CN107462725A - 抗FNDC4的IgG抗体作为胃癌血清标志物的应用及其试剂盒 - Google Patents
抗FNDC4的IgG抗体作为胃癌血清标志物的应用及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了检测血清中抗FNDC4‑IgG抗体的试剂在制备诊断和预示胃癌的试剂盒中的应用,本发明利用抗FNDC4的IgG抗体作为胃癌血清标志物,定性测定人血清中抗蛋白质FNDC4的IgG抗体的水平,检测胃癌的特异性为90%,敏感性为92%,可以作为辅助胃癌早期诊断的一种手段,以提高胃癌早期诊断的敏感性和特异性。利用检测血清中抗FNDC4‑IgG抗体的试剂制作的胃癌诊断试剂盒,灵敏、安全、可靠、易操作。
Description
技术领域
本发明涉及一种癌症的标志物,具体为抗FNDC4的IgG抗体作为胃癌血清标志物的应用及其试剂盒。
背景技术
胃癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤,根据世界卫生组织2008年的统计,在全世界范围,胃癌病人的死亡率高居第二。在2006年世界卫生组织的统计中显示有接近950,000个新发病例,同时有约700,000人死于这一种疾病。在我国,每年胃癌新发患者数超过30万,死于胃癌的人数约16万,病死率居恶性肿瘤之首,严重威胁人民生命健康。为降低死亡率,提高胃癌的疗效,关键是胃癌的“三早”工作,即早期发现、早期诊断及早期治疗。然而,由于绝大多数胃癌患者缺乏特异性的临床症状,故早期胃癌诊断率很低,手术率不足10 %;术后病人的生存期也较短。目前,我国胃癌总体5年生存率为43.4%,术后病理分期(pathological TNM,pTNM)I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者的术后5年生存率分别为75.65%、58.73%、28.Ol%和8.42%。因此,提高胃癌的早期诊断率非常重要。而一般体检和影像学检查作用有限,缺少预警价值。因此从长远角度看,应致力于发现敏感性和特异性均较好的肿瘤标志物。此外胃癌异质性大,预后及对治疗的反应性差别较大,对于临床评估预后以及对治疗反应性的预测与评价,均需良好的肿瘤标志物。
理想的肿瘤标志物应符合以下条件:(1)敏感性高;(2)特异性高;(3)肿瘤标志物浓度和肿瘤大小、转移、恶性程度有关,能协助肿瘤分期和判断预后;(4)半衰期短,有效治疗后浓度很快下降,能较快反映体内肿瘤的实际情况;(5)存在于体液,特别是血液中,易于检测。
肿瘤血清标志物的研究一直是本领域的研究重点。现已有多种胃癌肿瘤标识物:如癌胚抗原(CEA),存在于胃癌及其它腺癌患者的血清中,但对早期胃癌的诊断意义较小,主要用于胃癌治疗前后的动态观察;CA125、CA19-9、CA50、CA724以及CA242等部分糖抗原在部分胃癌患者中可升高,但其敏感性仅20~40%;还有研究发现肿瘤相关糖蛋白抗原-72(TAG-72)对胃癌的敏感性为69%,特异性为84%;糖蛋白抗原MG7-Ag在血清中有40%-60%的阳性检出率,在胃癌组织中有80%-94%的阳性检出率;核小体组蛋白类抗原(IPO—38)作为胃癌诊断的敏感性为57.4%,特异性超过90%以上这些指标均有利于早期胃癌的诊断。某些肿瘤基因,如DDC、c-myc、c-erb-2、p53以及nm23等对胃癌的发生、转移也有一定意义,但广泛应用于临床仍受限制。由于现有的胃癌生物标识物在灵敏度和特异性上的缺陷,虽然在疗效监测、提示复发、判断预后和高危人群的普查中具有一定的价值,但目前仍不能用于胃癌的确诊。为了实现对胃癌的早期高灵敏性,高特异性的诊断,急需在分子水平上寻找到更敏感、更特异的胃癌生物标志物。
我们在前期研究中利用人蛋白质组芯片高通量、快速分析的优势,分析了胃癌病人相关血清87份(胃癌病人37份、健康人血清50份),在较短时间内比较了患者和健康人样品中的不同,给出了候选血清生物标志物,以期早期诊断和有效治疗胃癌。
FNDC4蛋白(Fibronectin type III domain-containing protein 4,III型纤维连接蛋白域蛋白4),是III型纤维连接蛋白(Fibronectin type III)家族中的重要一员。FNDC4与FNDC5高度同源,后者最近被发现是一种运动性分泌因子,可以靶向作用于脂肪组织,引导脂肪形成和能量消耗。目前,未见有将FNDC4蛋白质作为胃癌生物标志物的报导。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的胃癌生物标识物在灵敏度和特异性上的缺陷,虽然在疗效监测、提示复发、判断预后和高危人群的普查中具有一定的价值,但目前仍不能用于胃癌的确诊,为了实现对胃癌的早期高灵敏性,高特异性的诊断,提供一种抗FNDC4的IgG抗体作为胃癌血清标志物的应用及其试剂盒。
为了解决上述技术问题,本发明提供了如下的技术方案:
检测血清中的抗FNDC4的IgG抗体的试剂在制备诊断和预示胃癌的试剂盒中的应用。所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
一种胃癌诊断试剂盒,包括酶标板、人蛋白质FNDC4.0 U/ml标准血清、100 U/mL标准血清、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、终止液,其中人蛋白质FNDC4包被于酶标板上。优选的,将人蛋白质FNDC4包被于酶标板上所用的包被缓冲液为0.05 MpH 9.6 的碳酸盐缓冲液,即1升溶液中含1.59 g Na2CO3,2.93 g NaHCO3。
所述的0 U/ml标准血清为正常人血清稀释于样品稀释液中;所述的100 U/ml标准血
清为FNDC4抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中。
进一步的,所述的人蛋白质FNDC4(带GST标签)由经过基因工程改造过的酿酒酵母,利用半乳糖诱导过量表达,利用琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)分离纯化而得到。优选后,浓度为50 μg/mL。
优选后,所述酶标试剂含HRP-二抗 0.1-1 μg/mL,所述酶底物溶液为TMB溶液,包括显色剂A和显色剂B;每500mL的显色剂A中含有醋酸钠13.6 g、柠檬酸1.6 g和30 %双氧水0.3 mL,每500mL的显色剂B中含TMB 350 mg、DMSO 20 mL和一水柠檬酸5.1 g。
进一步的,所述封闭液为0.5 % BSA的0.01 mol/L pH 7.4 PBS缓冲液,即1升溶液中含5 g BSA(牛血清白蛋白),8 g NaCl,0.2 g KH2PO4,2.9 g Na2HPO4·12H20,0.2 gKCl
进一步的,所述样品稀释液为0.01 mol/L pH 7.4 PBS缓冲液。
进一步的,所述洗涤液为含0.05 % Tween-20的0.01 mol/L pH 7.4 PBST磷酸盐缓冲液,即1升溶液中含8 g NaCl,0.2 g KH2PO4,2.9 g Na2HPO4·12H20,0.2 g KCl,0.5 mLTween-20。
进一步的,所述终止液为2 mol/L H2SO4溶液。
进一步的,各试剂中可以加入防腐剂,以便于保存。
本发明的试剂盒采用是现在临床广泛使用的ELISA技术,应用间接法定性检测人血清中抗蛋白质FNDC4的IgG抗体,用纯化的人蛋白质FNDC4抗原包被微孔板,制成固相抗原,往包被抗原的微孔中依次加入待测血清,再与HRP标记的二抗结合,形成FNDC4-抗体-酶标二抗复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色,TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色,颜色的深浅和样品中的抗蛋白质FNDC4的IgG抗体的水平呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值),量化检测结果。
本发明利用抗FNDC4的IgG抗体作为胃癌血清标志物,定性测定人血清中抗蛋白质FNDC4的IgG抗体的水平,检测胃癌的特异性为90%,敏感性为92 %,可以作为辅助胃癌早期诊断的一种手段,以提高胃癌早期诊断的敏感性和特异性。利用检测血清中的抗FNDC4的IgG抗体的试剂制作的胃癌诊断试剂盒,灵敏、安全、可靠、易操作。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例
血清样品的准备:
全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 g离心20分钟左右,取上清即可立即检测;或进行分装,并将标本放于-20 ℃或-80 ℃保存,但应避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心,然后检测。所检测样品中不能含有NaN3,因为NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
、ELISA法各种缓冲液及试剂的配制方法
包被缓冲液:0.05 M pH 9.6 的Na2CO3-NaHCO3
包被缓冲液 | 质量(g) |
Na2CO3 | 1.59 |
NaHCO3 | 2.93 |
ddH2O | 加至1000 mL |
(2)样品稀释液: pH 7.4 PBS溶液
样品稀释液 | 质量(g) |
NaCl | 8.0 |
KH2PO4 | 0.2 |
Na2HPO4·12H20 | 2.9 |
KCl | 0.2 |
ddH2O | 加至1000 mL |
(3)洗涤液:pH 7.4的PBST溶液
(4)封闭液:0.5 %BSA 的pH 7.4 PBS溶液
封闭液 | 质量(g) |
BSA | 5.0 |
NaCl | 8.0 |
KH2PO4 | 0.2 |
Na2HPO4·12H20 | 2.9 |
KCl | 0.2 |
ddH2O | 加至1000 mL |
(5) 酶底物溶液:显色剂A和显色剂B(均需现配现用)
显色剂A | 质量 |
醋酸钠 | 13.6 g |
柠檬酸 | 1.6 g |
30 %双氧水 | 0.3 mL |
ddH2O | 加至500 mL |
显色剂B | 质量 |
TMB | 350 mg |
DMSO | 20 mL |
柠檬酸·H2O | 5.1 g |
ddH2O | 加至500 mL |
(6)终止液:2 mol/L H2SO4溶液
终止液 | 质量 |
浓硫酸(95%-98%) | 22.2 mL |
ddH2O | 加至500 mL |
(配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中,边加边混匀)
3、ELISA法测定血清中抗蛋白质FNDC4的IgG抗体的浓度,以辅助早期诊断胃癌:
具体操作步骤如下:
(1)包被:将纯化的人FNDC4蛋白溶液用包被缓冲液稀释至1 μg/mL,加入到96孔酶标板中,每孔100 μL,37 ℃包被2小时或4 ℃过夜;洗涤液洗板3次,甩干;蛋白质FNDC4是从前期研究中的经过基因工程改造过的酿酒酵母,利用半乳糖诱导过量表达,琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)分离纯化,并经过Western-Blotting鉴定。
(2)封闭:加入封闭液200 μL,室温保温2小时;洗涤液洗板3次,甩干;
(3)标准品与样品的稀释与加样:将标准品与待测血清样品1:100用样品缓冲液稀释至100 μL,加入到各自的抗原测定孔板中。注意不要有气泡,加样将样品加于梅标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板上加盖或覆膜。若待测血清样品较多,建议使用多管微量加液器加样。标准品及待检测样品临用前15分钟内配制,用完丢弃,下次检测使用新鲜配制的标准品。
(4)温育:酶标板置于37 ℃反应120分钟,甩净孔中液体,不用洗涤。
(5)加酶:每孔加辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体 100 μL,37 ℃,60分钟。甩净孔中液体,同上洗板5次拍干。
(6)显色:拍干后各孔先滴加显色剂A 50 μL, 再加入显色剂B 50 μL,轻轻震荡混匀,37 ℃避光显色15分钟。
(7)终止:依序每孔加终止液50 μL,终止反应。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。底物反应时间到后应尽快加入终止液。
(8)结果判定:
i. 用酶联仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。
(A450 <样品> - A450 <标准血清 1>)
单位值 (U/ml)=(A450 <标准血清2> - A450 <标准血清1>)× 100
* A450是450 nm处吸光度的缩写。
*目前FNDC4抗体尚无国际通行的参考标准,因此本检测结果校准时采用了相对单位。
ii.血清中抗FNDC4值的判定
抗FNDC4值(U/mL) | 判定 |
≥ 5 | 胃癌 |
〈3 | 健康 |
iii. 质量控制
每个检测结果必须符合以下标准:
标准血清1的A450:≤ 0.100
标准血清2的A450:≥ 0.700
如不符合上述标准,则结果视为无效,必须重新检测。
iv. 检验结果的解释
对50例健康人血清、37例胃癌患者血清的ROC分析确立了以上参考值。
4特异性和敏感性检测:
采用600份胃癌相关患者的血清(胃癌患者300份,健康人300份)对本发明进行了特异性和敏感性检测。本发明辅助早期诊断胃癌的特异性为90%,敏感性为92%。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.检测血清中抗FNDC4-IgG抗体的试剂在制备诊断和预示胃癌的试剂盒中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
3.一种胃癌诊断试剂盒,其特征在于,包括酶标板、人蛋白质FNDC4.0 U/ml标准血清、100 U/mL标准血清、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、终止液,其中人蛋白质FNDC4包被于酶标板上。
4.如权利要求3所述的胃癌诊断试剂盒,其特征在于,所述的人蛋白质FNDC4由经过基因工程改造过的酿酒酵母,利用半乳糖诱导过量表达,利用琼脂糖亲和介质分离纯化而得到。
5.如权利要求3所述的胃癌诊断试剂盒,其特征在于,所述酶标试剂含HRP-二抗 0.1-1μg/mL,所述酶底物溶液为TMB溶液,包括显色剂A和显色剂B;每500mL的显色剂A中含有醋酸钠13.6 g、柠檬酸1.6 g和30 %双氧水0.3 mL,每500mL的显色剂B中含TMB 350 mg、DMSO 20mL和一水柠檬酸5.1 g。
6.如权利要求3所述的胃癌诊断试剂盒,其特征在于,将人蛋白质FNDC4包被于酶标板上所用的包被缓冲液为0.05 M pH 9.6 的碳酸盐缓冲液。
7.如权利要求3所述的胃癌诊断试剂盒,其特征在于,所述封闭液为0.5 % BSA的0.01mol/L pH 7.4 PBS缓冲液。
8.如权利要求3所述的胃癌诊断试剂盒,其特征在于,所述样品稀释液为0.01 mol/LpH 7.4 PBS缓冲液,所述洗涤液为含0.05 % Tween-20的0.01 mol/L pH 7.4 PBST磷酸盐缓冲液。
9.如权利要求3所述的胃癌诊断试剂盒,其特征在于,所述的0 U/ml标准血清为正常人血清稀释于样品稀释液中;所述的100 U/ml标准血清为FNDC4抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中。
10.如权利要求3所述的胃癌诊断试剂盒,其特征在于,所述终止液为2 mol/L H2SO4溶液。
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