CN102735835B - 一种一次性全血尿酸检测试纸条及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种一次性全血尿酸检测试纸条，还提供了该检测试纸的制造方法。这种试纸条采用了先进的免疫胶体金技术，检测时无需专业人员，也不依赖大型仪器设备，病人或其家人即可操作，能随时快速检测血液中尿酸浓度，该试纸的检测范围为5～25mg/dL，检测时间＜60s。

Description

一种一次性全血尿酸检测试纸条及其制造方法

技术领域

本发明设计一种检测试纸条，特别是一种一次性全血尿酸检测试纸条。 

背景技术

尿酸作为一种小分子化合物，其检测方法也同其他小分子化合物一样，经历着相似的发展过程，由初期的酶法或化学法，到各种仪器法，再到生物检测法。随着科技的发展及血尿酸检测要求的不断提高，早期利用尿酸酶和过氧化物酶建立的尿酸酶法检测(如全血尿酸浓度检测试纸条CN 1456892A，2003.11.19)，由于操作复杂、成本高等缺点已不被广泛使用，取而代之的是以伏安法为代表的传感器法(如一次性全血尿酸检测电极试条及制造方法CN 1952653A、2007.04.25)和以高效液相色谱、毛细管电泳、液相色谱-质谱为代表的仪器法，这些方法虽然具有较好的检测特异性和灵敏度，但在实际检测过程中却存在着许多缺点。例如，这些方法均依赖高端检测设备和专业操作人员，很难实现现场检测；检测时往往需要进行样品前处理，消耗大量的有机溶剂，增加了检测成本和环境净化压力。相比之下，以ELISA为代表的免疫学分析技术已成为目前小分子化合物分析的主要手段，其优点是灵敏度高、特异性好、操作简单等。但是，ELISA仍需专业化的操作和仪器读取数据，不能用于尿酸的家庭检测，因此不利于尿酸相关疾病的及时预防和治疗。并且检测试纸在使用方便的同时，对于其检测范围和检测时间也是具有严格的要求的，有的方法虽然方法简便，但是试纸的检测范围，检测时间达不到要求，会对检测结果的准确度有很大影响。免疫胶体金方法虽然是一种比较成熟的方法，但是具体到每种具体的检测物质，其检测效果仍然各有不同。 

技术方案 

针对上述尿酸检测技术的发展和应用现状，本发明旨在为病人家庭和小型医疗机构提供一种能够快速便捷测定血液中尿酸含量的免疫胶体金速测试纸条，利用这种试纸条检测时无需专业人员，也不依赖大型仪器设备，是一种由病人或其家人即可操作，随时快速检测血液中尿酸浓度的高效方法。 

采用该试纸条检测时，只需微量血液并能在短时间内测出血液中尿酸的含量是否超标(此处可设置最低血尿酸控制线UA357μmol/L和血尿酸超标临界线UA477μmol/L)。该试纸的检测范围为5～25mg/dL，检测时间＜60s，其检测既快速又灵敏。 

本发明的目的是这样实现的：尿酸免疫胶体金速测试纸条(图1)，是在一块涂有胶层的塑料背板上粘贴喷有尿酸-OVA(鸡卵清蛋白)包被抗原(T线)和羊抗兔抗体(C线)的硝酸纤维素膜，并在硝酸纤维素膜的T线侧叠加粘贴特 异识别尿酸兔源抗体修饰的胶体金垫，胶体金垫和硝酸纤维素膜的C线侧分别叠加粘贴样品垫和吸收垫，切割成条状。血尿酸免疫胶体金速测试纸条制造方法的全过程包括以下步骤： 

1)将尿酸半抗原通过水溶性碳化二亚胺(EDC)法将尿酸分子与牛血清白蛋白(BSA)偶联，获得尿酸-BSA人工抗原；所述的尿酸半抗原的特征是，在尿酸分子中一个羟基位点添加一个戊酸的改造分子； 

2)将尿酸-BSA人工抗原免疫雄性新西兰大白兔，免疫后取兔血获得抗血清并纯化抗体，通过竞争ELISA法检测抗体对尿酸分子的特异性； 

3)采柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，颗粒直径为15±3.5nm； 

4)1.3mg尿酸抗体与50mL胶体金溶液混合，制备胶体金抗体探针。将玻璃棉膜浸泡与此探针溶液中，37℃干燥，得到胶体金垫； 

5)采用单向喷点仪将尿酸-OVA包被抗原和羊抗兔抗体，喷在硝酸纤维素膜上，37℃干燥； 

6)将硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫以及吸收垫，依次粘贴在涂有胶层的白色塑料背板上，压紧后切割成条状。 

下面结构附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。 

附图说明

图1尿酸抗体胶体金速测试纸条的构造图。 

图2尿酸抗体胶体金速测试纸条的检测原理图。 

具体实施例

实施例1尿酸-BSA人工抗原和尿酸-OVA包被抗原的制备 

本发明中尿酸-BSA人工抗原的制作过程如下： 

200mg BSA、100mg尿酸半抗原和100mg碳化二亚胺(EDC)分别溶于5mL、2mL和3mL的PBS中，然后向BSA溶液中边搅拌边慢慢滴加2mL的尿酸半抗原溶液和2mL的EDC溶液，于4℃冰浴下遮光搅拌反应4h，再向混和溶液中滴加剩下的1mL EDC溶液，继续于4℃冰浴下遮光搅拌反应24h。反应结束后以4000r/min离心5min，取上清液装入透析袋，于0.01mol/L、pH7.4的磷酸缓冲液中4℃下透析5d，每天更换2次透析液。透析完毕分装，-20℃下冷冻保存。 

本发明中尿酸-OVA包被抗原的制作过程同尿酸-BSA人工抗原的制作过程。 

实施例2尿酸抗体的制备及纯化 

本发明中尿酸抗体的制备过程如下： 

尿酸抗血清的制备：选3只3月龄、体重1.5～2.0kg的健康雄性新西兰大白兔，免疫前1周，于兔耳缘静脉采血留作阴性对照。将一定量的尿酸-BSA人工抗原同等量的弗氏完全佐剂充分乳化后进行第1次基础免疫，于兔背部多点注 射，每兔注射1mL；半月后再进行第2次基础免疫，剂量与第1次基础免疫相同。以后每2个星期进行一次加强免疫，剂量加倍，于兔背部和大腿肌肉处交叉进行。从第4次加强免疫开始，每次免疫后1星期，于兔耳缘静脉采血测抗体效价。当效价达到要求时对兔子进行心脏取血，于4℃下静置过夜，3000r/min离心5min，取血清分装，于-20℃下保存。 

尿酸抗体的粗制备：取5mL尿酸抗血清加5mL生理盐水，逐滴加入2.5mL饱和(NH4)₂SO₄溶液，使(NH4)₂SO₄饱和终浓度达到20％，边加边搅拌，充分混匀后静置30min。3000r/min，离心20min，弃去沉淀。将上清夜转至小烧杯中继续加饱和饱和(NH4)₂SO₄溶液，使其饱和终浓度为50％，搅拌3h。3000r/min，离心20min，弃上清。沉淀用5mL生理盐水溶解，再加逐滴加入2.5mL饱和(NH4)₂SO₄溶液，使其终浓度为33％，充分混匀后静置30min。3000r/min，离心20min，弃上清，重复一次。2.5mL生理盐水溶解沉淀并透析除盐(48h，中间换液3次)。以1％BaCl₂检测透析液至无SO₄ ^2-。离心去沉淀，上清液即为粗提尿酸IgG抗体。 

尿酸抗体的纯化：采用protein G蛋白亲和纯化柱(Amersham Bioscience公司)进一步纯化抗体。粗提抗体于20mmol/L PBS(pH 7.0)缓冲液中透析过夜。以此缓冲液平衡protein G柱(流速为1mL/min)，将透析后的粗提抗体载入柱中，以0.1mol/L甘氨酸溶液(pH 2.7)洗涤柱子，收集样品并加入等体积1mol/LTris-HCl(pH 9.0)。15％PEG 20000浓缩至原体积。 

实施例3胶体金的制备 

本发明中胶体金的制备过程如下： 

取0.01％氯金酸100mL，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热搅拌下加入1％柠檬酸三钠水溶液2mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止。冷却后于棕色瓶中，4℃保存。 

实施例4胶体金尿酸抗体探针的制备 

本发明中胶体金尿酸抗体探针的制备过程如下： 

量取胶体金50mL，将胶体金调节pH7.3，搅拌下加入尿酸抗体1.3mg，继续搅拌30min，加入20％的PEG终止反应，10000r/min离心10min，沉淀物用0.02mol/L Na₂B₄O₇溶液(含1％BSA，0.01％NaN₃)稀释，4℃保存备用。 

实施例5速测试纸条的制备 

本发明中尿酸抗体胶体金速测试纸条的制备过程如下： 

硝酸纤维素膜的处理：由25mm×30cm硝酸纤维素膜切割而成，分为检测线(T线)和质控线(C线)，两线距离为5mm。将浓度为1mg/mL的尿酸-OVA包被抗原液放于X-only单向喷点仪贮存池A，将浓度为1mg/mL的羊抗兔抗体 液放于贮存池B，开机后将尿酸-OVA包被抗原和羊抗兔抗体分别点射于膜中央，自然干燥密封，4℃保存备用。 

样品垫：由17mm×30cm的纤维素膜切割而成，经缓冲液(50mmol/LTris-HCl，0.25％Triton X-100，0.15mmol/L NaCl，pH 8.0)浸泡，室温干燥，密封保存。 

金标垫：由8mm×30cm的玻璃棉膜切割而成，将金标适体和金标质控序列用X-only单向喷点仪均匀喷洒于玻璃棉上，37℃干燥，密封，4℃保存。 

吸收垫：由20mm×30cm的纤维素膜切割而成。 

背板：为涂有胶层的白色塑料板。 

组装及切割：将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次贴在背板上，相互之间存在2mm重叠，放入CM 4000切割机槽内，切割成长为60mm宽为5mm的试纸条(图4)，注明日期和批次，密封，4℃保存备用。 

Claims (4)

1.一种免疫胶体金尿酸检测试纸，其特征在于该试纸是一块切割成条状的涂有胶层的塑料背板，塑料背板上粘贴喷有尿酸-OVA(鸡卵清蛋白)包被抗原构成的T线和羊抗兔抗体构成的C线的硝酸纤维素膜，并在硝酸纤维素膜的T线侧叠加粘贴特异识别尿酸兔源抗体修饰的胶体金垫，胶体金垫和硝酸纤维素膜的C线侧分别叠加粘贴样品垫和吸收垫；

其中制备尿酸抗体所用的抗原是通过以下过程制备的：将尿酸半抗原通过水溶性碳化二亚胺(EDC)法将尿酸分子与牛血清白蛋白(BSA)偶联，获得尿酸-BSA人工抗原；所述的尿酸半抗原的特征是，在尿酸分子中一个羟基位点添加一个戊酸的改造分子；

其中尿酸抗体是通过以下过程制备的：将尿酸-BSA人工抗原免疫雄性新西兰大白兔，免疫后取兔血获得抗血清并纯化抗体，通过竞争ELISA法检测抗体对尿酸分子的特异性。

2.如权利要求1所述的尿酸检测试纸，其特征在于该试纸的检测范围为5～25mg/dL，检测时间＜60s。

3.如权利要求1所述的尿酸检测试纸的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将尿酸半抗原通过水溶性碳化二亚胺(EDC)法将尿酸分子与牛血清白蛋白(BSA)偶联，获得尿酸-BSA人工抗原；所述的尿酸半抗原的特征是，在尿酸分子中一个羟基位点添加一个戊酸的改造分子；

2)将尿酸-BSA人工抗原免疫雄性新西兰大白兔，免疫后取兔血获得抗血清并纯化抗体，通过竞争ELISA法检测抗体对尿酸分子的特异性；

3)采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，颗粒直径为15+3.5nm；

4)1.3mg尿酸抗体与50mL胶体金溶液混合，制备胶体金抗体探针，将玻璃棉膜浸泡于此探针溶液中，37℃干燥，得到胶体金垫；

5)采用单向喷点仪将尿酸-OVA包被抗原和羊抗兔抗体，喷在硝酸纤维素膜上，37℃干燥；

6)将硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫以及吸收垫，依次粘贴在涂有胶层的白色塑料背板上，压紧后切割成条状。

4.如权利要求3所述的方法制备的尿酸检测试纸，其特征在于该试纸的检测范围为5～25mg/dL，检测时间＜60s。