CN104808003B - 肺结核疗效评价试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肺结核疗效评价试剂盒,包括五种酶标板、蛋白标准品组合物,生物素标记抗体组合物;其中所述酶标板分别包被有抗ALB抗体、抗APOA抗体、抗C3抗体、抗ARHGDIB抗体、抗FCN2抗体五种酶标板;所述蛋白标准品组合物包括ALB、APOA、ARHGDIB、C3和FCN2蛋白标准品;所述生物素标记抗体组合物包括所述生物素标记的抗ALB抗体、生物素标记的抗APOA抗体、生物素标记的抗ARHGDIB抗体、生物素标记的抗C3抗体和生物素标记的抗FCN2抗体。该肺结核疗效评价试剂盒可以高效、准确的评价肺结核病患者的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及疾病疗效评价领域,特别是指一种肺结核疗效评价试剂盒及其应用。
背景技术
肺结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性肺部感染性疾病,其感染率及病死率较高。目前我国尚无无明确的肺结核病疗效评价指标,容易过度治疗,造成患者毒副反应增加,并经济负担加重,医药资源浪费等。因此,迫切需要研究肺结核病疗效评价的特异生物标志物,从而缓解肺结核病给个人、家庭、社会带来的负担。
目前,对肺结核病的疗效评价主要通过临床医生的经验判断和痰培养实验结果鉴别肺结核病患者是否治愈。然而通过患者精神状态、胸部X片/CT影像学改变等临床判断方法主观性太强,容易误诊;痰培养检查又耗时太长,需要4-8周,分辨功效差,特异性仅为57.8%。因此,现在亟需发现一种非培养、高效、定量的评价肺结核病治疗效果的新方法。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提出一种肺结核疗效评价试剂盒,可以高效、准确的评价肺结核病患者的治疗效果。
基于上述目的本发明提供的肺结核疗效评价试剂盒,包括酶标板、蛋白标准品组合物,生物素标记抗体组合物;其中所述酶标板分别包被有抗ALB抗体、抗APOA抗体、抗C3抗体、抗ARHGDIB抗体、抗FCN2抗体的五种酶标板;所述蛋白标准品组合物包括ALB、APOA、ARHGDIB、C3和FCN2蛋白标准品;所述生物素标记抗体组合物包括所述生物素标记的抗ALB抗体、生物素标记的抗APOA抗体、生物素标记的抗ARHGDIB抗体、生物素标记的抗C3抗体和生物素标记的抗FCN2抗体。
较佳的,所述ALB、APOA、ARHGDIB、C3和FCN2蛋白标准品浓度分别为80-120μg/mL,40-60ng/mL,1000-1800pg/mL,25-35μg/mL,12-20ng/mL。
较佳的,所述肺结核疗效评价试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记亲和素,稀释液,洗涤液,底物溶液,终止液,酶标板贴纸。
较佳的,所述稀释液是含有8g/LNaCl、0.2g/LKCl、1.15-1.8g/LNa2HPO4·2H2O或2.71g/LNa2HPO4·7H2O或3.58g/LNa2HPO4·12H2O、0.2-0.24g/LKH2PO4的水溶液;
所述洗涤液是含有8g/LNaCl、0.2g/LKCl、1.15-1.8g/LNa2HPO4·2H2O或2.71g/LNa2HPO4·7H2O或3.58g/LNa2HPO4·12H2O、0.2-0.24g/LKH2PO4、0.5-1mL/L的吐温20的水溶液;
所述底物溶液是含有体积比0.8-1.2%的3,3',5,5'-四甲基联苯胺的乙醇溶液;
所述终止液是1.5-3mol/L的H2SO4水溶液。
基于相同的发明构思,本发明还提供一种所述肺结核疗效评价试剂盒的应用,具体是指将所述肺结核疗效评价试剂盒用于评估肺结核病患者治疗效果的评价。
较佳的,所述肺结核疗效评价试剂盒的应用包括以下步骤:
(1)采集外周血、离心、吸上清;
(2)将步骤(1)所得上清用所述稀释液稀释,分别加入所述五种酶标板,孵育;
(3)拍干酶标板,分别加入稀释的生物素标记抗体,孵育,用所述洗涤液洗涤;
(4)加入稀释的辣根过氧化物酶标记亲和素,孵育后用所述洗涤液洗涤;
(5)各反应孔中加入新配制的TMB底物溶液,避光孵育;
(6)各反应孔中加入终止液终止反应,在ELISA检测仪上检测各孔OD值;
(7)计算各样本蛋白浓度,带入Logistic逐步模型的回归方程,经计算后评价肺结核病治疗效果。
较佳的,所述Logistic逐步模型的回归方程为:
Logit(p)=-0.1617+0.04934×(ALB蛋白浓度)+0.003786×(APOA蛋白浓度)-0.0189×(ARHGDIB蛋白浓度)-0.001431×(C3蛋白浓度)-0.06697(FCN2蛋白浓度)
获得Logit(p)值,通过P=exp[Logit(p)]/(1+exp[Logit(p)])换算得到P值,以0.5为界,判定肺结核病治疗效果。
本肺结核疗效评价试剂盒的原理为:
采用ELISA方法检测血清ALB、APOA、ARHGDIB、C3、FCN2五种蛋白表达水平:其中,
白蛋白(ALB,Albumin,SwissProt:P02768)可以运输激素、脂肪酸、其它化合物,并缓冲剂血液的pH,其在炎症状态时下调;
载脂蛋白(APOA,LipoproteinA,SwissProt:P08519)是一种亲水型糖蛋白,可和低密度脂蛋白一起组装成LPA;其和纤维蛋白溶酶原具有高度的同源性,因此还具有一部分凝血系统功能;
Rho家族GDP解离抑制剂2(ARHGDIB,RhoGDPdissociationinhibitor2,SwissProt:P52566)是Rho家族的GTP酶调节酶,其不仅在炎症、免疫中有所作用,还与多种细胞的侵袭性相关;
补体C3(ComplementC3,SwissProt:P01024)属于补体系统,在病原体入侵机体早期即发挥清除作用;
纤维胶凝蛋白2(FCN2,Ficolin-2,SwissProt:Q15485)能识别病原体上的PAMPs,激活补体系统中的凝集素级联反应,从而清除病原体;
根据物种蛋白的特性,将五种蛋白表达量带入Logistic逐步回归模型,经计算后,即可判定是否治愈肺结核病。
从上面所述可以看出,本发明提供的肺结核疗效评价试剂盒采用血清蛋白组合物的方式鉴别治愈肺结核病,具有较高的敏感性和特异性,且操作简便,效率高,优于目前临床所采用的痰培养,为肺结核病的疗效评价提供了一种新的评估方法。
附图说明
图1为本发明实施例未用药肺结核病患者、治愈肺结核病患者、健康对照者血清中ALB的表达水平比较示意图;
图2为本发明实施例本发明实施例未用药肺结核病患者、治愈肺结核病患者、健康对照者血清中APOA的表达水平比较示意图;
图3为本发明实施例本发明实施例未用药肺结核病患者、治愈肺结核病患者、健康对照者血清中ARHGDIB的表达水平比较示意图;
图4为本发明实施例本发明实施例未用药肺结核病患者、治愈肺结核病患者、健康对照者血清中C3的表达水平比较示意图;
图5为本发明实施例本发明实施例未用药肺结核病患者、治愈肺结核病患者、健康对照者血清中FCN2的表达水平比较示意图;
图6为本发明实施例血清ALB、APOA、ARHGDIB、C3、FCN2和组合物的ROC曲线示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明进一步详细说明。
实施例1:肺结核疗效评价试剂盒的组成
在本实施例中,所述肺结核疗效评价试剂盒,包括酶标板,蛋白标准品组合物,生物素标记抗体组合物,辣根过氧化物酶标记亲和素,稀释液,洗涤液,底物溶液,终止液,酶标板贴纸。
所述酶标板包括:抗ALB抗体包被的酶标板、抗APOA抗体包被的酶标板、抗C3抗体包被的酶标板,以上酶标板购自Abcam艾美捷科技有限公司。还包括抗ARHGDIB抗体包被的酶标板、抗FCN2抗体包被的酶标板,购自武汉华美生物工程有限公司。
在本实施例中,所述蛋白标准品组合物包括:ALB、APOA、ARHGDIB、C3和FCN2五种蛋白标准品。其中,所述ALB、APOA、ARHGDIB蛋白标准品购自Abcam艾美捷科技有限公司;C3和FCN2蛋白标准品购自武汉华美生物工程有限公司。
在本实施例中,所述生物素标记抗体组合物包括:生物素标记的抗ALB抗体、生物素标记的抗APOA抗体、生物素标记的抗ARHGDIB抗体、生物素标记的抗C3抗体和生物素标记的抗FCN2抗体。其中生物素标记的抗ALB抗体、抗APOA抗体、生物素标记的抗ARHGDIB抗体购自Abcam艾美捷科技有限公司;生物素标记的抗C3抗体和生物素标记的抗FCN2抗体购自C3和FCN2蛋白标准品购自武汉华美生物工程有限公司。
在本实施例中,所述辣根过氧化物酶标记亲和素购自Abcam艾美捷科技有限公司和武汉华美生物工程有限公司,分别用于对应公司的酶标板。
在本实施例中,所述肺结核疗效评价试剂盒还包括:
稀释液:
将80gNaCl、2gKCl、11.5-18gNa2HPO4·2H2O或27.1gNa2HPO4·7H2O或35.8gNa2HPO4·12H2O、2.0-2.4gKH2PO4加到1000mL蒸馏水中,调整PH至7.2-7.5为稀释液存储液。使用前用双蒸水将稀释液存储液稀释10倍,成为稀释液使用液。
作为一个较佳的实施例,所述稀释液为80gNaCl、2gKCl、18gNa2HPO4·2H2O、2.4gKH2PO4加到1000mL蒸馏水中,调整PH至7.4为稀释液存储液。使用前用双蒸水将稀释液存储液稀释10倍,成为稀释液使用液。
作为一个可选的实施例,所述稀释液为80gNaCl、2gKCl、27.1gNa2HPO4·7H2O、2.4gKH2PO4加到1000mL蒸馏水中,调整PH至7.4为稀释液存储液。使用前用双蒸水将稀释液存储液稀释10倍,成为稀释液使用液。
作为一个可选的实施例,所述稀释液为80gNaCl、2gKCl、35.8gNa2HPO4·12H2O、2.0gKH2PO4加到1000mL蒸馏水中,调整PH至7.4为稀释液存储液。使用前用双蒸水将稀释液存储液稀释10倍,成为稀释液使用液。
作为一个可选的实施例,所述稀释液为80gNaCl、2gKCl、11.5gNa2HPO4·2H2O、2.0gKH2PO4加到1000mL蒸馏水中,调整PH至7.4为稀释液存储液。使用前用双蒸水将稀释液存储液稀释10倍,成为稀释液使用液。
洗涤液:
用双蒸水稀释上文所述稀释液存储液10倍后,加入0.05-1.00%(体积比,v/v)吐温-20,成为洗涤液。
作为一个较佳的实施例,所述溶液为上文所述稀释液存储液100mL,加到900mL蒸馏水中,混匀后再加入1mL吐温-20,成为洗涤液。
底物溶液:
用无水乙醇将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)配成0.8-1.2%(v/v)溶液,4℃避光保存。
作为一个较佳的实施例,所述底物溶液是用无水乙醇将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)配成1%(v/v)溶液,4℃避光保存。
终止液:1.5-3mol/LH2SO4水溶液。作为一个较佳的实施例为2mol/LH2SO4水溶液。
实施例2:肺结核疗效评价试剂盒Logistic逐步回归模型建立
采用肺结核疗效评价试剂盒分别检测未用药肺结核病患者、治愈肺结核病患者、健康对照者血清中ALB、APOA、ARHGDIB、C3和FCN2蛋白的表达水平。
(1)样本收集:
依据中国卫生部发布的肺结核病诊断标准,收集未用药肺结核病患者57例,治愈肺结核病患者59例。同期收集健康对照者60例,HIV检测均为阴性,无乙肝,无糖尿病,无哮喘,无结核病史,肝肾功能正常,无其他先天性疾病,并排除慢性炎症、自身免疫病等其他疾病,不存在其他手术史,年龄、性别无显著差异。
所有参加者血样均为晨起空腹抽取,采用一次性真空不抗凝采血管,采集外周血3.0mL,4小时内离心(3000r/min,10min,4℃),吸上清后分装成各50μL,保存于-80℃冰箱。
(2)抗原表达量检测:
取治愈肺结核病、未用药肺结核病患者、正常对照的血清样本,使用稀释液以1:10000比例稀释,用于检测ALB蛋白;
取治愈肺结核病、未用药肺结核病患者、正常对照的血清样本,使用稀释液以1:20000比例稀释,用于检测APOA蛋白;
取治愈肺结核病、未用药肺结核病患者、正常对照的血清样本,使用稀释液以1:800比例稀释,用于检测C3蛋白;
取治愈肺结核病、未用药肺结核病患者、正常对照的血清样本,使用稀释液以1:4000比例稀释,用于检测FCN2蛋白;
取治愈肺结核病、未用药肺结核病患者、正常对照的血清样本,不稀释用于检测ARHGDIB蛋白。
所述ALB、APOA、ARHGDIB、C3和FCN2蛋白标准品浓度分别为80-120μg/mL,40-60ng/mL,1000-1800pg/mL,25-35μg/mL,12-20ng/mL。
作为一个较佳的实施例,所述ALB、APOA、ARHGDIB、C3和FCN2蛋白标准品浓度分别为100μg/mL,50ng/mL,1600pg/mL,30μg/mL,16ng/mL。使用时用稀释液使用液将ALB标准品倍比稀释,建立100μg/mL、25μg/mL、6.25μg/mL、1.563μg/mL、0μg/mL5个浓度的标准曲线;将APOA标准品倍比稀释,建立50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.563ng/mL、0.781ng/mL、0ng/mL8个浓度的标准曲线;将ARHGDIB标准品倍比稀释,建立1600pg/mL、800pg/mL、400pg/mL、200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、0pg/mL8个浓度的标准曲线;将C3标准品倍比稀释,建立30μg/mL、15μg/mL、7.5μg/mL、3.75μg/mL、1.875μg/mL、0.938μg/mL、0.469μg/mL、0μg/mL8个浓度的标准曲线;将FCN2标准品倍比稀释,建立16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、0ng/mL8个浓度的标准曲线。
将稀释的待检血清0.1mL分别加入包被抗ALB抗体、抗APOA抗体、抗ARHGDIB抗体、抗C3抗体和抗FCN2抗体的酶标板中,敷上酶标板贴纸,置37℃孵育1小时。
拍干酶标板,于各反应孔中,对应该酶标板包被的抗体,分别加入用所述稀释液使用液以体积比1:100新稀释的生物素标记抗体0.1mL,敷上酶标板贴纸,置37℃孵育1小时,洗涤液0.2mL/孔洗涤3次。
于各反应孔中,加入新稀释用所述稀释液使用液以体积比1:100新稀释的辣根过氧化物酶标记亲和素0.1mL,敷上酶标板贴纸,37℃孵育0.5~1小时,0.2mL/孔洗涤液洗涤5次。
用pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液9.9mL(0.2mol/LNa2HPO410.3mL和0.1mol/L柠檬酸9.7mL混合制备获得)加入0.1mL所述底物溶液,再加入0.75%(v/v)的H2O2水溶液42μL,混匀后立即于各反应孔中加入新配制的TMB底物溶液0.1mL/孔,敷上酶标板贴纸,避光37℃孵育10~30分钟。于各反应孔中加入终止液0.05ml终止反应。
在ELISA检测仪上,于450nm处,以空白对照孔调零后测各孔OD值。
(3)数据处理与统计分析:
根据酶标板各孔OD值,对照各标准曲线换算为各样本蛋白浓度后,采用SPSS16.0软件中NonparametricMann-WhitneyUtest进行统计(P<0.05时,具有显著性差异;P<0.01时,具有极显著性差异),并应用GraphPadPrism5软件绘制含误差线的散点图(参见图1-图5)。
运用MedCalc软件计算单个血清ALB、APOA、ARHGDIB、C3和FCN2鉴别治愈肺结核病的ROC曲线,包括灵敏度、特异性和曲线下面积(AUC),结果显示血清ALB、APOA、ARHGDIB、C3和FCN2的AUC分别是0.716、0.646、0.674、0.714、0.689,敏感性分别是92.31%、55.56%、79.63%、38.00%、87.27%,特异性分别是28.85%、68.00%、61.22%、87.86%、39.29%。结果说明单个血清蛋白鉴别治愈肺结核病的敏感性和特异性都不高。
采用Logistic逐步回归模型计算血清ALB、APOA、ARHGDIB、C3和FCN2组合物鉴别治愈肺结核病的ROC曲线,通过数据计算和分析,构建治愈肺结核病组合物的二分类Logistic逐步模型的回归方程:
Logit(p)=-0.1617+0.04934×(ALB蛋白浓度)+0.003786×(APOA蛋白浓度)-0.0189×(ARHGDIB蛋白浓度)-0.001431×(C3蛋白浓度)-0.06697(FCN2蛋白浓度)
其ROC曲线敏感度为87.10%,特异度为79.49%,曲线下面积(AUC)为0.876(P<0.0001,95%ConfidenceInterval=0.775-0.943)(参见图6)具有较高的准确性,同时敏感性高、特异性强。说明血清ALB、APOA、ARHGDIB、C3和FCN2组合物可用于制备治愈肺结核病的疗效评价试剂盒。
实施例3:肺结核疗效评价试剂盒检测效果的验证及应用
留一法交叉验证:取治愈肺结核病、未用药肺结核病患者、正常对照的血清样本,样本收集及稀释方法同实施例2所述。
将稀释的待检血清0.1mL加入包被抗ALB抗体、抗APOA抗体、抗ARHGDIB抗体、抗C3抗体和抗FCN2抗体的酶标板中,置37℃孵育1小时。
拍干酶标板,于各反应孔中,对应该酶标板包被的抗体,分别加入新鲜稀释的生物素标记抗体0.1mL,置37℃孵育1小时,洗涤液洗涤。
于各反应孔中,加入新鲜稀释的辣根过氧化物酶标记亲和素0.1mL,37℃孵育0.5~1小时,洗涤液洗涤。
于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,避光37℃10~30分钟。于各反应孔中加入终止液0.05ml终止反应。
在ELISA检测仪上,于450nm处,以空白对照孔调零后测各孔OD值。换算为各样本蛋白浓度后,运用SPSS16.0统计软件进行Mann-WhitneyU检验,验证目的蛋白表达水平。
检测后,将各蛋白质浓度值代入公式,得到Logit(p)值,通过P=exp[Logit(p)]/(1+exp[Logit(p)])换算得到P值。以0.5为界,P值接近于1的判定为已治愈肺结核病,P值接近于0的判定为未治愈肺结核病。
留一法交叉验证获得模型的阳性预测值(PositivePredictiveValue,PPV)为76.67%、阴性预测值(Negativepredictivevalue,NPV)为80.00%,模型正确率为78.57%。
另采用39例肺结核临床样本进行盲法验证,将检测出的蛋白质值代入已构建的治愈肺结核病组合物的二分类Logistic逐步模型的回归方程,获得P值,本模型判定结果的临床符合率为74.36%。表明该特异血清蛋白质组合物诊断治愈肺结核病具有较高的准确性。
可见,本肺结核疗效评价试剂盒具有以下优点:
(1)采用检测肺结核病的特异血清蛋白质组合,进而对肺结核病的治愈进行鉴别,检测技术先进、高通量,组合物的构建方法设计精确、合理可行。
(2)传统的痰培养方法检测需要4-8周,分辨功效差,特异性低,且安全性差,需特定实验室内完成。而本试剂盒操作简便、快捷,仅需2-3小时,且该试剂盒是一种在血清蛋白水平上的检测,安全有效,对治愈肺结核病具有早期鉴别价值。
(3)本发明对治愈肺结核病检测的灵敏度为87.10%、特异性为79.49%,具有较高的准确性,可实现对治愈肺结核病的早期鉴别,为肺结核病的疗效评价提供了新的方法。
所属领域的普通技术人员应当理解:以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种肺结核疗效评价试剂盒,其特征在于,包括酶标板、蛋白标准品组合物,生物素标记抗体组合物;其中所述酶标板分别包被有抗ALB抗体、抗APOA抗体、抗C3抗体、抗ARHGDIB抗体、抗FCN2抗体的五种酶标板;所述蛋白标准品组合物包括ALB、APOA、ARHGDIB、C3和FCN2蛋白标准品;所述生物素标记抗体组合物包括所述生物素标记的抗ALB抗体、生物素标记的抗APOA抗体、生物素标记的抗ARHGDIB抗体、生物素标记的抗C3抗体和生物素标记的抗FCN2抗体。
2.根据权利要求1所述的肺结核疗效评价试剂盒,其特征在于,所述ALB、APOA、ARHGDIB、C3和FCN2蛋白标准品浓度分别为80-120μg/mL,40-60ng/mL,1000-1800pg/mL,25-35μg/mL,12-20ng/mL。
3.根据权利要求1所述的肺结核疗效评价试剂盒,其特征在于,还包括辣根过氧化物酶标记亲和素,稀释液,洗涤液,底物溶液,终止液,酶标板贴纸。
4.根据权利要求3所述的肺结核疗效评价试剂盒,其特征在于,
所述稀释液是含有8g/LNaCl、0.2g/LKCl、1.15-1.8g/LNa2HPO4·2H2O或2.71g/LNa2HPO4·7H2O或3.58g/LNa2HPO4·12H2O、0.2-0.24g/LKH2PO4的水溶液;
所述洗涤液是含有8g/LNaCl、0.2g/LKCl、1.15-1.8g/LNa2HPO4·2H2O或2.71g/LNa2HPO4·7H2O或3.58g/LNa2HPO4·12H2O、0.2-0.24g/LKH2PO4、0.5-1mL/L的吐温20的水溶液;
所述底物溶液是含有体积比0.8-1.2%的3,3',5,5'-四甲基联苯胺的乙醇溶液;
所述终止液是1.5-3mol/L的H2SO4水溶液。
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0510511D0 (en) * | 2005-05-23 | 2005-06-29 | St Georges Entpr Ltd | Diagnosis of tuberculosis |
CN104220453A (zh) * | 2012-04-03 | 2014-12-17 | 诺沃姆德治疗公司 | 人源化的嵌合抗因子c3抗体及其用途 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050260770A1 (en) * | 2004-04-01 | 2005-11-24 | Cohen Irun R | Antigen array and diagnostic uses thereof |
US10001481B2 (en) * | 2012-05-25 | 2018-06-19 | Stellenbosch University | Method for diagnosing tuberculosis disease by detecting induced markers after stimulation of T-cells with antigens |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0510511D0 (en) * | 2005-05-23 | 2005-06-29 | St Georges Entpr Ltd | Diagnosis of tuberculosis |
CN104220453A (zh) * | 2012-04-03 | 2014-12-17 | 诺沃姆德治疗公司 | 人源化的嵌合抗因子c3抗体及其用途 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
Ficolins: Novel pattern recognition molecules of the innate immune response;Valeria L. Runza et al;《Immunobiology》;20081231;第213卷;第297-306页 * |
Nutritional Risk Factors for Tuberculosis Among Adults in the United States;J. Peter Cegielski et al;《American Journal of Epidemiology Advance Access》;20120711;第176卷;第1-14页 * |
Screening and identification of potential biomarkers and establishment of the diagnostic serum proteomic model for the Traditional Chinese Medicine Syndromes of tuberculosis;Jiyan Liu et al;《J Ethnopharmacol.》;20140911;第155卷(第2期);第1322-1331页 * |
Serum lipids as biomarkers for therapeutic monitoring of latent tuberculosis infection;Amr S.Albanna et al;《Eur Respir J》;20130831;第42卷(第2期);第547-550页 * |
Vav1 and Ly-GDI Two Regulators of Rho GTPases, Function Cooperatively as Signal Transducers in T Cell Antigen Receptor-induced Pathways;Maya Groysman et al;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20021220;第277卷(第51期);第50121-50130页 * |
血行播散型肺结核患者血清白蛋白水平测定结果分析;周德玫等;《广西医学》;20030831;第25卷(第8期);第1355-1356页 * |
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