处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)二氧化硅纳米颗粒修饰MPO、H-FABP和cTnT抗体
二氧化硅纳米颗粒制备：将2.48mL体积分数25的氨水和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35℃左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声5分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散.反复多次洗涤至近中性，最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用；
二氧化硅纳米颗粒修饰MPO、H-FABP和cTnT抗体：
以二氧化硅作为载体，分别取1mLMPO、H-FABP和cTnT抗体溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍；
3)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将二氧化硅纳米颗粒-MPO抗体、二氧化硅纳米颗粒-H-FABP和二氧化硅纳米颗粒-cTnT稀释至1.5mg/ml，质控线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用；
4)、样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其种样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5％、酪蛋白浓度为0.1％、表面活性剂浓度为0.5％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
e、组装
将预处理的样品垫、免疫胶体金玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
f、定量检测：通过胶体金检测仪检测，本联合检测装置检测人MPO最低检测浓度为5ng/ml、H-FABP最低检测浓度为5ng/ml、cTnT最低检测浓度为0.1ng/ml。
实施例2：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金
在加热的100ml纯化水中快速加入氯化金，待溶液再次沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠，氯化金：柠檬酸三钠1：1，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续加热10分钟即可，胶体金颗粒为40nm；
(b)免疫胶体金制备
1)分别取100毫升40nm胶体金溶液，加入pH调节剂140μl，混匀；静置5min；
2)在20nm胶体金溶液中，按照每毫升胶体金溶液14μg的比例分别加入MPO、H-FABP和cTnT抗体，共1.4mg，混匀；静置5min；
3)分别按照0.4％的比例加入胶体金稳定剂0.4毫升，混匀，静置5分钟；
4)10000、12000、14000rpm离心10min，分别收集沉淀，合并三次收集的沉淀；
(c)、采用优化的喷金缓冲液稀释免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体玻璃纤维膜；所述的喷金缓冲液包括：浓度为20mMTris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、BSA浓度为1％，pH为8.5；
(d)、固相硝酸纤维素膜
1)多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜
配制多聚赖氨酸处理液：多聚赖氨酸(SIGMA,200KD)、浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入多聚赖氨酸处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)二氧化硅纳米颗粒修饰MPO、H-FABP和cTnT抗体
二氧化硅纳米颗粒制备：将2.48mL体积分数25的氨水和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35℃左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴人3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声5分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散.反复多次洗涤至近中性。最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用；
二氧化硅纳米颗粒修饰MPO、H-FABP和cTnT抗体：
以二氧化硅作为载体，分别取1mLMPO、H-FABP和cTnT抗体溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍；
3)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将二氧化硅纳米颗粒-MPO抗体、二氧化硅纳米颗粒-H-FABP和二氧化硅纳米颗粒-cTnT稀释至1.5mg/ml，质控线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用；
4)、样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其种样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5％、酪蛋白浓度为0.1％、表面活性剂浓度为0.5％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
e、组装
将预处理的样品垫、免疫胶体金玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
f、定量检测：通过胶体金检测仪检测，本联合检测装置检测人MPO最低检测浓度为5.5ng/ml、H-FABP最低检测浓度为5.5ng/ml、cTnT最低检测浓度为0.15ng/ml。
实施例3：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金
在加热的100ml纯化水中快速加入氯化金，待溶液再次沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠，氯化金：柠檬酸三钠1：0.5，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续加热10分钟即可，胶体金颗粒为20nm；
(b)免疫胶体金制备
1)分别取100毫升20nm胶体金溶液，加入pH调节剂140μl，混匀；静置5min；
2)在20nm胶体金溶液中，按照每毫升胶体金溶液14μg的比例分别加入MPO、H-FABP和cTnT抗体，共1.4mg，混匀；静置5min；
3)分别按照0.4％的比例加入胶体金稳定剂0.4毫升，混匀，静置5分钟；
4)10000、12000、14000rpm离心10min，分别收集沉淀，合并三次收集的沉淀；
(c)、采用优化的喷金缓冲液稀释免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体玻璃纤维膜；所述的喷金缓冲液包括：浓度为20mMTris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、BSA浓度为1％，pH为8.5；
(d)、固相硝酸纤维素膜
1)多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜
配制多聚赖氨酸处理液：多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)、浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入多聚赖氨酸处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)二氧化硅纳米颗粒修饰MPO、H-FABP和cTnT抗体
二氧化硅纳米颗粒制备：将2.48mL体积分数25的氨水和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35℃左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声5分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散.反复多次洗涤至近中性，最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用；
二氧化硅纳米颗粒修饰MPO、H-FABP和cTnT抗体：
以二氧化硅作为载体，分别取1mLMPO、H-FABP和cTnT抗体溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍；
3)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将二氧化硅纳米颗粒-MPO抗体、二氧化硅纳米颗粒-H-FABP和二氧化硅纳米颗粒-cTnT稀释至1.5mg/ml，质控线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用；
4)、样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其种样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5％、酪蛋白浓度为0.1％、表面活性剂浓度为0.5％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
e、组装
将预处理的样品垫、免疫胶体金玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳；
f、定量检测：通过胶体金检测仪检测，本联合检测装置检测人MPO最低检测浓度为6ng/ml、H-FABP最低检测浓度为6ng/ml、cTnT最低检测浓度为0.2ng/ml。
实施例4：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
其余同实施例2。
实施例5：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,200KD)与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
其余同实施例2。
实施例6：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,300KD)与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
其余同实施例2。
实施例7：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
其余同实施例2。
实施例8：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,200KD)、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
其余同实施例2。
实施例9：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,300KD)、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
其余同实施例2。
下边通过实验来进一步说明本发明的效果。
实验例1：
1、多聚赖氨酸处理液对硝酸纤维素膜蛋白吸附能力的比较
1.1材料与方法
1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司，多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)购自Sigma公司
1.2硝酸纤维素膜处理方法
1.2.1配制多聚赖氨酸处理液
配制三种多聚赖氨酸处理液：多聚赖氨酸组，多聚赖氨酸浓度为0.5％组成；多聚赖氨酸处理液甲醇组，多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％；多聚赖氨酸、甲醇和PEG20000组，，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.1％，三组处理液均经0.22μm滤膜过滤，备用。
1.2.2硝酸纤维素膜处理方法
将硝酸纤维素膜放入多聚赖氨酸处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
1.3实验方法
分别将未处理和已处理过的硝酸纤维素膜按照上述实施例工艺流程制备MPO、H-FABP和cTnT联合检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较硝酸纤维素膜未处理和处理后吸附力和稳定性指标差异。
1.4结果
1.4.1蛋白吸附力比较
取3组处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察显色情况判断处理后膜对蛋白吸附能力，结果见表1。结果显示，处理后的硝酸纤维素膜在溶液浸润性方面要明显优于未处理膜，处理后膜阳性条带颜色略深，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明蛋白吸附能力明显增强，提高了反应灵敏度。多聚赖氨酸、甲醇和PEG20000处理组吸附效果明显优于多聚赖氨酸组和多聚赖氨酸甲醇组。
表1硝酸纤维素膜吸附能力比较
1.4.2硝酸纤维素膜稳定性比较
取3组处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察显色情况来判断处理后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表2。表2结果与表1结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表2硝酸纤维素膜加速稳定性比较(37℃放置10天)
实验例2：
2、二氧化硅纳米颗粒修饰MPO、H-FABP和cTnT抗体
2.1材料与方法
2.1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司，正硅酸乙酯购自汕头陇西化工厂
2.1.2二氧化硅纳米颗粒制备
将2.48mL氨水(体积分数25)和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35℃左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴人3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声5分钟，即可制得粒径均一的粒子(120nm)。分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散.反复多次洗涤至近中性。最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
2.1.3二氧化硅纳米颗粒修饰MPO、H-FABP和cTnT抗体
以二氧化硅作为载体，取1mLMPO、cTnI和NT-proBNP抗体溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍。
2.3实验方法
分别将二氧化硅纳米颗粒修饰的MPO、H-FABP和cTnT抗体与未修饰的MPO、H-FABP和cTnT体按照上述实施例工艺流程制备MPO、H-FABP和cTnT联合检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较二氧化硅纳米颗粒处理和未处理对蛋白吸附力和稳定性指标差异。
2.4结果
2.4.1蛋白吸附力比较
取二氧化硅纳米颗粒处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察显色情况判断处理后膜对蛋白吸附能力，结果见表3。结果显示，二氧化硅纳米颗粒修饰组膜阳性条带颜色略深，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明蛋白吸附能力明显增强，提高了反应灵敏度。
表3二氧化硅纳米颗粒修饰对蛋白吸附能力比较
2.4.2稳定性比较
取二氧化硅纳米颗粒处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察显色情况来判断二氧化硅修饰后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表4。表4结果与表3结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表4加速稳定性比较(37℃放置10天)
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置，其特征在于：样品垫(1)、免疫胶体金玻璃纤维膜(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4)分别粘贴在塑料板(5)上，所述硝酸纤维素膜(3)的两端分别与吸收垫(4)、免疫胶体金玻璃纤维膜(2)搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜(2)的另一端与样品垫(1)搭接；所述硝酸纤维素膜(3)上设置第一检测线(T1)、第二检测线(T2)、第三检测线(T3)和质控线C，所述的第一检测线(T1)上固相有高特异性MPO抗体，所述的第二检测线(T2)上固相有高特异性H-FABP抗体，所述的第三检测线(T3)上固相有高特异性cTnT抗体，所述的质控线(C)上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体。
2.一种如权利要求1所述MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
(b)采用步骤(a)中制得的胶体金标记MPO、H-FABP和cTnT抗体，获得免疫胶体金；
(c)采用喷金缓冲液稀释步骤(b)的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理后，喷点与二氧化硅纳米颗粒结合的MPO、H-FABP和cTnT抗体作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
3.根据权利要求2所述的MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(a)所述的采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒粒径为20～60nm。
4.根据权利要求2所述的MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(c)所述的喷金缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5～20％，海藻糖浓度为1～5％，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％。
5.根据权利要求2所述的MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理是：用多聚赖氨酸处理液浸泡硝酸纤维素膜1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
6.根据权利要求2所述的MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的二氧化硅纳米颗粒分别结合MPO、H-FABP和cTnT抗体是：以二氧化硅作为载体，分别取1mLMPO、H-FABP和cTnT抗体溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍。
7.根据权利要求2所述的MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂聚氧乙烯月桂醚组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％，酪蛋白浓度为0.1～0.2％、表面活性剂聚氧乙烯月桂醚浓度为0.5～1％。
8.根据权利要求2或5所述的MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸稀释到浓度为0.5％组成，经0.22μm滤膜过滤，其中多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，备用。
9.根据权利要求2或5所述的MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为5％，经0.22μm滤膜过滤，其中多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，备用。
10.根据权利要求2或5所述的MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，其中多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，备用。
11.根据权利要求2所述的MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的二氧化硅纳米颗粒制备方法：将2.48mL体积分数25的氨水和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35℃和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声5分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散，反复多次洗涤至近中性，最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
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