CN111638369A - 胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置及其制备方法，属于医疗检测设备领域。由固相有高特异性胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II抗体、抗人IgG抗体、抗人IgM抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体的硝酸纤维素膜、吸附有荧光微球标记胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II抗体和幽门螺杆菌尿素酶抗原的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成。有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫荧光微球的用量，节约成本，既能同时检测标本中胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、幽门螺杆菌尿素酶IgG抗体和幽门螺杆菌尿素酶IgM抗体五种胃癌风险标志物，又没有增加生产操作的复杂度。检测试纸灵敏度高、特异性强、实用性强。

Description

胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗检测设备领域，特别涉及一种G-17、PGI、PGII、HP尿素酶IgG和IgM抗体联合检测装置及其制备方法，利用免疫荧光层析技术以及竞争法原理定量检测全血、血清、血浆标本中人胃泌素17(G-17)、胃蛋白酶原I(PGI)、胃蛋白酶原II(PGII)、幽门螺杆菌(HP)尿素酶IgG抗体和幽门螺杆菌尿素酶IgM抗体含量的检测装置及其制备方法，可实现胃功能评价、胃癌风险评估，同时可以实现各个标志物的灵敏、特异、快速检测。
背景技术
胃黏膜病变是由多种因素导致，包括药物、酒精、胃酸分泌异常、幽门螺杆菌感染等，其中幽门螺杆菌感染是主要因素；胃黏膜发生损伤后，其功能也会发生变化；胃癌是一组多因素参与的渐进性上皮细胞恶性病变，多由慢性萎缩性胃炎逐步发展而成，约7％的慢性萎缩性胃炎最终进展为原位癌。细胞异常增生和HP感染均可加速萎缩性胃炎的发展速度。我国属于胃癌高发区，每年死于胃癌的居民≥20万。通过根治术联合放化疗虽然可提高胃癌患者五年生存率，但对降低死亡率效果不明显；有研究证明，早期筛查是降低胃癌发病率和死亡率的关键。
胃泌素(gastrin，GAS)是由胃窦及十二指肠和空肠上段粘膜的G细胞分泌的一类胃肠道激素。Edkins于1905年首次在犬的胃窦中发现，后被人们熟知。人血清中的胃泌素主要包括两种异构体：胃泌素-17(gastrin-17，G-17)和胃泌素-34(gastrin-34，G-34)，其中胃泌素-17占85％-90％。所以人们通常选择胃泌素-17来代表血清胃泌素水平。生理状态下，胃泌素的主要通过影响胃酸的分泌来发挥作用，一方面，胃泌素可以直接刺激壁细胞分泌胃酸，胃酸将胃蛋白酶原激活为有活性的胃蛋白酶，从而分解蛋白质，同时这些分解产物又会反过来刺激胃泌素的分泌；另一方面，胃泌素也可以作用于肠嗜铬样细胞上的缩胆囊受体，促进肠嗜铬样细胞分泌组胺，进而通过组胺刺激壁细胞分泌胃酸。胃泌素在影响胃酸分泌的同时，也可以使食管下段括约肌的张力降低。最近的一些研究指出胃泌素可以作为胃粘膜功能的标志物：在慢性萎缩性胃炎中的胃泌素-17水平明显高于正常粘膜，也有人认为胃泌素-17的血清水平可能比血清总胃泌素更能准确地反映胃窦萎缩的严重程度。
胃蛋白酶原(pspsinogen，PG)是由胃粘膜中的主细胞分泌的一种蛋白质多肽链。人类的胃蛋白酶原主要分为两种生物化学和免疫学上不同的同工酶(PGI和PGII)。胃蛋白酶原I由胃腺主细胞和颈细胞分，胃蛋白酶原II还可以由贲门腺、幽门腺和近端十二指肠腺分泌。胃蛋白酶原本身并不具有生物活性，可以在胃酸的作用下活化为具有消化功能的胃蛋白酶，从而将机体摄入的蛋白质分解成易吸收的小分子肽类和氨基酸等。绝大多数的胃蛋白酶原被分泌到胃腔当中，仅有少部分可以被吸收入血。我们通常检测血清中的胃蛋白酶原来代表人体的胃蛋白酶水平。据报道，血清中的胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II水平可以准确反映胃粘膜功能和组织学状态。因此，血清胃蛋白酶原又被称为“血清学活检”。通过血清胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II检测结合精细的内窥镜检查可以有效的识别胃部疾病，尤其是可以发现早期的胃粘膜病变。已有的研究表明血清胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II水平在糜烂性胃炎，萎缩性胃炎，胃溃疡，胃癌和其他胃病中存在显著异常，并可以为以上这些疾病提供有价值的筛查方法。
幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori，HP)是一种定植于人体胃内的革兰氏阴性、微需氧杆菌。在1983年由Marshall和Warren共同发现。Malnick等人的研究证实，HP在人体中至少已经存在了58000年。流行病学研究指出HP感染在工业化国家中的流行率可以达到20％-50％，在发展中国家甚至可以达到80％以上。同时，现代医学已经证实，HP的感染与胃和十二指肠溃疡、胃癌、和胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤有关，已经制定的共识准则，建议包括消化性溃疡、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、胃癌及胃癌患者的一级亲属、原因不明的缺铁性贫血和免疫性血小板减少症均应接受根除HP的治疗。
目前，临床仍缺乏统一的早期胃癌筛查方法。肿瘤标志物及相关蛋白检测可有效反应细胞异常增生，适用于癌症早期筛查和术后随访。消化道造影和胸部透视主要用于观察胃溃疡和中晚期胃癌，但对于原位癌的敏感度和准确性较低；胃镜下活检属于创伤性操作且禁忌症较多，开展难度大。胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II是胃黏膜组织分泌的消化酶，胃底、胃窦等胃黏膜部位病变均可导致其水平改变。胃泌素17、胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ和幽门螺杆菌联合检测应用于早期胃癌筛查中效果显著，可有效提高胃癌确诊率，值得临床应用和推广。
目前常见的胃泌素7、胃蛋白酶原和幽门螺杆菌抗体的检测方法主要有：乳胶增强免疫比浊法、酶联免疫法、免疫荧光层析法，胶体金免疫层析法等。免疫荧光层析法需要标本量少，简便快速，适合于胃部相关指标的快速检测，不受时间、地点的限制。纵观免疫荧光层析法已有产品和文献报道，它们均是针对单一指标进行控制，或则指标组合不够全面、或则指标组合不够科学，只能检测或预警胃部损伤的某个阶段，而不能全面地、特异性地评估胃部损伤程度和预警胃癌的发生风险，容易出现漏诊和误诊现象，不利于临床诊断的进行，亟待改进。
免疫荧光层析法利用了具有独特荧光特性的3价稀土离子及其螯合物为示踪物代替荧光物质、酶、同位素、化学发光物质等，标记抗体或抗原，待抗原抗体反应发生后，用特定检测仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析；此方法学由于其低本底、高灵敏度和特异性、荧光寿命长、无放射性同位素污染等特点，自20世纪80年代Pettersson和Eskola等人首次报到后得到了迅速发展，并且广泛应用于临床疾病诊断。
在免疫荧光层析检测中，荧光抗体的淬灭及抗体包被浓度影响实验结果。蛋白质固着于硝酸纤维素膜(NC膜)作为待测样本的捕获试剂。由于检测结果完全取决于捕获试剂在膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在膜上均一、良好的吸附对免疫荧光层析检测结果非常重要。如果NC膜上结合的蛋白量不足或者蛋白结合力不够强，就会出现相当多的问题，在检测结果的检测线上非常明显。如果膜上结合的蛋白量太低，那么在结果中检测线显色较弱而且检测灵敏度降低。如果蛋白不能牢固的吸附于NC膜，那么在蛋白吸附于NC膜以前发生扩散，从而导致检测线较宽、显色较弱而不是鲜艳而清晰，使检测结果难以解释。在极端条件下，如果蛋白与NC膜的物理吸附作用太弱，流过的蛋白检测物和表面活性剂溶液可能将固着的蛋白从NC膜上洗掉，从而显示较宽或者根本不清晰的检测线，难以解释检测结果。
发明内容
本发明提供一种胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置及其制备方法，以解决现有技术存在的荧光抗体易淬灭和NC膜吸附蛋白量不足、结合力不强的问题。本发明制备的胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、幽门螺杆菌尿素酶IgG抗体、幽门螺杆菌尿素酶IgM抗体五合一联合检测装置，可实现标志物的灵敏、特异、快速检测，提高了对胃黏膜损伤、存在胃癌发生风险的患者进行心合理的综合判定，能够快速、准确进行早期预警及病情风险判断。
本发明采取的技术方案是，样品垫1、免疫荧光抗体玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫荧光抗体玻璃纤维膜2搭接，所述免疫荧光抗体玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述硝酸纤维素膜3上设置第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3、第四检测线T4、第五检测线T5、质控线(C1)和质控线(C2)；所述的第一检测线T1上固相有高特异性胃泌素17抗体，所述的第二检测线T2上固相有高特异性胃蛋白酶原I抗体，所述的第三检测线T3上固相有高特异性胃蛋白酶原II抗体，所述的第四检测线T4上固相有高特异性幽门螺杆菌尿素酶IgG抗体、所述的第五检测线T5上固相有高特异性幽门螺杆菌尿素酶IgM抗体；所述硝酸纤维素膜(3)上设置有检测线T1、T2、T3和质控线C1纵向排列在同一条硝酸纤维素膜(3)上，同时所述另一条硝酸纤维素膜(3)上设置有检测线T4、T5和质控线C2纵向排列在这条硝酸纤维素膜(3)，且两条硝酸纤维素膜(3)并列排列形成一个联合检测装置；或所述硝酸纤维素膜(3)上设置的检测线T1、T2、T3、T4、T5可以并列排列在五条硝酸纤维素膜(3)上，设置有三个质控线(C1)并对应T1、T2、T3，另设置有两个质控线(C2)并对应T4、T5，共同形成一个联合检测装置；所述的质控线(C1)上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体；所述的质控线(C2)上喷点抗幽门螺杆菌尿素酶多克隆抗体。
一种胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置的制备方法，包括下列步骤：
(a)免疫荧光微球的制备，取100ul固含为1％的微球悬浮液，用超纯水稀释10倍,即1000ul，加入到EP管中。取40ul的N-羟基琥珀酰亚胺液(NHS)加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液(EDC)加入微球悬浮液液中混匀，常温下反应0.5小时。将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件10000r/min、20min。倒掉上清液，加入1ml超纯水，然后用超声波超声分散均匀；
(b)活化的微球交联记胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、幽门螺杆菌尿素酶IgG、幽门螺杆菌尿素酶IgM抗体，取1ml活化后的免疫荧光微球悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体。加入抗体后，大约反应30s-120s后，再到超声波上超声20-40秒，然后再反应1小时。加牛血清白蛋白BSA进行封闭1小时。将封闭好的微球进行离心，速度为10000r/min,15min。将免疫荧光微球缓冲液加入到离心后的微球中，使微球分散均匀，待用。
(c)采用缓冲液稀释步骤(b)的免疫荧光微球交联标记抗体获得免疫荧光抗体溶液，用免疫荧光抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫荧光微球玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液预处理后，喷点与油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合的胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、幽门螺杆菌尿素酶IgG抗体、幽门螺杆菌尿素酶IgM作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫荧光微球玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
本发明步骤(b)所述的荧光微球缓冲液由Tris-HCL液、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，海藻糖浓度为5％，牛血清白蛋白BSA浓度为1％。
本发明步骤(d)所述的将硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液预处理是：用聚乙二醇丙三醇处理液浸泡硝酸纤维素膜1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
本发明步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇稀释到浓度为0.5％组成，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇和多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇、多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)、PEG20000混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)所述的油酸修饰的硫化锌纳米颗粒分别结合胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、幽门螺杆菌尿素酶IgG、幽门螺杆菌尿素酶IgM抗体是：以油酸修饰的ZnS作为载体，取1mL胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、幽门螺杆菌尿素酶IgG、幽门螺杆菌尿素酶IgM抗体溶液，搅拌1小时后，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，去离子水各洗2遍。
本发明步骤(d)所述的油酸修饰的硫化锌纳米颗粒制备方法：取油酸无水乙醇溶液15ml加入到15ml浓度为0.3mol/L的醋酸锌水溶液中，40℃水浴搅拌，用氨水调节pH值，再加入15ml浓度为0.3mol/L的硫化钠水溶液，反应5min后，加入5ml SDS水溶液，待混合均匀后，将该反应液倒入90ml水热釜中。水热釜密闭后放入恒温干燥箱内，在一定温度下恒温反应一定时间。待反应结束，降温至50℃，取出产物。用丙酮，去离子水，乙醇洗涤，离心分离，在50℃下真空干燥2h得到粉体ZnS，存放待用。
本发明步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂(烷基酚聚氧乙烯醚)组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％，酪蛋白浓度为0.1～0.2％、表面活性剂浓度为0.5～1％。
乙二醇与环氧氯丙烷用碱催化其反应,产物用稀盐酸中和,四氯化碳萃取,减压蒸馏,得到聚乙二醇丙三醇(PEGG),为淡黄色粘稠物。PEGG能与水以任意比例混溶,也能溶于一般的有机溶剂如乙醇、丙酮、四氢呋喃、氯仿,有一定的表面活性。聚乙二醇丙三醇的结构中含有多个羟基可供偶联,活化过程简单，方便NC膜表面固定蛋白。常规条件下，单位面积的NC膜上结合抗体的数量是有限的，采用聚乙二醇丙三醇处理之后，可以让单位面积的NC膜上结合抗体数量增加，进而可以实现更高的检测灵敏度。
在改善NC膜对蛋白吸附基础上，探讨蛋白对NC膜吸附效果也是提高免疫荧光微球灵敏度的另一途径；油酸或十二烷基硫酸钠修饰的ZnS不仅具有纳米级的粒径尺寸、且具有良好的水溶性与生物相容性，利用其外表面的功能性基团，在水介质中均匀分散，可与生物大分子相结合。油酸修饰的硫化锌纳米颗粒具有较好的稳定性、易于制备、生物相容性较好及较低的免疫原性等优势，在生物医学领域研究较为广泛。但在免疫荧光层析技术中尚未有报道应用。本研究探讨了油酸修饰的硫化锌纳米颗粒对NC膜包被抗体的影响，先将划膜用的抗体先与油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合，封闭，离心纯化，去掉未结合的抗体，然后复溶到一定比例，然后划膜，这样一个油酸修饰的硫化锌纳米颗粒可以结合多个抗体，从而增加了包被抗体效率，灵敏度也会大大提高。
为了提高免疫荧光层析技术的灵敏度，我们通过对硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液进行了预处理，将包被NC的抗体与硫化锌纳米颗粒结合，达到了提高试纸灵敏度的目的。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的检测装置结构简单，构思新颖，将胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、幽门螺杆菌尿素酶IgG、幽门螺杆菌尿素酶IgM抗体包被于硝酸纤维膜膜上，特异性强，既能同时检测标本中胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、幽门螺杆菌尿素酶IgG、幽门螺杆菌尿素酶IgM抗体，又没有增加生产操作的复杂度。
2、免疫荧光微球制备步骤中，通过配合合适的荧光微球缓冲液和样品垫处理液，可保证免疫荧光微球释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫荧光微球的用量，节约成本。
3、本发明对硝酸纤维素膜进行预处理，对包被硝酸纤维素膜的抗体进行了修饰，提高了检测试纸灵敏度、特异性。
4、本发明的检测装置操作简便，不需要专业人员操作。实用性强。
附图说明
图1是本发明的结构示意图，图中检测线T1、T2、T3和C1纵向排列在同一条免疫硝酸纤维素膜上，同时T4、T5和C2纵向排列在另一条免疫硝酸纤维素膜，两条免疫硝酸纤维素膜并列排列形成一个联合检测装置；
图2是图1的A-A剖视图；
图3是图1的B-B剖视图；
图4是本发明的另一种结构示意图，图中检测线T1、T2、T3、T4、T5可以并列排列在五条免疫硝酸纤维素膜上，设置有三个质控线C1并对应T1、T2、T3，另设置有两个质控线C2并对应T4、T5，共同形成一个联合检测装置；
图5是图4的C-C剖视图；
图6是图4的D-D剖视图；
图7是图4的E-E剖视图；
图8是图4的F-F剖视图；
图9是图4的G-G剖视图。
具体实施方式
实施例1
样品垫1、免疫荧光抗体玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫荧光抗体玻璃纤维膜2搭接，所述免疫荧光抗体玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述硝酸纤维素膜3上设置第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3、第四检测线T4、第五检测线T5、质控线(C1)和质控线(C2)；所述的第一检测线T1上固相有高特异性胃泌素17抗体，所述的第二检测线T2上固相有高特异性胃蛋白酶原I抗体，所述的第三检测线T3上固相有高特异性胃蛋白酶原II抗体，所述的第四检测线T4上固相有高特异性幽门螺杆菌尿素酶IgG抗体、所述的第五检测线T5上固相有高特异性幽门螺杆菌尿素酶IgM抗体；所述硝酸纤维素膜(3)上设置有检测线T1、T2、T3和质控线C1纵向排列在同一条硝酸纤维素膜(3)上，同时所述另一条硝酸纤维素膜(3)上设置有检测线T4、T5和质控线C2纵向排列在这条硝酸纤维素膜(3)，且两条硝酸纤维素膜(3)并列排列形成一个联合检测装置；或所述硝酸纤维素膜(3)上设置的检测线T1、T2、T3、T4、T5可以并列排列在五条硝酸纤维素膜(3)上，设置有三个质控线(C1)并对应T1、T2、T3，另设置有两个质控线(C2)并对应T4、T5，共同形成一个联合检测装置；所述的质控线(C1)上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体；所述的质控线(C2)上喷点抗幽门螺杆菌尿素酶多克隆抗体。
制备方法：
(a)、免疫荧光微球的制备，取100ul固含为1％的微球悬浮液，用超纯水稀释10倍,即1000ul，加入到EP管中。取40ul的N-羟基琥珀酰亚胺液(NHS)加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液(EDC)加入微球悬浮液液中混匀，常温下反应0.5小时。将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件10000r/min、20min。倒掉上清液，加入1ml超纯水，然后用超声波超声分散均匀。
(b)、活化的微球交联抗体，取1ml活化后的微球悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体。加入抗体后，大约反应1min后，再到超声波上超声30秒左右，然后再反应1小时。加BSA进行封闭1小时。将封闭好的微球进行离心，速度为10000r/min,15min。将保存液加入到离心后的微球中，使微球分散均匀，待用。
(c)、采用优化的荧光抗体缓冲液稀释荧光抗体获得免疫荧光抗体溶液，用免疫荧光抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫荧光微球玻璃纤维膜；所述的荧光抗体缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为5％、BSA浓度为1％，pH为8.5；
(d)、固相硝酸纤维素膜
聚乙二醇丙三醇处理液预处理硝酸纤维素膜
配制聚乙二醇丙三醇处理液：聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
聚乙二醇丙三醇处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入聚乙二醇丙三醇处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)硫化锌纳米颗粒修饰胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、幽门螺杆菌尿素酶IgG抗体、幽门螺杆菌尿素酶IgM
油酸修饰的硫化锌纳米颗粒制备：取油酸无水乙醇溶液15ml加入到15ml浓度为0.3mol/L的醋酸锌水溶液中，40℃水浴搅拌，用氨水调节pH值，再加入15ml浓度为0.3mol/L的硫化钠水溶液，反应5min后，加入5ml SDS水溶液，待混合均匀后，将该反应液倒入90ml水热釜中。水热釜密闭后放入恒温干燥箱内，在一定温度下恒温反应一定时间。待反应结束，降温至50℃，取出产物。用丙酮，去离子水，乙醇洗涤，离心分离，在50℃下真空干燥2h得到粉体ZnS，存放待用。
硫化锌纳米颗粒修饰胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、幽门螺杆菌尿素酶IgG抗体、幽门螺杆菌尿素酶IgM：
以油酸修饰的ZnS作为载体，取1mL胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、幽门螺杆菌尿素酶IgG抗体、幽门螺杆菌尿素酶IgM溶液，搅拌1小时后，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，去离子水各洗2遍。
3)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将硫化锌纳米颗粒-胃泌素17抗体、硫化锌纳米颗粒-胃蛋白酶原I抗体、硫化锌纳米颗粒-胃蛋白酶原II抗体、硫化锌纳米颗粒-幽门螺杆菌尿素酶IgG抗体、硫化锌纳米颗粒-幽门螺杆菌尿素酶IgM抗体稀释至1.5mg/ml，质控线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用；
(e)样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其种样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5％、酪蛋白浓度为0.1％、表面活性剂浓度为0.5％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
将预处理的样品垫、免疫荧光玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
定量检测：通过荧光定量检测仪检测，本检测装置检测胃泌素17最低检测值：1ng；胃蛋白酶原I最低检测值：0.5ng；胃蛋白酶原II最低检测值：0.5ng；幽门螺杆菌尿素酶IgG和IgM抗体最低检测值：0.5ng。
实施例2
配制聚乙二醇丙三醇处理液：由聚乙二醇丙三醇和多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.7％，酪蛋白浓度为0.15％、表面活性剂浓度为0.7％；
其余同实施例1。
实施例3
配制聚乙二醇丙三醇处理液：由聚乙二醇丙三醇、多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)与PEG2000混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为1％，酪蛋白浓度为0.2％、表面活性剂浓度为1％。
其余同实施例1。
下边通过实验来进一步说明本发明的效果。
实验例1：
1、聚乙二醇丙三醇处理液对硝酸纤维素膜抗淬灭能力的比较
1.1材料与方法
1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司
1.2硝酸纤维素膜处理方法
1.2.1配制聚乙二醇丙三醇处理液
配制三种聚乙二醇丙三醇处理液：聚乙二醇丙三醇组，聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％组成；聚乙二醇丙三醇处理液多聚赖氨酸组，聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％；聚乙二醇丙三醇、多聚赖氨酸和PEG20000组，，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，PEG20000浓度为0.1％，三组处理液均经0.22μm滤膜过滤，备用。
1.2.2硝酸纤维素膜处理方法
将硝酸纤维素膜放入聚乙二醇丙三醇处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
1.3实验方法
分别将未处理和已处理过的硝酸纤维素膜按照上述实施例工艺流程制备胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、幽门螺杆菌尿素酶IgG、幽门螺杆菌尿素酶IgM抗体荧光微球检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较硝酸纤维素膜未处理和处理后荧光指标差异。
1.4结果:
1.4.1荧光强度比较
取处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察荧光显色情况判断处理后膜对荧光淬灭能力的影响，结果见表1。结果显示，处理后的硝酸纤维素膜在溶液浸润性方面要明显优于未处理膜，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明荧光淬灭能力降低，提高了反应灵敏度。
表1硝酸纤维素膜荧光淬灭能力比较
Figure BDA0002477295540000111
1.4.2硝酸纤维素膜稳定性比较
取聚乙二醇丙三醇处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察实验数据来判断处理后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表2。表2结果与表1结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表2硝酸纤维素膜加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0002477295540000112
实验例2：
2、硫化锌纳米颗粒修饰胃泌素17抗体
2.1材料与方法
2.1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司
2.1.2硫化锌纳米颗粒修饰胃泌素17抗体
2.1.3油酸修饰的硫化锌纳米颗粒制备
取油酸无水乙醇溶液15ml加入到15ml浓度为0.3mol/L的醋酸锌水溶液中，40℃水浴搅拌，用氨水调节pH值，再加入15ml浓度为0.3mol/L的硫化钠水溶液，反应5min后，加入5ml SDS水溶液，待混合均匀后，将该反应液倒入90ml水热釜中。水热釜密闭后放入恒温干燥箱内，在一定温度下恒温反应一定时间。待反应结束，降温至50℃，取出产物。用丙酮，去离子水，乙醇洗涤，离心分离，在50℃下真空干燥2h得到粉体ZnS，存放待用。
2.2实验方法
分别将硫化锌纳米颗粒修饰的胃泌素17抗体与未修饰的胃泌素17抗体按照上述实施例工艺流程制备胃泌素17抗体检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较硫化锌纳米颗粒处理和未处理对蛋白吸附力和稳定性指标差异。
2.3结果
2.3.1蛋白吸附力比较
取硫化锌纳米颗粒处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察显色情况判断处理后膜对蛋白吸附能力，结果见表3。结果显示，硫化锌纳米颗粒修饰组膜尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明蛋白吸附能力明显增强，提高了反应灵敏度。
表3石墨纳米颗粒修饰对蛋白吸附能力比较
Figure BDA0002477295540000121
2.3.2稳定性比较
取硫化锌纳米颗粒处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察显色情况来判断硫化锌修饰后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表4。表4结果与表3结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表4加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0002477295540000131
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置，其特征在于：样品垫(1)、免疫荧光微球玻璃纤维膜(2)、免疫硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4)分别粘贴在塑料板(5)，所述免疫硝酸纤维素膜(3)的两端分别与吸收垫(4)、免疫荧光微球玻璃纤维膜(2)搭接，所述免疫荧光微球玻璃纤维膜(2)的另一端与样品垫(1)搭接；所述免疫硝酸纤维素膜(3)上设置第一检测线(T1)、第二检测线(T2)、第三检测线(T3)、第四检测线(T4)、第五检测线(T5)、质控线(C1)和质控线(C2)；所述的第一检测线(T1)上固相有高特异性胃泌素17抗体；所述的第二检测线(T2)上固相有高特异性胃蛋白酶原I抗体；所述的第三检测线(T3)上固相有高特异性胃蛋白酶原II抗体；所述的第四检测线(T4)上固相有高特异性抗人IgG抗体；所述的第五检测线(T5)上固相有高特异性抗人IgM抗体；所述免疫硝酸纤维素膜(3)上设置有检测线T1、T2、T3和质控线C1纵向排列在同一条硝酸纤维素膜(3)上，同时所述另一条免疫硝酸纤维素膜(3)上设置有检测线T4、T5和质控线C2纵向排列在这条免疫硝酸纤维素膜(3)，且两条免疫硝酸纤维素膜(3)并列排列形成一个联合检测装置；或所述免疫硝酸纤维素膜(3)上设置的检测线T1、T2、T3、T4、T5可以并列排列在五条免疫硝酸纤维素膜(3)上，设置有三个质控线(C1)并对应T1、T2、T3，另设置有两个质控线(C2)并对应T4、T5，共同形成一个联合检测装置；所述的质控线(C1)上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体；所述的质控线(C2)上喷点抗幽门螺杆菌尿素酶多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
(a)免疫荧光微球的制备，取100ul固含为1％的微球悬浮液，用超纯水稀释10倍,即1000ul，加入到EP管中，取40ul的N-羟基琥珀酰亚胺液(NHS)加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液(EDC)加入微球悬浮液液中混匀，常温下反应0.5小时，将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件10000r/min、20min，倒掉上清液，加入1ml超纯水，然后用超声波超声分散均匀；
(b)活化的免疫荧光微球交联标记胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II抗体和幽门螺杆菌尿素酶IgG抗体、幽门螺杆菌尿素酶IgM抗体，取1ml活化后的免疫荧光微球悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，大约反应30s-120s后，再到超声波上超声20-40秒，然后再反应1小时，加牛血清白蛋白BSA进行封闭1小时，将封闭好的微球进行离心，速度为10000r/min，15min，将免疫荧光微球缓冲液加入到离心后的微球中，使微球分散均匀，待用；
(c)采用缓冲液稀释步骤(b)的免疫荧光微球交联标记抗体获得免疫荧光抗体溶液，用免疫荧光抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫荧光抗体玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液预处理后，喷点与油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合的胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II抗体和幽门螺杆菌尿素酶IgG抗体、幽门螺杆菌尿素酶IgM抗体作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫荧光微球玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
3.根据权利要求2所述的胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(c)所述的免疫荧光微球缓冲液由Tris-HCL液、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，海藻糖浓度为5％，牛血清白蛋白BSA浓度为1％。
4.根据权利要求2所述的胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的将硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液预处理是：用聚乙二醇丙三醇处理液浸泡硝酸纤维素膜1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
5.根据权利要求2或4所述的胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇稀释到浓度为0.5％组成，经0.22μm滤膜过滤，备用。
6.根据权利要求2或5所述的胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇和多聚赖氨酸SIGMA,150KD～300KD混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
7.根据权利要求2或5所述的胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇、多聚赖氨酸SIGMA,150KD～300KD、PEG20000混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
8.根据权利要求2所述的胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的油酸修饰的硫化锌纳米颗粒分别结合胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、幽门螺杆菌尿素酶IgG、幽门螺杆菌尿素酶IgM抗体是：以油酸修饰的ZnS作为载体，取1mL胃泌素17、胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、幽门螺杆菌尿素酶IgG、幽门螺杆菌尿素酶IgM抗体溶液，搅拌1小时后，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，去离子水各洗2遍。
9.根据权利要求2或8所述的胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的油酸修饰的硫化锌纳米颗粒制备方法：取油酸无水乙醇溶液15ml加入到15ml浓度为0.3mol/L的醋酸锌水溶液中，40℃水浴搅拌，用氨水调节pH值，再加入15ml浓度为0.3mol/L的硫化钠水溶液，反应5min后，加入5ml SDS水溶液，待混合均匀后，将该反应液倒入90ml水热釜中，水热釜密闭后放入恒温干燥箱内，在一定温度下恒温反应一定时间，待反应结束，降温至50℃，取出产物，用丙酮，去离子水，乙醇洗涤，离心分离，在50℃下真空干燥2h得到粉体ZnS，存放待用。
10.根据权利要求2所述的胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％，酪蛋白浓度为0.1～0.2％、表面活性剂浓度为0.5～1％。
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