CN114460310A - 一种彩色乳胶微球及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种彩色乳胶微球及其制备方法与应用，彩色乳胶微球为硼酸化修饰微球，硼酸化修饰微球包含有机染料的聚苯乙烯微球或硅胶微球，微球的粒径为200‑600nm，微球表面修饰有羧基或氨基。用于制备脂蛋白磷脂酶A2和全程C‑反应蛋白联合检测试纸条或胃蛋白酶原I、II和胃泌素17联合检测试纸条，通过一种简单、成本低的偶联方式，与抗体的Fc部分结合，通过提高标记抗体的活性来提高乳胶微球这种简单传统的标记物的检测灵敏度，以较低成本达到与荧光免疫层析产品相近的检测性能。

Description

一种彩色乳胶微球及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体地说，涉及一种彩色乳胶微球及其制备方法与应用。
背景技术
全国第三次的死因抽样调查显示,脑血管病已经成为中国国民第一位的死亡原因。据统计缺血性卒中占脑血管病的75~80%,而颈动脉粥样硬化斑块破裂、溃疡、脱落是缺血性卒中的重要原因之一。因此，颈动脉粥样硬化斑块的防治显得尤为重要。大量研究发现,炎症在动脉粥样硬化斑块发生、发展、溃疡、斑块内出血和破裂过程中起着关键作用，脂蛋白相关磷脂酶A2(LiPoProtein-associated PhosPhoLiPase A2，LP-PLA2)是近年来发现的一种新型炎性标记物,可能参与了人颈动脉粥样硬化斑块的发生、发展、破裂和血栓形成。
CRP是炎症并发动脉粥样硬化的良好指标，超敏C-反应蛋白可区别在正常范围内的低程度炎症反应中CRP的水平。许多近期研究认为hs-CRP可以预测动脉粥样硬化病人的危险性，其中一些人日后会发生冠状动脉病、脑血管病或周围动脉的病变。hs-CRP分析的预后价值，首先是在急性局部缺血和不稳定的心绞痛的病人中提出的。
前瞻性研究显示，hs-CRP是已知冠心病患者未来心血管病发病和死亡的预测指标。ECTA研究组的资料显示，稳定型心痛(SAP)和不稳定型心绞痛(UAP)患者，hs-CRP浓度每升高一个标准差，非致命性心肌梗死或心性猝死的相对危险增加45%，几个大样本的前瞻性的研究报导，血浆 hs-CRP基线水平增高的健康人将来发生心血管疾病的危险性显著升高。hs-CRP位于最高四分位数的患者未来猝危险增加2倍，未来心肌梗死危险增高3倍，未来周围血管疾病的危险增加4倍。
研究报道，无论在入院或出院时测定hs-CRP，对于ACS患者均有预测价值。Linzzo等人发现，重度不稳定型心绞痛(UAP)患者入院时若hs-CRP浓度>3mg/L，比hs-CRP<3mg/L的患者心血管事件发生率高。后来有发现，同一组hs-CRP>3mg/L的UAP患者出院时有较高的再住院及发生心肌硬死的危险。在另一组UAP研究中，Ferreiros等证实，出院时测定hs-CRP比入院时测定能更好地预测90天的不良后果。
现有的检测脂蛋白磷脂酶A2和全程C-反应蛋白的方法有酶联免疫分析法、化学发光法、免疫层析法、微流控法等。免疫层析法根据使用的标记物的不同，又分为胶体金法、彩色微球法、荧光微球法、量子点法等等。其标记方法为物理吸附或化学偶联。化学偶联是使用EDC或EDC/NHS做为偶联剂，将微球表面的羧基基团与抗体的游离氨基基团进行缩合反应。
原有的技术，无论试物理吸附还是化学偶联，都会导致一部分偶联的脂蛋白磷脂酶A2和全程C-反应蛋白抗体没有活性。因为脂蛋白磷脂酶A2和全程C-反应蛋白抗体分为Fab和Fc两个部分，其中Fab是与抗原反应的活性部分。因此，如果微球是与抗体的Fab部分结合，那么该抗体与抗原结合的能力就会下降。相反，只有与抗体Fc结合的微球，才能与抗原反应。因此原有的技术往往灵敏度低，需要别的办法提高灵敏度，比如使用荧光微球或量子点微球，但这也增加了相应的成本。
胃蛋白酶原（pepsinogen，简称PG）由375个氨基酸组成的蛋白多肽链，平均相对分子质量为42000，属天冬氨酸蛋白酶家族，本身无活性，在酸性条件下可转变为具有生物活性的胃蛋白酶，其主要由胃黏膜腺体细胞分泌产生。根据生化性质和免疫功能的不同，PG可分为PG I(又称PG A)和PG II(又称PG C)两种亚型。其中PG I主要由胃底腺的主细胞和颈粘液细胞分泌，而PG II则由胃黏膜腺体(包括胃贲门腺，胃底腺、胃窦幽门腺)和近端十二指肠Brenner腺细胞分泌。人体几乎所有PG来自胃，大部分合成后的PG释放进入胃腔，仅有1%左右进入血液循环，通过血清PG可反映胃黏膜状态，起到胃黏膜“血清学活检”的作用。
胃泌素17（Gastrin-17，G-17）是由胃肠道G细胞分泌的多肽类激素，其与胆囊收缩素受体(cholecystokinin receptor，CCKR)结合后通过一系列信号转导而发挥生物学效应，主要参与刺激胃酸分泌及营养胃肠道黏膜。血清胃泌素17不仅受病变部位、萎缩程度、幽门螺杆菌感染等胃内因素的影响，胃外因素和药物因素也是结果判定的重要影响因素。血清胃泌素17是胃黏膜“血清学活检”的内容之一，它可以反映胃黏膜的功能状态，因此在临床胃肠疾病的辅助诊断中受到广泛重视
现有的检测胃蛋白酶原I、II和胃泌素17的方法有酶联免疫分析法、化学发光法、免疫层析法、微流控法等。免疫层析法根据使用的标记物的不同，又分为胶体金法、彩色微球法、荧光微球法、量子点法等等。其标记方法为物理吸附或化学偶联。化学偶联是使用EDC或EDC/NHS做为偶联剂，将微球表面的羧基基团与抗体的游离氨基基团进行缩合反应。
原有的技术，无论试物理吸附还是化学偶联，都会导致一部分偶联的胃蛋白酶原I、II和胃泌素17抗体没有活性。因为胃蛋白酶原I、II和胃泌素17抗体分为Fab和Fc两个部分，其中Fab是与抗原反应的活性部分。因此，如果微球是与抗体的Fab部分结合，那么该抗体与抗原结合的能力就会下降。相反，只有与抗体Fc结合的微球，才能与抗原反应。因此原有的技术往往灵敏度低，需要别的办法提高灵敏度，比如使用荧光微球或量子点微球，但这也增加了相应的成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种彩色乳胶微球及其制备方法与应用，提高标记抗体的活性来提高标记物的检测灵敏度。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种彩色乳胶微球，彩色乳胶微球为硼酸化修饰微球，硼酸化修饰微球包含有机染料的聚苯乙烯微球或硅胶微球，微球的粒径为200-600nm，微球表面修饰有羧基或氨基，通过4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐将含硼酸的分子化合物修饰到微球表面，形成硼酸化修饰的微球；所述含硼酸的分子化合物为3-氨基苯硼酸、3-氨基苯硼酸盐酸盐、邻氨基苯硼酸盐酸盐、4-氨基苯基硼酸、3-氨基-4-氯苯基硼酸、4-羧基-3-氯苯硼酸、5-羧基-2-氯苯硼酸、4-羧基苯硼酸、2-羧基苯硼酸、4-羧基-2-甲基苯基硼酸中的至少一种。
上述彩色乳胶微球的制备方法，包括以下步骤：使用200-400nm的表面基团为羧基的彩色微球，在pH4-7，浓度20mM-200mM的MES缓冲液中，加入含硼酸的分子化合物，其与微球的摩尔比为1：1-1：100；充分混匀后，加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，其与微球的摩尔比为1：1-1：10；常温～37℃反应3-6h，加入乙醇胺和聚乙烯吡咯烷酮对微球表面进行封闭。
一种脂蛋白磷脂酶A2和全程C-反应蛋白联合检测试纸条，一张检测卡中，包含两个检测试纸条，一个用于检测脂蛋白磷脂酶A2，一个用于检测C-反应蛋白，所述试纸条均包括样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫；
所述结合垫分别包被有脂蛋白磷脂酶A2抗体和C-反应蛋白抗体标记的上述的彩色乳胶微球，彩色乳胶微球与脂蛋白磷脂酶A2抗体和C-反应蛋白抗体的Fc片段特异性结合。
所述彩色乳胶微球通过硼酸基团与脂蛋白磷脂酶A2抗体和C-反应蛋白抗体Fc片段的糖基基团发生的二醇糖基化反应，将抗体与微球连接。
上述的脂蛋白磷脂酶A2和全程C-反应蛋白联合检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：
（1）抗体偶联：用pH5-9的HEPES缓冲液重悬权制得的硼酸化修饰的彩色微球，分别将脂蛋白磷脂酶A2抗体和C-反应蛋白抗体加入，每mg微球所加抗体量为50-200μg，常温～37℃反应5-60min；
（2）微球封闭：使用终浓度为5%的葡萄糖或葡聚糖，对上述标记好的微球封闭10-30min，百分比浓度为质量百分比浓度；
（3）结合垫的制备：将上述微球按3-6μL/cm喷涂在结合垫上，干燥备用；
（4）层析膜制备：将脂蛋白磷脂酶A2配对抗体和C-反应蛋白配对抗体稀释至1mg/mL，1μL/cm的喷量分别包被在两张层析膜上，做为T线；同时用二抗包被C线，干燥备用；
（5）试纸条的组装：将层析膜、结合垫、样品垫和吸水垫依次粘贴在PVC底板上，切成试纸条后装入检测卡中。
一种胃蛋白酶原I、II和胃泌素17联合检测试纸条，一张检测卡中，包含三个检测试纸条，一个用于检测胃蛋白酶原I，一个用于检测胃蛋白酶原II，一个用于检测胃泌素17，所述试纸条均包括样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫；
所述结合垫分别包被有胃蛋白酶原I、II和胃泌素17抗体标记的上述彩色乳胶微球，彩色乳胶微球与胃蛋白酶原I、II和胃泌素17抗体的Fc片段特异性结合。
所述彩色乳胶微球通过硼酸基团与胃蛋白酶原I、II和胃泌素17抗体Fc片段的糖基基团发生的二醇糖基化反应，将抗体与微球连接。
上述的胃蛋白酶原I、II和胃泌素17联合检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：
（1）抗体偶联：用pH5-9的HEPES缓冲液重悬硼酸化修饰的彩色微球，分别将胃蛋白酶原I、II和胃泌素17抗体加入，每mg微球所加抗体量为50-200μg；常温～37℃反应5-60min；
（2）微球封闭：使用终浓度为5%的葡萄糖或葡聚糖，对制得的微球封闭10-30min，百分比浓度为质量百分比浓度；
（3）结合垫的制备：将上述微球按3-6μL/cm喷涂在结合垫上，干燥备用；
（4）层析膜制备：将胃蛋白酶原I配对抗体、胃蛋白酶原II配对抗体和胃泌素17配对抗体稀释至1mg/mL，1μL/cm的喷量分别包被在两张层析膜上，做为T线；同时用二抗包被C线，干燥备用；
（5）试纸条的组装：将层析膜、结合垫、样品垫和吸水垫依次粘贴在PVC底板上，切成试纸条后装入检测卡中。
本发明的有益效果是：
1. 灵敏度高，由于标记到微球上的抗体是通过硼酸基团与抗体的Fc片段相连，所以标记的抗体活性更高，因此以常规彩色乳胶微球为初始原料和较少的抗体用量便可实现1ng/mL的PGI和PGII检测灵敏度和0.5pmol/L的G-17检测灵敏度。
2. 标记过程简便、快速，硼酸基团与抗体的Fc片段的糖基发应，不需要EDC和NHS等额外的偶联试剂，标记过程快速且不会发生微球聚集。
3．通过一种简单、成本低的偶联方式，与脂蛋白磷脂酶A2和全程C-反应蛋白抗体的Fc部分结合，通过提高标记抗体的活性来提高乳胶微球这种简单传统的标记物的检测灵敏度，以较低成本达到与荧光免疫层析产品相近的检测性能。
附图说明
图1是抗体Fc特异性偶联示意图；
图2是实施例1检测卡示意图；
图3是不同pH对硼酸修饰的影响图；
图4是不同pH对抗体偶联的影响图；
图5是不同抗体用量的影响图；
图6是不同标记时间的影响图；
图7是实施例1脂蛋白磷脂酶A2的定量曲线图；
图8是实施例1的C-反应蛋白的定量曲线图；
图9是实施例2的检测卡示意图；
图10是PGI的定量曲线图；
图11是PGII的定量曲线图；
图12是G-17的定量曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种彩色乳胶微球，彩色乳胶微球为硼酸化修饰微球，硼酸化修饰微球包含有机染料的聚苯乙烯微球或硅胶微球，微球的粒径为200-600nm，微球表面修饰有羧基或氨基，通过4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐将含硼酸的分子化合物修饰到微球表面，形成硼酸化修饰的微球；所述含硼酸的分子化合物为3-氨基苯硼酸、3-氨基苯硼酸盐酸盐、邻氨基苯硼酸盐酸盐、4-氨基苯基硼酸、3-氨基-4-氯苯基硼酸、4-羧基-3-氯苯硼酸、5-羧基-2-氯苯硼酸、4-羧基苯硼酸、2-羧基苯硼酸、4-羧基-2-甲基苯基硼酸中的至少一种。
上述彩色乳胶微球的制备方法，包括以下步骤：使用200-400nm的表面基团为羧基的彩色微球，在pH4-7，浓度20mM-200mM的MES缓冲液中，加入含硼酸的分子化合物，其与微球的摩尔比为1：1-1：100；充分混匀后，加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，其与微球的摩尔比为1：1-1：10；常温～37℃反应3-6h，加入乙醇胺和聚乙烯吡咯烷酮对微球表面进行封闭。
一种脂蛋白磷脂酶A2和全程C-反应蛋白联合检测试纸条，一张检测卡中，包含两个检测试纸条，一个用于检测脂蛋白磷脂酶A2，一个用于检测C-反应蛋白，所述试纸条均包括样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫；
所述结合垫分别包被有脂蛋白磷脂酶A2抗体和C-反应蛋白抗体标记的上述的彩色乳胶微球，彩色乳胶微球与脂蛋白磷脂酶A2抗体和C-反应蛋白抗体的Fc片段特异性结合。
所述彩色乳胶微球通过硼酸基团与脂蛋白磷脂酶A2抗体和C-反应蛋白抗体Fc片段的糖基基团发生的二醇糖基化反应，将抗体与微球连接。
上述的脂蛋白磷脂酶A2和全程C-反应蛋白联合检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：
（1）抗体偶联：用pH5-9的HEPES缓冲液重悬权制得的硼酸化修饰的彩色微球，分别将脂蛋白磷脂酶A2抗体和C-反应蛋白抗体加入，每mg微球所加抗体量为50-200μg，常温～37℃反应5-60min；
（2）微球封闭：使用终浓度为5%的葡萄糖或葡聚糖，对上述标记好的微球封闭10-30min，百分比浓度为质量百分比浓度；
（3）结合垫的制备：将上述微球按3-6μL/cm喷涂在结合垫上，干燥备用；
（4）层析膜制备：将脂蛋白磷脂酶A2配对抗体和C-反应蛋白配对抗体稀释至1mg/mL，1μL/cm的喷量分别包被在两张层析膜上，做为T线；同时用二抗包被C线，干燥备用；
（5）试纸条的组装：将层析膜、结合垫、样品垫和吸水垫依次粘贴在PVC底板上，切成试纸条后装入检测卡中。
一种胃蛋白酶原I、II和胃泌素17联合检测试纸条，一张检测卡中，包含三个检测试纸条，一个用于检测胃蛋白酶原I，一个用于检测胃蛋白酶原II，一个用于检测胃泌素17，所述试纸条均包括样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫；
所述结合垫分别包被有胃蛋白酶原I、II和胃泌素17抗体标记的上述彩色乳胶微球，彩色乳胶微球与胃蛋白酶原I、II和胃泌素17抗体的Fc片段特异性结合。
所述彩色乳胶微球通过硼酸基团与胃蛋白酶原I、II和胃泌素17抗体Fc片段的糖基基团发生的二醇糖基化反应，将抗体与微球连接。
上述的胃蛋白酶原I、II和胃泌素17联合检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：
（1）抗体偶联：用pH5-9的HEPES缓冲液重悬硼酸化修饰的彩色微球，分别将胃蛋白酶原I、II和胃泌素17抗体加入，每mg微球所加抗体量为50-200μg；常温～37℃反应5-60min；
（2）微球封闭：使用终浓度为5%的葡萄糖或葡聚糖，对制得的微球封闭10-30min，百分比浓度为质量百分比浓度；
（3）结合垫的制备：将上述微球按3-6μL/cm喷涂在结合垫上，干燥备用；
（4）层析膜制备：将胃蛋白酶原I配对抗体、胃蛋白酶原II配对抗体和胃泌素17配对抗体稀释至1mg/mL，1μL/cm的喷量分别包被在两张层析膜上，做为T线；同时用二抗包被C线，干燥备用；
（5）试纸条的组装：将层析膜、结合垫、样品垫和吸水垫依次粘贴在PVC底板上，切成试纸条后装入检测卡中。
实施例1
如图1-图2所示，本发明的脂蛋白磷脂酶A2和全程C-反应蛋白联合检测试纸条，灵敏度高，由于标记到微球上的抗体是通过硼酸基团与抗体的Fc片段相连，所以标记的抗体活性更高，因此以常规彩色乳胶微球为初始原料和较少的抗体用量便可实现10ng/mL的脂蛋白磷脂酶A2检测灵敏度和0.1μg/mL的C-反应蛋白检测灵敏度。标记过程简便、快速，硼酸基团与抗体的Fc片段的糖基发应，不需要EDC和NHS等额外的偶联试剂，标记过程快速且不会发生微球聚集。
下面结合具体实施例进行说明：
1. 微球的硼酸修饰
（1）溶液的配制
3-氨基苯硼酸溶液：取20mg的3-氨基苯硼酸，溶于10mL的50mM MES缓冲液(pH4.0)中，4℃保存备用。
DMTMM溶液：取20mg的DMTMM，溶于1mL的50mM MES缓冲液(pH4.0)中，4℃保存备用。
（2）氨基苯硼酸的偶联
取4%的羧基红丝乳胶微球25μl，加入1mL3-氨基苯硼酸溶液，再加入50μL DMTMM溶液，振荡混匀，置于37℃水平摇床中震荡反应3h。
（3）硼酸微球的封闭
像上述体系中加入10%PVP溶液50μL和乙醇胺溶液50μL，振荡混匀，置于37℃水平摇床中震荡反应30min。
（4）硼酸微球的收集
将封闭好的液体，10000rpm离心10min，弃去上去，用50mMHEPES缓冲液(pH6.5)进行重悬，重复3次，得到硼酸微球，备用。
2. 抗体偶联
（1）Fc片段特异偶联
向上述硼酸微球中加入100μg脂蛋白磷脂酶A2抗体或C-反应蛋白抗体，振荡混匀，置于37℃水平摇床中震荡反应30min。
（2）封闭
像上述体系中加入10%葡萄糖溶液50μL振荡混匀，置于37℃水平摇床中震荡反应30min。
（3）抗体偶联微球的收集
将封闭好的液体，10000rpm离心10min，弃去上去，用结合液进行重悬，重复3次，4℃保存备用。
3. 不同pH对硼酸修饰效率的影响
用HCL和NaOH将MES缓冲液分别调至不同的pH值，用于偶联羧基微球和3-氨基苯硼酸。偶联前后，通过紫外分光光度计，在295nm测量3-氨基苯硼酸的浓度的变化，计算不同pH下，硼酸修饰效率的差异。结果如图3所示，在pH<4.5时，修饰效率最高，pH越高，修饰效率越低。可能是因为3-氨基苯硼酸的pKa1=4.46，因此当pH<4.5时，氨基基团带正电，更容易与微球上的羧基结合。
4. 不同pH对抗体偶联效率的影响
配制不同pH值的HEPES缓冲液，用于偶联硼酸微球和抗体的Fc片段。偶联后的微球制成试纸条，加入100ng/mL的脂蛋白磷脂酶A2样本用来测试，根据T线颜色的深浅判断不同pH对抗体偶联效率的影响。结果如图4所示，在pH6.5时抗体偶联效率最高。
5. 不同抗体用量的影响
比较硼酸微球和羧基微球偶联抗体时，不同抗体用量的影响。羧基微球采用EDC/NHS法偶联。偶联后的微球制成试纸条，加入100ng/mL的脂蛋白磷脂酶A2样本用来测试，根据T线颜色的深浅判断不同pH对抗体偶联效率的影响。结果如图5所示，硼酸微球偶联时，当每mg微球标记抗体用量大于10μg，T线不再变深。而当羧基微球偶联时，则每mg微球标记抗体用量至少要达到20μg时，才能与硼酸微球相当。说明硼酸微球偶联时所用抗体更少。
6. 不同标记时间的影响
比较硼酸微球和羧基微球偶联抗体时，不同标记时间的影响。羧基微球采用EDC/NHS法偶联。偶联后的微球制成试纸条，加入100ng/mL的脂蛋白磷脂酶A2样本用来测试，根据T线颜色的深浅判断不同pH对抗体偶联效率的影响。结果如图6所示，硼酸微球偶联时，标记10min后，T线不在变深。而当羧基微球偶联时，则至少需要标记30min，才能与硼酸微球相当。说明硼酸微球偶联时所用时间更少。
7. 脂蛋白磷脂酶A2和C-反应蛋白联合检测试纸条性能评估
采用1%BSA做为稀释液，将脂蛋白磷脂酶A2标准品稀释成浓度为500、250、100、50、25ng/mL的标准品溶液，取10μL进行检测。10min后读取T线和C线的灰度值，计算定量曲线，如图7所示。脂蛋白磷脂酶A2的线性检测范围为25-500ng/mL，空白限为10ng/mL。
采用1%BSA做为稀释液，将C-反应蛋白标准品稀释成浓度为100、25、5、2.5、0.5、μg/mL的标准品溶液，取10μL进行检测。10min后读取T线和C线的灰度值，计算定量曲线，如图8所示。C-反应蛋白的线性检测范围为0.5-100μg/mL，空白限为0.1μg/mL。
实施例2
如图1和图9所示，本发明的胃蛋白酶原I、II和胃泌素17联合检测试纸条，灵敏度高，由于标记到微球上的抗体是通过硼酸基团与抗体的Fc片段相连，所以标记的抗体活性更高，因此以常规彩色乳胶微球为初始原料和较少的抗体用量便可实现1ng/mL的PGI和PGII检测灵敏度和0.5pmol/L的G-17检测灵敏度。标记过程简便、快速，硼酸基团与抗体的Fc片段的糖基发应，不需要EDC和NHS等额外的偶联试剂，标记过程快速且不会发生微球聚集。
下面结合具体实施例进行说明：
1. 微球的硼酸修饰
（1）溶液的配制
3-氨基苯硼酸溶液：取20mg的3-氨基苯硼酸，溶于10mL的50mM MES缓冲液(pH4.0)中，4℃保存备用。
DMTMM溶液：取20mg的DMTMM，溶于1mL的50mM MES缓冲液(pH4.0)中，4℃保存备用。
（2）氨基苯硼酸的偶联
取4%的羧基红丝乳胶微球25μl，加入1mL3-氨基苯硼酸溶液，再加入50μL DMTMM溶液，振荡混匀，置于37℃水平摇床中震荡反应3h。
（3）硼酸微球的封闭
像上述体系中加入10%PVP溶液50μL和乙醇胺溶液50μL，振荡混匀，置于37℃水平摇床中震荡反应30min。
（4）硼酸微球的收集
将封闭好的液体，10000rpm离心10min，弃去上去，用50mMHEPES缓冲液(pH6.5)进行重悬，重复3次，得到硼酸微球，备用。
2. 抗体偶联
（1）Fc片段特异偶联
向上述硼酸微球中加入100μgPGI抗体或PGII抗体或G-17抗体，振荡混匀，置于37℃水平摇床中震荡反应30min。
（2）封闭
像上述体系中加入10%葡萄糖溶液50μL振荡混匀，置于37℃水平摇床中震荡反应30min。
（3）抗体偶联微球的收集
将封闭好的液体，10000rpm离心10min，弃去上去，用结合液进行重悬，重复3次，4℃保存备用。
3. 不同pH对硼酸修饰效率的影响
用HCL和NaOH将MES缓冲液分别调至不同的pH值，用于偶联羧基微球和3-氨基苯硼酸。偶联前后，通过紫外分光光度计，在295nm测量3-氨基苯硼酸的浓度的变化，计算不同pH下，硼酸修饰效率的差异。结果如图3所示，在pH<4.5时，修饰效率最高，pH越高，修饰效率越低。可能是因为3-氨基苯硼酸的pKa1=4.46，因此当pH<4.5时，氨基基团带正电，更容易与微球上的羧基结合。
4. 不同pH对抗体偶联效率的影响
配制不同pH值的HEPES缓冲液，用于偶联硼酸微球和抗体的Fc片段。偶联后的微球制成试纸条，加入50ng/mL的PGI样本用来测试，根据T线颜色的深浅判断不同pH对抗体偶联效率的影响。结果如图4所示，在pH6.5时抗体偶联效率最高。
5. 不同抗体用量的影响
比较硼酸微球和羧基微球偶联抗体时，不同抗体用量的影响。羧基微球采用EDC/NHS法偶联。偶联后的微球制成试纸条，加入50ng/mL的PGI样本用来测试，根据T线颜色的深浅判断不同pH对抗体偶联效率的影响。结果如图5所示，硼酸微球偶联时，当每mg微球标记抗体用量大于10μg，T线不再变深。而当羧基微球偶联时，则每mg微球标记抗体用量至少要达到20μg时，才能与硼酸微球相当。说明硼酸微球偶联时所用抗体更少。
6. 不同标记时间的影响
比较硼酸微球和羧基微球偶联抗体时，不同标记时间的影响。羧基微球采用EDC/NHS法偶联。偶联后的微球制成试纸条，加入50ng/mL的PGI样本用来测试，根据T线颜色的深浅判断不同pH对抗体偶联效率的影响。结果如图6所示，硼酸微球偶联时，标记10min后，T线不在变深。而当羧基微球偶联时，则至少需要标记30min，才能与硼酸微球相当。说明硼酸微球偶联时所用时间更少。
7. PGI、PGII和G-17联合检测试纸条性能评估
采用1%BSA做为稀释液，将PGI标准品稀释成浓度为200、100、50、25、10ng/mL的标准品溶液，取100μL进行检测。10min后读取T线和C线的灰度值，计算定量曲线，如图10所示。PGI的线性检测范围为10-200ng/mL，空白限为1ng/mL。
采用1%BSA做为稀释液，将PGII标准品稀释成浓度为40、25、10、5、2ng/mL的标准品溶液，取100μL进行检测。10min后读取T线和C线的灰度值，计算定量曲线，如图11所示。PGII的线性检测范围为2-40ng/mL，空白限为1ng/mL。
采用1%BSA做为稀释液，将G-17标准品稀释成浓度为40、10、5pmol/L的标准品溶液，取100μL进行检测。10min后读取T线和C线的灰度值，计算定量曲线，如图12所示。G-17的线性检测范围为5-40pmol/L，空白限为0.5pmol/L。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

Claims (8)

1.一种彩色乳胶微球，其特征在于，彩色乳胶微球为硼酸化修饰微球，硼酸化修饰微球包含有机染料的聚苯乙烯微球或硅胶微球，微球的粒径为200-600nm，微球表面修饰有羧基或氨基，通过4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐将含硼酸的分子化合物修饰到微球表面，形成硼酸化修饰的微球；所述含硼酸的分子化合物为3-氨基苯硼酸、3-氨基苯硼酸盐酸盐、邻氨基苯硼酸盐酸盐、4-氨基苯基硼酸、3-氨基-4-氯苯基硼酸、4-羧基-3-氯苯硼酸、5-羧基-2-氯苯硼酸、4-羧基苯硼酸、2-羧基苯硼酸、4-羧基-2-甲基苯基硼酸中的至少一种。
2.如权利要求1所述彩色乳胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：使用200-400nm的表面基团为羧基的彩色微球，在pH4-7，浓度20mM-200mM的MES缓冲液中，加入含硼酸的分子化合物，其与微球的摩尔比为1：1-1：100；充分混匀后，加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，其与微球的摩尔比为1：1-1：10；常温～37℃反应3-6h，加入乙醇胺和聚乙烯吡咯烷酮对微球表面进行封闭。
3.一种脂蛋白磷脂酶A2和全程C-反应蛋白联合检测试纸条，其特征在于，一张检测卡中，包含两个检测试纸条，一个用于检测脂蛋白磷脂酶A2，一个用于检测C-反应蛋白，所述试纸条均包括样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫；
所述结合垫分别包被有脂蛋白磷脂酶A2抗体和C-反应蛋白抗体标记的权利要求1所述的彩色乳胶微球，彩色乳胶微球与脂蛋白磷脂酶A2抗体和C-反应蛋白抗体的Fc片段特异性结合。
4.根据权利要求3所述脂蛋白磷脂酶A2和全程C-反应蛋白联合检测试纸条，其特征在于，所述彩色乳胶微球通过硼酸基团与脂蛋白磷脂酶A2抗体和C-反应蛋白抗体Fc片段的糖基基团发生的二醇糖基化反应，将抗体与微球连接。
5.如权利要求3所述的脂蛋白磷脂酶A2和全程C-反应蛋白联合检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）抗体偶联：用pH5-9的HEPES缓冲液重悬权利要求2制得的硼酸化修饰的彩色微球，分别将脂蛋白磷脂酶A2抗体和C-反应蛋白抗体加入，每mg微球所加抗体量为50-200μg，常温～37℃反应5-60min；
（2）微球封闭：使用终浓度为5%的葡萄糖或葡聚糖，对上述标记好的微球封闭10-30min，百分比浓度为质量百分比浓度；
（3）结合垫的制备：将上述微球按3-6μL/cm喷涂在结合垫上，干燥备用；
（4）层析膜制备：将脂蛋白磷脂酶A2配对抗体和C-反应蛋白配对抗体稀释至1mg/mL，1μL/cm的喷量分别包被在两张层析膜上，做为T线；同时用二抗包被C线，干燥备用；
（5）试纸条的组装：将层析膜、结合垫、样品垫和吸水垫依次粘贴在PVC底板上，切成试纸条后装入检测卡中。
6.一种胃蛋白酶原I、II和胃泌素17联合检测试纸条，其特征在于，一张检测卡中，包含三个检测试纸条，一个用于检测胃蛋白酶原I，一个用于检测胃蛋白酶原II，一个用于检测胃泌素17，所述试纸条均包括样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫；
所述结合垫分别包被有胃蛋白酶原I、II和胃泌素17抗体标记的权利要求1所述彩色乳胶微球，彩色乳胶微球与胃蛋白酶原I、II和胃泌素17抗体的Fc片段特异性结合。
7.根据权利要求6所述胃蛋白酶原I、II和胃泌素17联合检测试纸条，其特征在于，所述彩色乳胶微球通过硼酸基团与胃蛋白酶原I、II和胃泌素17抗体Fc片段的糖基基团发生的二醇糖基化反应，将抗体与微球连接。
8.如权利要求6所述的胃蛋白酶原I、II和胃泌素17联合检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）抗体偶联：用pH5-9的HEPES缓冲液重悬硼酸化修饰的彩色微球，分别将胃蛋白酶原I、II和胃泌素17抗体加入，每mg微球所加抗体量为50-200μg；常温～37℃反应5-60min；
（2）微球封闭：使用终浓度为5%的葡萄糖或葡聚糖，对权利要求2制得的微球封闭10-30min，百分比浓度为质量百分比浓度；
（3）结合垫的制备：将上述微球按3-6μL/cm喷涂在结合垫上，干燥备用；
（4）层析膜制备：将胃蛋白酶原I配对抗体、胃蛋白酶原II配对抗体和胃泌素17配对抗体稀释至1mg/mL，1μL/cm的喷量分别包被在两张层析膜上，做为T线；同时用二抗包被C线，干燥备用；
（5）试纸条的组装：将层析膜、结合垫、样品垫和吸水垫依次粘贴在PVC底板上，切成试纸条后装入检测卡中。
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