CN110261610B - Znf74蛋白作为胃癌血清生物标志物的应用及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种ZNF74蛋白作为胃癌血清生物标志物的应用及其试剂盒，所述试剂盒包括：包被于酶标板上的ZNF74蛋白、0U/ml的标准血清1、100U/mL的标准血清2、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、终止液。本发明提供的抗ZNF74的免疫球蛋白G抗体作为胃癌血清生物标志物具有高特异性；该试剂盒检测灵敏、安全、操作简单，可以用来定量测定人血清中蛋白质ZNF74的免疫球蛋白G抗体水平，反映出ZNF74蛋白的水平，从而用于胃癌诊断。

Description

ZNF74蛋白作为胃癌血清生物标志物的应用及其试剂盒
技术领域
本发明涉及生物科学领域，具体涉及一种ZNF74蛋白作为胃癌血清生物标志物的应用及其试剂盒。
背景技术
胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，根据世界卫生组织(WHO)的统计，胃癌的死亡率高居第二，仅仅次于肺癌。根据国家癌症中心和全国肿瘤登记中心的统计，胃癌在我国的发病率约为十万分之三十。以2014年为例，我国新确诊胃癌病例数约为41万例，而胃癌死亡病例为29万例(死亡率为十万分之二十一)。其中男性胃癌的发病率要远高于女性，标化发病率约为女性的2.4倍。目前，我国胃癌总体5年生存率为43.4％，但是III和IV期胃癌患者的五年生存率只有28.01％和8.42％。那么提高胃癌的早期诊断率，将会大大提高胃癌患者的治疗效果。生物标志物可以作为影像学检查的辅助手段，两者的联合使用可以大大提高胃癌的早期诊断率。
理想的生物标志物应符合有以下特征：(1)高特异性，即标志物在对应的组织中特异性的表达；(2)标志物的浓度和肿瘤大小、转移、恶性程度有关，可以协助肿瘤分期和判断预后；(3)半衰期短、敏感性高，可以快速反映体内的生理状况，在患病状态下快速升高，但是有效治疗后浓度很快下降；(4)易于检测。
目前已经有一些胃癌生物标志物在临床中应用：(1)癌胚抗原(Carcinoembryonicantigen,CEA)，是一种具有人类胚胎抗原特性的酸性糖唐白，存在于胃癌及其它腺癌患者的血清中，但对早期胃癌的诊断意义较小，主要用于胃癌治疗前后的动态观察；(2)糖蛋白，如CA125、CA19-9、CA50、CA724以及CA242等，虽然这些糖蛋白抗原在部分胃癌患者中有升高现象，但其敏感性只有20～40％；(3)肿瘤基因，如DDC、c-myc、c-erb-2、p53以及nm23等对胃癌的发生、转移也有一定意义，但广泛应用于临床仍受限制。综上所述，现有生物标志物在胃癌诊断中的表现都不是很理想，因此我们需要寻找全新的胃癌生物标志物。
人蛋白质ZNF74(zinc finger protein 74)是由第22号染色体22p11.12上的ZNF74基因所编码，共含有644个氨基酸，分子量为72.21kDa。目前未见有将ZNF74蛋白质作为胃癌生物标志物的报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ZNF74蛋白作为胃癌血清生物标志物的应用及其试剂盒。利用该血清标志物检测胃癌的特异性为84％，敏感性为82％，所提供的试剂盒为一种灵敏、安全、操作简单的胃癌诊断试剂盒，可以用来定性检测人血清中蛋白质ZNF74的免疫球蛋白G抗体水平，由此反映ZNF74蛋白的水平。
本试剂盒采用酶联免疫吸附测定技术(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，应用间接法定性检测人血清中蛋白质ZNF74的免疫球蛋白G抗体水平。用纯化的人蛋白质ZNF74包被微孔板制成固相抗原，然后往包被抗原的微孔中依次加入待测血清与相关试剂，再与HRP标记的二抗结合，形成ZNF74-抗体-酶标二抗复合物，最后经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，其颜色深浅与测试样品中蛋白质ZNF74的免疫球蛋白G抗体水平呈正相关。最后使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值(OD值)作为量化检测结果。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种ZNF74蛋白作为胃癌血清生物标志物的应用。
优选地，所述ZNF74蛋白是从经由基因工程改造过的酿酒酵母经半乳糖诱导过量表达，再经琼脂糖亲和介质谷胱甘肽分离纯化而得到。
优选地，所述ZNF74蛋白为人ZNF74蛋白。
第二方面，本发明提供了一种胃癌血清生物标志物，包括ZNF74蛋白。
第三方面，本发明提供了一种胃癌血清标志物检测试剂盒，包括：包被于酶标板上的ZNF74蛋白、0U/ml的标准血清1、100U/mL的标准血清2、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、终止液。
优选地，所述酶底物溶液为TMB应用液，包括显色剂A和显色剂B；
所述显色剂A以每500mL计，包括以下各组分：醋酸钠10.7-14.2g，柠檬酸0.3-1.9g，30％双氧水0.2-0.6mL；
所述显色剂B以每500mL计，包括以下各组分：TMB 200-650mg，DMSO 5-30mL，柠檬酸3.2-7.9g。
优选地，所述包被于酶标板上的ZNF74蛋白的制备中，采用的包被缓冲液为0.05M碳酸盐缓冲液；所述碳酸盐缓冲液包括以下组分：碳酸钠1.59g/L，碳酸氢钠2.93g/L；所述碳酸盐缓冲液的pH值为7.4。
优选地，所述封闭液为含有0.5％牛血清白蛋白的、浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液，具体包括：牛血清蛋白BSA 5g/L,氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、十二水合磷酸氢钠2.9g/L，pH值为7.4。
优选地，所述样品稀释液为0.01mol/L的PBS缓冲液，具体包括：氯化钾0.2g/L，氯化钠8g/L，磷酸氢二钠0.2g/L，十二水合磷酸氢钠2.9g/L，pH值为7.4。
优选地，所述洗涤液为0.01mol/L的PBST磷酸盐缓冲液，具体包括：氯化钾0.2g/L、氯化钠8g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、十二水合磷酸氢钠2.9g/L、Tween-20 0.5mL/L，pH值为7.4。
优选地，所述终止液为2mol/L硫酸溶液；
所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的人免疫球蛋白G抗体。
第四方面，本发明提供了一种基于前述试剂盒测定血清中蛋白质ZNF74的免疫球蛋白G抗体浓度的方法，包括以下步骤：
(1)包被：将纯化的人蛋白质ZNF74用包被缓冲液稀释至1μg/mL后加入到孔酶标板中，于37℃包被2小时，然后洗涤3次，甩干；
(2)封闭：加入封闭液200μL，室温放置2小时，洗涤3次，甩干；
(3)加样：将0U/ml标准血清1、100U/ml标准血清2与待测血清样品各按1:100稀释至100μL后加入到各抗原测定孔板中，晃匀后加盖或覆膜；
(4)温育：酶标板置于37℃反应120分钟后甩净孔中液体，不用洗涤；
(5)加酶标记：每孔加辣根过氧化物酶标记的人免疫球蛋白G抗体100μL，于37℃放置60分钟后甩净孔中液体，洗板5次后拍干。
(6)显色：拍干后各孔滴先后加入显色剂A和显色剂B各50μL，震荡混匀，于37℃避光放置显色15分钟后，加入终止液50μL，终止反应。
(7)用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度，然后进行计算，即得血清中蛋白质ZNF74的免疫球蛋白G抗体浓度。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1.本发明提供的ZNF74蛋白作为胃癌血清生物标志物具有高特异性；
2.本发明提供了一种灵敏、安全、操作简单的商品化试剂盒，可以用来定性定量测定人血清中蛋白质ZNF74的免疫球蛋白G抗体水平，反映出ZNF74蛋白的水平，从而用于胃癌诊断。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明结合实施例做进一步的说明。
实施例1
1.表达、纯化及鉴定ZNF74蛋白：
人蛋白质ZNF74的获得是采用常规方法，从经过基因工程改造的酿酒酵母利用半乳糖诱导过量表达，再经琼脂糖亲和介质谷胱甘肽分离纯化所得，并经过Western-Blotting鉴定。
2.血清样品的准备：
全血标本于室温放置2小时后离心20分钟，取上清液进行分装，并放于-80℃保存。解冻后的血清样品需再次离心后才可用于检测。
3.ELISA法各种缓冲液及试剂的配制方法：
(1)包被缓冲液：0.05M碳酸钠-碳酸氢钠(pH 9.6)
Figure BDA0002095234070000041
(2)样品稀释液：pH 7.4的PBS溶液
Figure BDA0002095234070000042
(3)洗涤液：pH 7.4的PBST溶液
Figure BDA0002095234070000051
(4)封闭液：0.5％BSA的PBS溶液(pH 7.4)
Figure BDA0002095234070000052
(5)酶底物溶液：显色剂A和显色剂B
Figure BDA0002095234070000053
(现配现用)
Figure BDA0002095234070000054
Figure BDA0002095234070000061
(现配现用)
(6)终止液：2mol/L硫酸溶液
Figure BDA0002095234070000062
(配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边混匀)
4.ELISA法测定血清中蛋白质ZNF74的人免疫球蛋白G抗体浓度及胃癌诊断：
具体操作步骤如下：
(1)包被：将纯化的人蛋白质ZNF74用包被缓冲液稀释至1μg/mL后加入到96孔酶标板中，于37℃包被2小时，然后采用洗涤液洗涤3次，甩干。
(2)封闭：加入封闭液200μL，室温放置2小时，采用洗涤液洗涤3次，甩干。
(3)加样：将标准品(0U/ml标准血清1、100U/ml标准血清2；为直接购买)与待测血清样品(步骤2的方法所得)各按1:100稀释(采用样品稀释液)至100μL后加入到步骤(1)制备的包被人蛋白质ZNF74的96孔酶标板中，晃匀后加盖或覆膜。标准品及待检测样品需在临用前15分钟内配制，用完即丢弃。
(4)温育：酶标板置于37℃反应120分钟后甩净孔中液体，不用洗涤。
(5)加酶标记：每孔加辣根过氧化物酶标记的人免疫球蛋白G抗体100μL，于37℃放置60分钟后甩净孔中液体，洗板5次后拍干。
(6)显色：拍干后各孔滴先后加入显色剂A和显色剂B各50μL，震荡混匀，于37℃避光放置显色15分钟后，加入终止液50μL，终止反应。
(7)结果判定：
i.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)，然后通过以下公式计算
得到血清中抗ZNF74的免疫球蛋白G抗体的浓度(即下述公式的单位值)。
Figure BDA0002095234070000063
*A450是450nm处吸光度的缩写。
*目前ZNF74抗体尚无国际通行的参考标准，因此本检测结果校准时采用了相对单位。
ii.血清中抗ZNF74值的判定：
抗ZNF74值(U/mL) 判定
大于5 胃癌
2-5 高危
小于2 健康
iii.质量控制
每个检测结果必须符合以下标准：
标准血清1的A450：≤0.100
标准血清2的A450：≥0.700
如不符合上述标准，则结果视为无效，必须重新检测。
iv.检验结果的解释
对50例健康人血清、37例胃癌患者血清、14例高危患者血清的ROC分析确立了以上参考值。
5.特异性和敏感性检测：采用101份血清样品(50例健康人血清、37例胃癌患者血清、14例高危患者血清)对本发明进行了特异性和敏感性检测。本发明用于断胃癌诊断的特异性为84％，敏感性为82％。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (9)

1.一种检测ZNF74蛋白的免疫球蛋白G抗体的试剂在制备胃癌血清标志物检测试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ZNF74蛋白是从经由基因工程改造过的酿酒酵母经半乳糖诱导过量表达，再经琼脂糖亲和介质谷胱甘肽分离纯化而得到。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胃癌血清标志物检测试剂盒包括：包被于酶标板上的ZNF74蛋白、0U/ml的标准血清1、100U/mL的标准血清2、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、终止液；所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的人免疫球蛋白G抗体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述酶底物溶液为TMB应用液，包括显色剂A和显色剂B；
所述显色剂A以每500mL计，包括以下各组分：醋酸钠10.7-14.2g，柠檬酸0.3-1.9g，30％双氧水0.2-0.6mL；
所述显色剂B以每500mL计，包括以下各组分：TMB 200-650mg，DMSO 5-30mL，柠檬酸3.2-7.9g。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述包被于酶标板上的ZNF74蛋白的制备中，采用的包被缓冲液为0.05M碳酸盐缓冲液；所述碳酸盐缓冲液包括以下组分：碳酸钠1.59g/L，碳酸氢钠2.93g/L；所述碳酸盐缓冲液的pH值为7.4。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述封闭液为含有0.5％牛血清白蛋白的、浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液，具体包括：牛血清蛋白BSA 5g/L,氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、十二水合磷酸氢钠2.9g/L，pH值为7.4。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述样品稀释液为0.01mol/L的PBS缓冲液，具体包括：氯化钾0.2g/L，氯化钠8g/L，磷酸氢二钠0.2g/L，十二水合磷酸氢钠2.9g/L，pH值为7.4。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述洗涤液为0.01mol/L的PBST磷酸盐缓冲液，具体包括：氯化钾0.2g/L、氯化钠8g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、十二水合磷酸氢钠2.9g/L、Tween-20 0.5mL/L，pH值为7.4；
所述终止液为2mol/L硫酸溶液。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ZNF74蛋白的免疫球蛋白G抗体的浓度检测方法包括以下步骤：
(1)包被：将纯化的人蛋白质ZNF74用包被缓冲液稀释至1μg/mL后加入到孔酶标板中，于37℃包被2小时，然后洗涤3次，甩干；
(2)封闭：加入封闭液200μL，室温放置2小时，洗涤3次，甩干；
(3)加样：将0U/ml标准血清1、100U/ml标准血清2与待测血清样品各按1:100稀释至100μL后加入到各抗原测定孔板中，晃匀后加盖或覆膜；
(4)温育：酶标板置于37℃反应120分钟后甩净孔中液体，不用洗涤；
(5)加酶标记：每孔加辣根过氧化物酶标记的人免疫球蛋白G抗体100μL，于37℃放置60分钟后甩净孔中液体，洗板5次后拍干；
(6)显色：拍干后各孔滴先后加入显色剂A和显色剂B各50μL，震荡混匀，于37℃避光放置显色15分钟后，加入终止液50μL，终止反应；
(7)用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度，然后进行计算，即得血清中抗蛋白质ZNF74的免疫球蛋白G抗体浓度。
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