CN116183919A - 一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原i/ii含量的荧光定量检测试纸条的制备方法及其应用 - Google Patents

一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原i/ii含量的荧光定量检测试纸条的制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116183919A
CN116183919A CN202310086839.0A CN202310086839A CN116183919A CN 116183919 A CN116183919 A CN 116183919A CN 202310086839 A CN202310086839 A CN 202310086839A CN 116183919 A CN116183919 A CN 116183919A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pepsinogen
solution
antibody
test strip
plasma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310086839.0A
Other languages
English (en)
Inventor
张赫明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jixuan Technology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Jixuan Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jixuan Technology Co ltd filed Critical Shanghai Jixuan Technology Co ltd
Priority to CN202310086839.0A priority Critical patent/CN116183919A/zh
Publication of CN116183919A publication Critical patent/CN116183919A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96472—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • G01N2333/96475—Aspartic endopeptidases (3.4.23) with definite EC number
    • G01N2333/96477—Pepsin (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及POCT试剂荧光检测技术领域，具体涉及一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的制备方法及其应用，本发明制备的用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条即能同时检测样本中胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II两种胃功能、胃癌风险标志物，又没有增加生产操作的复杂度，操作简便，能够降低生产成本。本发明采用小分子DNP‑BSA(结合垫包被物)及DNP单抗(质控线)的质控系统，不与样本中的干扰物质如嗜异性抗体、人类抗动物抗体等产生特异性反应，能明显提高检测线T1和检测线T2的特异性，进而满足基层和医院门诊、急诊检验科的快速检测需求。

Description

一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧 光定量检测试纸条的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及POCT试剂荧光检测技术领域，具体涉及一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的制备方法及其应用。
背景技术
血清胃蛋白酶原是胃蛋白酶的无活性前体，根据生物化学和免疫活性特征，血清胃蛋白酶原可分为胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II两种亚型。胃蛋白酶原I主要由胃体和胃底腺的主细胞和颈黏液细胞分泌，而胃蛋白酶原II除了由胃底腺分泌外，胃窦幽门腺和近端十二指肠腺也可以分泌。胃蛋白酶原是反映胃体胃窦黏膜外分泌功能的良好指标，可被称为“血清学活检”。当胃黏膜发生萎缩时，血清胃蛋白酶原I和(或)PGR(胃蛋白酶原I与胃蛋白酶原II比值)水平降低，有研究认为，将“胃蛋白酶原I≤70μg/L且PGR≤3”作为针对无症状健康人群的胃癌筛查界限值，具有较好的筛查效果。
荧光定量免疫层析技术，是免疫荧光技术和经典免疫层析技术相结合发展创新的一种新型定量检测技术，在保留胶体金免疫层析技术操作简便、检测快速、便携性强的优点外，还通过荧光示踪强技术实现检测结果的精确定量，与传统快速检测技术性能比较具有灵敏度更高、检测范围更宽、性价比更高的优点，因此，如何更好地将荧光定量免疫层析技术应用于胃部疾病地筛查中，成为了本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
解决的技术问题
本发明至少针对上述部分问题，提供了一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的制备方法及其应用，旨在使其能够对血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II实现高自动化、高特异性和高灵敏性的检测。
本发明一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的制备方法，包括以下制备步骤：
Step1、抗体标记：将胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体和DNP-BSA抗体分别标记在300nm的荧光微球上，分别记作第一组分、第二组分和第三组分，接着按照1：1：1的体积对第一组分、第二组分和第三组分进行混合，混合均匀后记作混合喷涂液；
Step2、结合垫制备：将结合垫平铺在工作台上，按照10μl/张的量将混合喷涂液均匀喷涂在每张结合垫上，然后将结合垫置于49℃的条件下干燥过夜；
Step3、NC膜制备：将胃蛋白酶原I抗体和胃蛋白酶原II抗体分别稀释至1.25mg/mL，并将DNP单克隆抗体稀释至1mg/mL，然后在喷膜量为1.4μl/cm的NC膜上依次标记出间距为3-5mm的三条线，分别记作检测线T1、检测线T2和质控线，最后将稀释后的胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体和DNP单克隆抗体分别喷涂包被在检测线T1、检测线T2和质控线处，包被量为1μl/cm；
Step4、样品垫预处理：向Tris-HCl溶液中加入牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂，其中牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂的质量分数分别为0.3％、0.125％和0.3％，所得记作预处理溶液；将样品垫浸泡在预处理溶液中浸泡15-20min，接着置于49℃的条件下干燥过夜；
Step5、试纸条组装：在底板上依次粘贴样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸，其中，NC膜上靠近质控线的一端与吸水纸相连，在粘贴的过程中使相连的两部分互相重叠2mm，粘贴完成后切割成长59.8mm、宽3.95mm的大小，所得即为用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条。
更进一步地，所述Step4中Tris-HCl溶液的制备方法为：首先，称取1.2g三羟甲基氨基甲烷，溶于100mL去离子水中，所得记作Tris溶液；其次，吸取8.36mL的浓盐酸用去离子水定容至100mL，所得记作HCl溶液；最后，用HCl溶液将Tris溶液的pH值调至7。
更进一步地，所述Step1中的标记方法包括以下步骤：
步骤1、向1.5mL的离心管中加入50μl固含量为1％的荧光微球，混匀后加入800μl的MES缓冲液，接着在14500r/min的条件下离心除上清液，重复以上步骤2次；
步骤2、向步骤1所得的体系内加入10μl的NHS溶液，混匀后加入10μl的EDC溶液，超声分散1min后于室温下孵育30min，在14500r/min的条件下离心10min弃上清，所得记作活化荧光微球；
步骤3、将步骤2中的活化荧光微球加入至500μl的Tris-HCl溶液中，超声分散1min后混匀，然后加入抗体组分进行标记，震荡偶联3h后，于14500r/min的条件下离心10min弃上清，所得记作标记组分；其中，所述抗体组分为胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体或DNP-BSA抗体；
步骤4、将步骤3中的标记组分加入到100μl的BSA溶液中，用移液枪吹打混匀，直至在紫外灯照射下无明显悬浮颗粒聚集，然后在室温下震荡30min，在14500r/min的条件下离心10min弃上清，接着加入洗涤溶液重悬后，离心弃上清，最后将所得产物溶于200μl的复溶溶液内混匀后即完成标记。
更进一步地，所述步骤1中MES缓冲液的制备方法为：称取1g的2-(N-吗啉)乙磺酸充分溶解于90mL去离子水中，用氢氧化钠溶液调节pH值至6后，加入去离子水定容至100mL。
更进一步地，所述步骤2中的NHS溶液的制备方法为：称取5mg的N-羟基琥珀酰亚胺充分溶解于1mL的MES缓冲液中。
更进一步地，所述步骤2中的EDC溶液的制备方法为：称取5mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐充分溶解于1mL的MES缓冲液中。
更进一步地，所述步骤4中BSA溶液的制备方法为：称取0.1g牛血清白蛋白充分溶解于10mL超纯水中。
更进一步地，所述步骤4中洗涤溶液的制备方法为：将20μl的吐温-20溶于10mL的Tris-HCl溶液中。
更进一步地，所述步骤4中复溶溶液的制备方法为：向Tris-HCl溶液中加入蔗糖、海藻糖、叠氮化钠、牛血清白蛋白和吐温-20，其中入蔗糖、海藻糖、叠氮化钠、牛血清白蛋白和吐温-20的质量分数分别为5％、3％、0.1％、1％和1％。
一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的应用，所述应用方法为：先将样本滴加在试纸条的样品垫上，再使用荧光免疫分析仪检测检测线T1、检测线T2和质控线的荧光强度。
反应原理：测试时，样本滴加到试纸条的样品垫上后，样本中的胃蛋白酶原I与预先包被在结合垫中荧光微球标记的胃蛋白酶原I抗体结合形成蛋白酶原I结合物，同样，样本中的胃蛋白酶原II与预先包被在结合垫中的荧光微球标记的胃蛋白酶原II抗体结合形成胃蛋白酶原II结合物；经过向上的层析，胃蛋白酶原I结合物会被NC膜上检测线T1的胃蛋白酶原I抗体结合捕获，胃蛋白酶原II结合物会被NC膜上检测线T2的胃蛋白酶原II抗体结合捕获；样本中的胃蛋白酶原I越多，检测线T1上积聚的结合物越多，信号强度反应了被捕获的胃蛋白酶原I含量，同理，样本中的胃蛋白酶原II越多，检测线T2上积聚的结合物越多，信号强度反应了被捕获的胃蛋白酶原II含量；而且标记荧光微球的DNP-BSA抗体也会被包被在NC膜上质控线上的DNP单克隆抗体捕获。
有益效果
采用本发明提供的技术方案，与已知的公有技术相比，具有如下有益效果：
1、本发明制备的用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条即能同时检测样本中胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II两种胃功能、胃癌风险标志物，又没有增加生产操作的复杂度，操作简便，能够降低生产成本，还能够在一定程度上节省医护操作人员的劳动力，而且本发明制得的试纸条能够直接对样本进行加样，能够提高检测结构的准确性。
2、本发明采用小分子DNP-BSA(结合垫包被物)及DNP单抗(质控线)的质控系统，不与样本中的干扰物质如嗜异性抗体、人类抗动物抗体等产生特异性反应，能明显提高检测线T1和检测线T2的特异性；其次，本发明制得的试纸条能够有效过滤样本杂质和血细胞的干扰，荧光微球可以充分得到释放，从而更加充分地参加反应，有利于提高信噪比，进而满足基层和医院门诊、急诊检验科的快速检测需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的结构示意图；
图2为本发明的用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的制备方法流程图；
图3为本发明的检测结果所得数据记录图；
图中的标号分别代表：1-底板；2-样品垫；3-结合垫；4-NC膜；5-吸水纸；6-检测线T1；7-检测线T2；8-质控线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的制备方法，包括以下制备步骤：
Step1、抗体标记：将胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体和DNP-BSA抗体分别标记在300nm的荧光微球上，分别记作第一组分、第二组分和第三组分，接着按照1：1：1的体积对第一组分、第二组分和第三组分进行混合，混合均匀后记作混合喷涂液；
Step2、结合垫制备：将结合垫平铺在工作台上，按照10μl/张的量将混合喷涂液均匀喷涂在每张结合垫上，然后将结合垫置于49℃的条件下干燥过夜；
Step3、NC膜制备：将胃蛋白酶原I抗体和胃蛋白酶原II抗体分别稀释至1.25mg/mL，并将DNP单克隆抗体稀释至1mg/mL，然后在喷膜量为1.4μl/cm的NC膜上依次标记出间距为3mm的三条线，分别记作检测线T1、检测线T2和质控线，最后将稀释后的胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体和DNP单克隆抗体分别喷涂包被在检测线T1、检测线T2和质控线处，包被量为1μl/cm；
Step4、样品垫预处理：向Tris-HCl溶液中加入牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂，其中牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂的质量分数分别为0.3％、0.125％和0.3％，所得记作预处理溶液；将样品垫浸泡在预处理溶液中浸泡15min，接着置于49℃的条件下干燥过夜；
Step5、试纸条组装：在底板上依次粘贴样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸，其中，NC膜上靠近质控线的一端与吸水纸相连，在粘贴的过程中使相连的两部分互相重叠2mm，粘贴完成后切割成长59.8mm、宽3.95mm的大小，所得即为用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条。
Step4中Tris-HCl溶液的制备方法为：首先，称取1.2g三羟甲基氨基甲烷，溶于100mL去离子水中，所得记作Tris溶液；其次，吸取8.36mL的浓盐酸用去离子水定容至100mL，所得记作HCl溶液；最后，用HCl溶液将Tris溶液的pH值调至7。
Step1中的标记方法包括以下步骤：
步骤1、向1.5mL的离心管中加入50μl固含量为1％的荧光微球，混匀后加入800μl的MES缓冲液，接着在14500r/min的条件下离心除上清液，重复以上步骤2次；
步骤2、向步骤1所得的体系内加入10μl的NHS溶液，混匀后加入10μl的EDC溶液，超声分散1min后于室温下孵育30min，在14500r/min的条件下离心10min弃上清，所得记作活化荧光微球；
步骤3、将步骤2中的活化荧光微球加入至500μl的Tris-HCl溶液中，超声分散1min后混匀，然后加入抗体组分进行标记，震荡偶联3h后，于14500r/min的条件下离心10min弃上清，所得记作标记组分；其中，抗体组分为胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体或DNP-BSA抗体；
步骤4、将步骤3中的标记组分加入到100μl的BSA溶液中，用移液枪吹打混匀，直至在紫外灯照射下无明显悬浮颗粒聚集，然后在室温下震荡30min，在14500r/min的条件下离心10min弃上清，接着加入洗涤溶液重悬后，离心弃上清，最后将所得产物溶于200μl的复溶溶液内混匀后即完成标记。
步骤1中MES缓冲液的制备方法为：称取1g的2-(N-吗啉)乙磺酸充分溶解于90mL去离子水中，用氢氧化钠溶液调节pH值至6后，加入去离子水定容至100mL。
步骤2中的NHS溶液的制备方法为：称取5mg的N-羟基琥珀酰亚胺充分溶解于1mL的MES缓冲液中。
步骤2中的EDC溶液的制备方法为：称取5mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐充分溶解于1mL的MES缓冲液中。
步骤4中BSA溶液的制备方法为：称取0.1g牛血清白蛋白充分溶解于10mL超纯水中。
步骤4中洗涤溶液的制备方法为：将20μl的吐温-20溶于10mL的Tris-HCl溶液中。
步骤4中复溶溶液的制备方法为：向Tris-HCl溶液中加入蔗糖、海藻糖、叠氮化钠、牛血清白蛋白和吐温-20，其中入蔗糖、海藻糖、叠氮化钠、牛血清白蛋白和吐温-20的质量分数分别为5％、3％、0.1％、1％和1％。
一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的应用，应用方法为：先将样本滴加在试纸条的样品垫上，再使用荧光免疫分析仪检测检测线T1、检测线T2和质控线的荧光强度。
实施例2
本实施例的一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的制备方法，包括以下制备步骤：
Step1、抗体标记：将胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体和DNP-BSA抗体分别标记在300nm的荧光微球上，分别记作第一组分、第二组分和第三组分，接着按照1：1：1的体积对第一组分、第二组分和第三组分进行混合，混合均匀后记作混合喷涂液；
Step2、结合垫制备：将结合垫平铺在工作台上，按照10μl/张的量将混合喷涂液均匀喷涂在每张结合垫上，然后将结合垫置于49℃的条件下干燥过夜；
Step3、NC膜制备：将胃蛋白酶原I抗体和胃蛋白酶原II抗体分别稀释至1.25mg/mL，并将DNP单克隆抗体稀释至1mg/mL，然后在喷膜量为1.4μl/cm的NC膜上依次标记出间距为5mm的三条线，分别记作检测线T1、检测线T2和质控线，最后将稀释后的胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体和DNP单克隆抗体分别喷涂包被在检测线T1、检测线T2和质控线处，包被量为1μl/cm；
Step4、样品垫预处理：向Tris-HCl溶液中加入牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂，其中牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂的质量分数分别为0.3％、0.125％和0.3％，所得记作预处理溶液；将样品垫浸泡在预处理溶液中浸泡20min，接着置于49℃的条件下干燥过夜；
Step5、试纸条组装：在底板上依次粘贴样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸，其中，NC膜上靠近质控线的一端与吸水纸相连，在粘贴的过程中使相连的两部分互相重叠2mm，粘贴完成后切割成长59.8mm、宽3.95mm的大小，所得即为用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条。
Step4中Tris-HCl溶液的制备方法为：首先，称取1.2g三羟甲基氨基甲烷，溶于100mL去离子水中，所得记作Tris溶液；其次，吸取8.36mL的浓盐酸用去离子水定容至100mL，所得记作HCl溶液；最后，用HCl溶液将Tris溶液的pH值调至7。
Step1中的标记方法包括以下步骤：
步骤1、向1.5mL的离心管中加入50μl固含量为1％的荧光微球，混匀后加入800μl的MES缓冲液，接着在14500r/min的条件下离心除上清液，重复以上步骤2次；
步骤2、向步骤1所得的体系内加入10μl的NHS溶液，混匀后加入10μl的EDC溶液，超声分散1min后于室温下孵育30min，在14500r/min的条件下离心10min弃上清，所得记作活化荧光微球；
步骤3、将步骤2中的活化荧光微球加入至500μl的Tris-HCl溶液中，超声分散1min后混匀，然后加入抗体组分进行标记，震荡偶联3h后，于14500r/min的条件下离心10min弃上清，所得记作标记组分；其中，抗体组分为胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体或DNP-BSA抗体；
步骤4、将步骤3中的标记组分加入到100μl的BSA溶液中，用移液枪吹打混匀，直至在紫外灯照射下无明显悬浮颗粒聚集，然后在室温下震荡30min，在14500r/min的条件下离心10min弃上清，接着加入洗涤溶液重悬后，离心弃上清，最后将所得产物溶于200μl的复溶溶液内混匀后即完成标记。
步骤1中MES缓冲液的制备方法为：称取1g的2-(N-吗啉)乙磺酸充分溶解于90mL去离子水中，用氢氧化钠溶液调节pH值至6后，加入去离子水定容至100mL。
步骤2中的NHS溶液的制备方法为：称取5mg的N-羟基琥珀酰亚胺充分溶解于1mL的MES缓冲液中。
步骤2中的EDC溶液的制备方法为：称取5mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐充分溶解于1mL的MES缓冲液中。
步骤4中BSA溶液的制备方法为：称取0.1g牛血清白蛋白充分溶解于10mL超纯水中。
步骤4中洗涤溶液的制备方法为：将20μl的吐温-20溶于10mL的Tris-HCl溶液中。
步骤4中复溶溶液的制备方法为：向Tris-HCl溶液中加入蔗糖、海藻糖、叠氮化钠、牛血清白蛋白和吐温-20，其中入蔗糖、海藻糖、叠氮化钠、牛血清白蛋白和吐温-20的质量分数分别为5％、3％、0.1％、1％和1％。
一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的应用，应用方法为：先将样本滴加在试纸条的样品垫上，再使用荧光免疫分析仪检测检测线T1、检测线T2和质控线的荧光强度。
实施例3
本实施例的一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的制备方法，包括以下制备步骤：
Step1、抗体标记：将胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体和DNP-BSA抗体分别标记在300nm的荧光微球上，分别记作第一组分、第二组分和第三组分，接着按照1：1：1的体积对第一组分、第二组分和第三组分进行混合，混合均匀后记作混合喷涂液；
Step2、结合垫制备：将结合垫平铺在工作台上，按照10μl/张的量将混合喷涂液均匀喷涂在每张结合垫上，然后将结合垫置于49℃的条件下干燥过夜；
Step3、NC膜制备：将胃蛋白酶原I抗体和胃蛋白酶原II抗体分别稀释至1.25mg/mL，并将DNP单克隆抗体稀释至1mg/mL，然后在喷膜量为1.4μl/cm的NC膜上依次标记出间距为4mm的三条线，分别记作检测线T1、检测线T2和质控线，最后将稀释后的胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体和DNP单克隆抗体分别喷涂包被在检测线T1、检测线T2和质控线处，包被量为1μl/cm；
Step4、样品垫预处理：向Tris-HCl溶液中加入牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂，其中牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂的质量分数分别为0.3％、0.125％和0.3％，所得记作预处理溶液；将样品垫浸泡在预处理溶液中浸泡18min，接着置于49℃的条件下干燥过夜；
Step5、试纸条组装：在底板上依次粘贴样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸，其中，NC膜上靠近质控线的一端与吸水纸相连，在粘贴的过程中使相连的两部分互相重叠2mm，粘贴完成后切割成长59.8mm、宽3.95mm的大小，所得即为用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条。
Step4中Tris-HCl溶液的制备方法为：首先，称取1.2g三羟甲基氨基甲烷，溶于100mL去离子水中，所得记作Tris溶液；其次，吸取8.36mL的浓盐酸用去离子水定容至100mL，所得记作HCl溶液；最后，用HCl溶液将Tris溶液的pH值调至7。
Step1中的标记方法包括以下步骤：
步骤1、向1.5mL的离心管中加入50μl固含量为1％的荧光微球，混匀后加入800μl的MES缓冲液，接着在14500r/min的条件下离心除上清液，重复以上步骤2次；
步骤2、向步骤1所得的体系内加入10μl的NHS溶液，混匀后加入10μl的EDC溶液，超声分散1min后于室温下孵育30min，在14500r/min的条件下离心10min弃上清，所得记作活化荧光微球；
步骤3、将步骤2中的活化荧光微球加入至500μl的Tris-HCl溶液中，超声分散1min后混匀，然后加入抗体组分进行标记，震荡偶联3h后，于14500r/min的条件下离心10min弃上清，所得记作标记组分；其中，抗体组分为胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体或DNP-BSA抗体；
步骤4、将步骤3中的标记组分加入到100μl的BSA溶液中，用移液枪吹打混匀，直至在紫外灯照射下无明显悬浮颗粒聚集，然后在室温下震荡30min，在14500r/min的条件下离心10min弃上清，接着加入洗涤溶液重悬后，离心弃上清，最后将所得产物溶于200μl的复溶溶液内混匀后即完成标记。
步骤1中MES缓冲液的制备方法为：称取1g的2-(N-吗啉)乙磺酸充分溶解于90mL去离子水中，用氢氧化钠溶液调节pH值至6后，加入去离子水定容至100mL。
步骤2中的NHS溶液的制备方法为：称取5mg的N-羟基琥珀酰亚胺充分溶解于1mL的MES缓冲液中。
步骤2中的EDC溶液的制备方法为：称取5mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐充分溶解于1mL的MES缓冲液中。
步骤4中BSA溶液的制备方法为：称取0.1g牛血清白蛋白充分溶解于10mL超纯水中。
步骤4中洗涤溶液的制备方法为：将20μl的吐温-20溶于10mL的Tris-HCl溶液中。
步骤4中复溶溶液的制备方法为：向Tris-HCl溶液中加入蔗糖、海藻糖、叠氮化钠、牛血清白蛋白和吐温-20，其中入蔗糖、海藻糖、叠氮化钠、牛血清白蛋白和吐温-20的质量分数分别为5％、3％、0.1％、1％和1％。
一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的应用，应用方法为：先将样本滴加在试纸条的样品垫上，再使用荧光免疫分析仪检测检测线T1、检测线T2和质控线的荧光强度。
性能测试
对通过本发明中实施例1-3制得的用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条进行相关性能检测，检测方法包括以下步骤：
S1、首先，按照实施例1-3的制备方法制备获得9个试纸条(每种实施例制备)3个，其次将胃蛋白酶原I抗原、胃蛋白酶原II抗原分别用含5％小牛血清的pH为7.0的0.1MPBS缓冲液分别配制成系列浓度(0、1、2、5、10、20、50、100、200ng/mL)的样液；
S2、用移液枪抽取样液随机加入S1中试纸条的样品垫上，样液的加量为80μl，15min后采用荧光免疫分析仪检测荧光强度。
检测结果所得数据记录于说明书附图的图3中：
通过上述检测结果能够表明，本发明制得的用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条灵敏度高，能够同时检测胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II，具有极佳的市场推广价值。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
Step1、抗体标记：将胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体和DNP-BSA抗体分别标记在300nm的荧光微球上，分别记作第一组分、第二组分和第三组分，接着按照1：1：1的体积对第一组分、第二组分和第三组分进行混合，混合均匀后记作混合喷涂液；
Step2、结合垫制备：将结合垫平铺在工作台上，按照10μl/张的量将混合喷涂液均匀喷涂在每张结合垫上，然后将结合垫置于49℃的条件下干燥过夜；
Step3、NC膜制备：将胃蛋白酶原I抗体和胃蛋白酶原II抗体分别稀释至1.25mg/mL，并将DNP单克隆抗体稀释至1mg/mL，然后在喷膜量为1.4μl/cm的NC膜上依次标记出间距为3-5mm的三条线，分别记作检测线T1、检测线T2和质控线，最后将稀释后的胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体和DNP单克隆抗体分别喷涂包被在检测线T1、检测线T2和质控线处，包被量为1μl/cm；
Step4、样品垫预处理：向Tris-HCl溶液中加入牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂，其中牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂的质量分数分别为0.3％、0.125％和0.3％，所得记作预处理溶液；将样品垫浸泡在预处理溶液中浸泡15-20min，接着置于49℃的条件下干燥过夜；
Step5、试纸条组装：在底板上依次粘贴样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸，其中，NC膜上靠近质控线的一端与吸水纸相连，在粘贴的过程中使相连的两部分互相重叠2mm，粘贴完成后切割成长59.8mm、宽3.95mm的大小，所得即为用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述Step4中Tris-HCl溶液的制备方法为：首先，称取1.2g三羟甲基氨基甲烷，溶于100mL去离子水中，所得记作Tris溶液；其次，吸取8.36mL的浓盐酸用去离子水定容至100mL，所得记作HCl溶液；最后，用HCl溶液将Tris溶液的pH值调至7。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述Step1中的标记方法包括以下步骤：
步骤1、向1.5mL的离心管中加入50μl固含量为1％的荧光微球，混匀后加入800μl的MES缓冲液，接着在14500r/min的条件下离心除上清液，重复以上步骤2次；
步骤2、向步骤1所得的体系内加入10μl的NHS溶液，混匀后加入10μl的EDC溶液，超声分散1min后于室温下孵育30min，在14500r/min的条件下离心10min弃上清，所得记作活化荧光微球；
步骤3、将步骤2中的活化荧光微球加入至500μl的Tris-HCl溶液中，超声分散1min后混匀，然后加入抗体组分进行标记，震荡偶联3h后，于14500r/min的条件下离心10min弃上清，所得记作标记组分；其中，所述抗体组分为胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体或DNP-BSA抗体；
步骤4、将步骤3中的标记组分加入到100μl的BSA溶液中，用移液枪吹打混匀，直至在紫外灯照射下无明显悬浮颗粒聚集，然后在室温下震荡30min，在14500r/min的条件下离心10min弃上清，接着加入洗涤溶液重悬后，离心弃上清，最后将所得产物溶于200μl的复溶溶液内混匀后即完成标记。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤1中MES缓冲液的制备方法为：称取1g的2-(N-吗啉)乙磺酸充分溶解于90mL去离子水中，用氢氧化钠溶液调节pH值至6后，加入去离子水定容至100mL。
5.根据权利要求3所述的一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的NHS溶液的制备方法为：称取5mg的N-羟基琥珀酰亚胺充分溶解于1mL的MES缓冲液中。
6.根据权利要求3所述的一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的EDC溶液的制备方法为：称取5mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐充分溶解于1mL的MES缓冲液中。
7.根据权利要求3所述的一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤4中BSA溶液的制备方法为：称取0.1g牛血清白蛋白充分溶解于10mL超纯水中。
8.根据权利要求3所述的一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤4中洗涤溶液的制备方法为：将20μl的吐温-20溶于10mL的Tris-HCl溶液中。
9.根据权利要求3所述的一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤4中复溶溶液的制备方法为：向Tris-HCl溶液中加入蔗糖、海藻糖、叠氮化钠、牛血清白蛋白和吐温-20，其中入蔗糖、海藻糖、叠氮化钠、牛血清白蛋白和吐温-20的质量分数分别为5％、3％、0.1％、1％和1％。
10.根据权利要求1-9任一项所述的一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原I/II含量的荧光定量检测试纸条的应用，其特征在于，所述应用方法为：先将样本滴加在试纸条的样品垫上，再使用荧光免疫分析仪检测检测线T1、检测线T2和质控线的荧光强度。
CN202310086839.0A 2023-02-02 2023-02-02 一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原i/ii含量的荧光定量检测试纸条的制备方法及其应用 Pending CN116183919A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310086839.0A CN116183919A (zh) 2023-02-02 2023-02-02 一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原i/ii含量的荧光定量检测试纸条的制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310086839.0A CN116183919A (zh) 2023-02-02 2023-02-02 一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原i/ii含量的荧光定量检测试纸条的制备方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116183919A true CN116183919A (zh) 2023-05-30

Family

ID=86432180

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310086839.0A Pending CN116183919A (zh) 2023-02-02 2023-02-02 一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原i/ii含量的荧光定量检测试纸条的制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116183919A (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004012434A (ja) * 2002-06-11 2004-01-15 Shima Kenkyusho:Kk ペプシノーゲン測定方法および測定用キット
CN105527431A (zh) * 2015-04-04 2016-04-27 吉林双正医疗科技有限公司 B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置及制备方法
CN110596393A (zh) * 2019-09-12 2019-12-20 宁波奥丞生物科技有限公司 胃蛋白酶原ⅰ和胃蛋白酶原ⅱ的联合检测方法
CN111413506A (zh) * 2018-01-30 2020-07-14 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种检测试纸条在制备检测pla2r抗体的试剂盒中的应用
CN111638369A (zh) * 2020-04-30 2020-09-08 吉林省格瑞斯特生物技术有限公司 胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置及其制备方法
CN113820486A (zh) * 2021-10-11 2021-12-21 河南沃迈生物科技有限公司 检测胃蛋白酶原i和ii的免疫层析试剂盒及其制备方法
CN114935656A (zh) * 2022-07-25 2022-08-23 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种优生优育十项抗体联合检测试剂盒及其制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004012434A (ja) * 2002-06-11 2004-01-15 Shima Kenkyusho:Kk ペプシノーゲン測定方法および測定用キット
CN105527431A (zh) * 2015-04-04 2016-04-27 吉林双正医疗科技有限公司 B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置及制备方法
CN111413506A (zh) * 2018-01-30 2020-07-14 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种检测试纸条在制备检测pla2r抗体的试剂盒中的应用
CN110596393A (zh) * 2019-09-12 2019-12-20 宁波奥丞生物科技有限公司 胃蛋白酶原ⅰ和胃蛋白酶原ⅱ的联合检测方法
CN111638369A (zh) * 2020-04-30 2020-09-08 吉林省格瑞斯特生物技术有限公司 胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置及其制备方法
CN113820486A (zh) * 2021-10-11 2021-12-21 河南沃迈生物科技有限公司 检测胃蛋白酶原i和ii的免疫层析试剂盒及其制备方法
CN114935656A (zh) * 2022-07-25 2022-08-23 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种优生优育十项抗体联合检测试剂盒及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4406510B2 (ja) 移動を阻止するために多孔度の減少を利用したアッセイ法
WO2010001598A1 (ja) 結合アッセイ用多孔性固相及びこれを用いた結合アッセイ法
JP7451431B2 (ja) 側方流動アッセイのシグナルを増幅させるシステム、装置および方法
CN112014575B (zh) 一种cyfra21-1测定试剂盒及其制备方法
JP2009085751A (ja) イムノクロマトグラフィー用試験具
EP2290367A1 (en) Method for detecting objective substance and kit for detecting objective substance
JP5006459B1 (ja) 標識用複合粒子
CN111033237B (zh) 使用剂量响应曲线的递减信号部分来测量包括高浓度分析物在内的分析物的夹心式测定
JP2013120120A (ja) ラテラルフロー型クロマト法用テストストリップ、およびそれを用いたアナライトの検出または定量方法
JP3578407B2 (ja) アッセイ方法
CN109239326A (zh) 基于磁颗粒纳米酶的微流控免疫芯片分析方法及应用
CN111351924B (zh) 一种基于酶诱导磷酸根离子激活的近红外荧光免疫分析试剂盒及检测方法
CN111684280A (zh) 用于检测高浓度分析物的侧向流动测定和方法
CN113687087A (zh) 一种甲状旁腺激素快速检测卡及其制备方法
JP5248264B2 (ja) イムノクロマトグラフ法による高感度測定キット
JPH11133023A (ja) 尿試料を使用する免疫クロマトグラフィー検定の尿素の影響を減らすための配合物
CN116183919A (zh) 一种用于检测血清、血浆或全血中胃蛋白酶原i/ii含量的荧光定量检测试纸条的制备方法及其应用
JP2014228385A (ja) 免疫試験方法および免疫試験キット
JP2001228151A (ja) 免疫クロマトグラフィー装置
CN112505319A (zh) 一种待检标志物免疫定量检测装置、检测方法及用途
CN109187943B (zh) 一种抗干扰试剂杯以及试剂杯内抗干扰涂层的制备方法
JP2000065832A (ja) フィルター状生物学的特異反応測定用担体およびそれを用いた測定方法
JP4771941B2 (ja) 免疫学的定量法と試薬
JPH04318462A (ja) 固相生物学的特異反応測定法およびそのための器具
CN111936852B (zh) 区分细菌感染和病毒感染的多重横向流测定物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination