CN108732352A - 一种联合检测五种生物标志物抗体用于检测乳腺癌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种联合检测五种生物标志物抗体用于检测乳腺癌的方法：所述五种标志物的血清水平检测均采用ELISA方法中的双抗体夹心法进行检测；临界值设定：CEA的临界值为5ng/ml，CA153的临界值为25U/ml，CYFRA21‑1的临界值为2.5ng/ml，sHLA‑G的临界值为82.3U/ml，P53采用P53指数，当P53指数>1.7为阳性，其中P53指数＝样本(OD450/OD630)/对照血清(OD450/OD630)，超出临界值判定为阳性；统计学分析：采用SPSS19.0统计软件分析，检测结果均采用均数±标准差(X±s)表示。联合检测可以弥补单项指标的不足，五种组合的敏感性及准确性最高，为医生对预后和复发做出几率判断，并能够指导医生制定相应的治疗方案和指导用药。

Description

一种联合检测五种生物标志物抗体用于检测乳腺癌的方法

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，具体为一种联合检测五种生物标志物抗体用于检测乳腺癌的方法。

背景技术

恶性肿瘤是对人类健康危害最大的疾病类型之一。据统计，2007年由于癌症造成的死亡人数占全球死亡人数的13％左右，伴随着疾病患者老龄化程度加剧，以及环境恶化、人们生活方式改变等因素影响，此比例仍呈现逐年上升趋势。2012年，美国新增近164万例癌症患者，其中约有58万例患者死亡。我国癌症发病率及病死率也居高不下，据预测到2020年，新发癌症患者病例将达263万。乳腺癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，全球女性乳腺癌发病率不仅呈上升趋势，并且患病人群也逐渐趋于年轻化。尽管手术治疗可以显著改善乳腺癌的预后，但治疗后复发率及病亡率仍然很高。乳腺癌的病因复杂，其发生发展及转移涉及多因素，多步骤、多基因，复发和转移是死亡的主要原因，目前临床上检测的方法有很多种例如超声影像、X线检查、免疫组化，但是这些方法一旦检测到，患者的病情即处于中晚期，并且检测方法对患者的伤害也比较大，临床上需要寻找一种简单的检查方法可对乳腺癌早期诊断、监测病情变化及评价疗效和判断预后。

现有技术主要在检测方法和标志物选择方面存在以下缺陷：乳腺癌在世界范围内是中年女性最常见的恶性肿瘤，发病率为10％-15％，发病年龄趋于年轻化。早期诊断、早期治疗是提高生存率的关键。临床上对乳腺癌的诊断方法比较多，有超声影像、X线检查、免疫组化等，但都受到主观因素的影响容易出现误诊、漏诊现象，血清肿瘤标志物检测以其简便快捷、且对患者造成的创伤和损害小等优势已广泛应用于临床，一种恶性肿瘤可以释放出多种肿瘤标志物，且一种肿瘤标志物可以出现在多种肿瘤，近年来研究表明，很多血清肿瘤标志物与乳腺癌的发生具有相关性，但是由于肿瘤组织的异质性以及蛋白表达的组织特异性导致单项指标检测诊断的阳性率不高，容易造成漏诊，因此限制了这些标志物的临床应用，任何一种肿瘤标志物单项检测其敏感性都不是太高，不能达到临床所需要的预期效果，为此，通过查阅国内外文献，我们选择了敏感性和特异性相对较高的具有在肿瘤患者中广泛表达的血清标志物与乳腺癌组织特异性表达的标志物组合形成一个联合检测的方法，CEA，CA153，sHLA-G，CYFRA21-1，P53抗体等五种标志物，在乳腺癌组与乳腺良性疾病组及正常对照组中检测上述血清标志物，并得到联合检测指标，使各指标之间互相弥补缺陷，旨在通过联合检测提高乳腺癌的诊断率。

发明内容

本发明的目的是针对现有很多血清肿瘤标志物与乳腺癌的发生具有相关性，但是由于肿瘤组织的异质性以及蛋白表达的组织特异性导致单项指标检测诊断的阳性率不高，容易造成漏诊，因此限制了这些标志物的临床应用，任何一种肿瘤标志物单项检测其敏感性都不是太高，不能达到临床所需要的预期效果等不足，本发明提出了一种联合检测五种生物标志物抗体用于检测乳腺癌的方法，其中联合检测五种生物标志物分别是CA153、CEA、sHLA-G、CYFRA21-1和P53抗体，此五种组合的敏感性及准确性最高，联合检测可以弥补单项指标的不足，可以互相取长补短。

本发明提供如下技术方案：一种用于检测乳腺癌的标志物，该标志物为CA153、CEA、sHLA-G、CYFRA21-1和P53抗体。

本发明还提供另外一种技术方案：一种联合检测五种生物标志物抗体用于检测乳腺癌的方法，所述五种标志物的血清水平检测均采用ELISA方法中的双抗体夹心法进行检测；

临界值设定：CEA的临界值为5ng/ml，CA153的临界值为25U/ml，CYFRA21-1的临界值为2.5ng/ml，sHLA-G的临界值为82.3U/ml，P53采用P53指数，当P53指数>1.7为阳性，其中P53指数＝样本(OD₄₅₀/OD₆₃₀)/对照血清(OD₄₅₀/OD₆₃₀)，超出临界值判定为阳性；

统计学分析：采用SPSS19.0统计软件分析，检测结果均采用均数±标准差(X±s)表示。

作为优选，所述统计学分析：分析CA153、CEA、sHLA-G、CYFRA21-1和P53抗体五种标志物在乳腺癌组、良性疾病组患者以及正常对照组三个组别中血清水平；分析五种标志物在乳腺癌不同分期中的血清水平，分析五种单一标志物及联合标志物在乳腺癌组不同分期、良性疾病组合正常对照组中的阳性率；分析以P＜0.05为差异有统计学意义，上述分析检测结果差异均具有统计学意义。

进一步地，所述ELISA双抗体夹心法进行血清水平检测的实验步骤为：

(1)乳腺癌组及良性疾病组患者均在采取治疗前3天抽取清晨空腹静脉血，正常对照组抽取清晨空腹静脉血，分离血清，收集血液后静止凝固，所有标本均在4h内用低温离心机3000rpm离心10min，取血清分装于采血管内，-80℃冰箱保存待测；

(2)取出试剂盒从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条；

(3)包被：用0.05M PH9.0碳酸盐包被缓冲液将各自的抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜，次日弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；

(4)设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

(5)将待测样本在-80℃取出，平衡至室温，样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL，置37℃孵育1小时，然后洗涤；

(6)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min；

(7)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；

(8)每孔加入TMB-过氧化氢尿素溶液底物底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；

(9)每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

上述联合检测五种生物标志物分别是CA153、CEA、sHLA-G、CYFRA21-1和P53抗体。

其中CA153是乳腺上皮细胞表面糖蛋白的变异体，是公认的乳腺癌的特异性标志物，在乳腺癌细胞中其呈现过度表达，在细胞黏附、减少细胞与细胞及细胞与基质相互作用中起着重要作用，能促进恶性肿瘤细胞与正常细胞及外周基质细胞的分离，抑制细胞毒性T细胞和淋巴因子激活杀伤细胞的作用，在促进肿瘤进展、启动乳腺癌侵袭和转移的发生中起关键的作用。其用于乳腺癌诊断，认为属于一种跨膜蛋白，当细胞癌变时，由于细胞骨架的破坏，从细胞膜脱落入血，使血清中出现高表达。文献报道，血清CA153水平的检测对乳腺癌转移的诊断有相当高的敏感性和特异性，且转移病灶越多、范围越广，CA153水平越高，动态观察其变化，能早期发现乳腺癌复发和转移。但是不少临床资料表明，乳腺良性肿瘤的一些炎症时CA153均有不同程度的升高，因此CA153低水平升高由于癌和非癌的特异性不强而对乳腺癌的早期诊断帮助不大，如果与其他肿瘤相关抗原进行联合检测可有效提高诊断的敏感性。当乳腺癌发生复发、转移后阳性率升高明显，对乳腺癌术后的复发和转移具有诊断意义。

CEA是一种具有人类胚胎抗原特异性的酸性糖蛋白，由内胚层细胞分泌，主要存在于胎儿消化道上皮组织，胰脏和肝脏，其分子量为15万-30万，4％为蛋白质。CEA编码基因位于第19对染色体，细胞浆中形成，胚胎期由小肠、肝脏、胰腺合成，成人血清含量极低(<5μg/L)，其基因产物的部分结构与免疫球蛋白十分类似，属于免疫球蛋白超家族的一员。CEA是一种癌的相关抗原，自1965年发现后被认为是结肠癌的标志物(60％-90％病人升高),但以后发现其他脏器肿瘤CEA有较高的表达。CEA主要是空腔脏器如胃肠道、呼吸道、泌尿道、乳腺、卵巢等恶性肿瘤疾病的肿瘤标志物，现如今其临床应用越来越广泛。CEA是一种广谱肿瘤标志物，主要用于消化道癌的检测，在其他肿瘤中也有一定的表达，研究表明，CEA与乳腺癌的临床分期及有无转移等有关，乳腺癌患者血清中CEA水平显著高于正常对照组和乳腺良性疾病组，CEA随着临床分期的升高而逐渐升高。说明CEA对乳腺癌的诊治、疗效和预后的观察有一定意义。

CYFRA21-1(C角蛋白19片段抗原21-1)细胞角蛋白是普遍存在于上皮细胞中的细胞结构蛋白，是近年来被推广的新型肿瘤标志物，主要由细胞角蛋白19的两个单克隆抗体组成，CY和FRA分别取自cytokeratin和fragment，而21-1则代表用于检测细胞角蛋白19片段的两株单克隆抗体Bml9.21和KS19.1。存在于单层和复层上皮肿瘤细胞的胞质中，在正常情况下CYFRA21-1以寡聚物形式存在，其在外周血、骨髓、淋巴结中无表达或低表达，含量极低，当上皮细胞癌变时，被激活的蛋白酶加速了细胞角蛋白的降解，CK结构不变而含量升高当癌细胞溶解或坏死脱落时，可释放大量CYFRA21-1入血，使其含量异常升高并被释放出来，使组织、血液中的浓度上升，因此CYFRA21-1可作为一项上皮源性肿瘤标志物。血清CYFRA21-1在多种肿瘤中有明显上升，CYFRA21-1近几年来在肿瘤临床的应用越来越广泛，在许多上皮性癌如肺癌、鼻咽癌等都有不同程度的检出率，因此单项检测缺乏部位准确性，但由于该检测指标有较好的癌与非癌的鉴别能力，与肿瘤相关抗原进行联合检测可有效提高诊断的敏感性，同时有研究表明，对于复发性乳腺癌及判断乳腺癌手术、化疗的效果，CYFRA21-1具有明显的优势。

P53抗体：P53基因是研究最早、最多的抑癌基因之一。到目前为止，在许多恶性肿瘤中均发现P53异常，抑癌基因P53的突变导致异常蛋白过量表达均与癌变基因有关，乳腺癌P53基因过度表达常与病人年龄(＜50岁)、雌激素受体阳性和组织学分级相关。野生型P53是隐性抑癌基因，在细胞的生长过程中扮演者“分子警察”的角色，对细胞基因的完整性起着监督作用。而突变型P53则是线性癌基因，完全丧失了这种功能，可引起细胞的转化和癌变，是细胞无限增殖，提示若p53表达阳性，乳腺癌患者预后则较差P53高表达乳腺癌具有较强的浸润和转移能力，P53突变与乳腺癌预后不良显著相关。

sHLA-G：HLA-G即人类白细胞抗原系统-G是一种非经典的HLA-I类抗原，并选择性的在胎盘表达，参与保护胎盘免收母体淋巴系统的攻击。近十年来，在人类黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌等中都可见HLA-G的表达，HLA-G与肿瘤免疫已经成为关注焦点。肿瘤免疫是以细胞免疫为主，CD8+CTL介导的细胞免疫是抗肿瘤免疫的主要效应细胞。体液免疫和其他细胞因子为辅。HLA-G可能是导致肿瘤细胞免疫逃逸的一种机制。因为胎儿对母体是半个异体，会受到母亲的免疫排斥。在正常情况下，HLA-G具有抑制母亲的免疫反应的功能，因此在胎儿免疫耐受机理中起着关键性的作用，正因为HLA-G这种抑制免疫反应的功能，癌细胞表达HLA-G就可能使其逃脱机体的免疫监视，从而更容易发展、浸润和发生转移，成为肿瘤免疫逃逸的重要机理之一。Lefebvre等发现38％的乳腺癌活检组织表达HLA-G，并且大部分以可溶性形式sHLA-G释放到体液中，研究提示，在人类乳腺癌中sHLA-G的表达是上调的。目前的研究显示，在某些肿瘤组织中表达HLA-G，HLA-G通过抑制NK细胞、CTL等效应细胞的作用，改变机体细胞因子分泌的模式，同时细胞因子又上调HLA-G的表达等多种途径来抑制机体的肿瘤免疫反应，使肿瘤细胞发生免疫逃逸而得以生存发展。

综上所述，本发明的优点：单项检测的敏感性及准确性均不如联合检测，其中此五种组合的敏感性及准确性最高。联合检测可以弥补单项指标的不足，可以互相取长补短。肿瘤的临床分期是公认的乳腺癌预后评估的重要指标，所以检测其乳腺癌患者血清中的水平判断良恶性及预后评估方面都具有重要的临床意义，可以为临床提供确切的辅助诊断。为医生对预后和复发做出几率判断，并能够指导医生制定相应的治疗方案和指导用药。

具体实施方式

研究对象：所有病例均为女性，系本省肿瘤医院外科收治的住院患者。乳腺癌组：53例，平均年龄50.1±23.4岁。病理分型均经本院病理科证实，均为浸润性导管癌。采用1997年国际抗癌联盟(UICC)公布的乳腺癌TNM分类法进行TNM分期，其中一期8例，二期19例，三期26例，四期0例。良性疾病组：50例，平均年龄47.3±21.5岁。均经本院病理科证实，其中乳腺增生32例，乳腺纤维瘤18例。正常对照组：50例，平均年龄46.8±20.4岁。为本院正常体检人员。年龄无明显差异。

实验方法：乳腺癌组及良性疾病组患者均在采取治疗前3天抽取清晨空腹静脉血，正常对照组抽取清晨空腹静脉血，分离血清，-70℃保存待测，五种标志物的血清水平检测均采用ELISA方法中的双抗体夹心法进行检测。

实验仪器及试剂耗材：五种标志物各自利用相应的Elisa试剂盒，分别为：人癌胚抗原Elisa试剂盒、糖类抗原CA153Elisa试剂盒、sHLA-G Elisa试剂盒、CYFRA21-1Elisa试剂盒、人P53抗体Elisa试剂盒。酶标仪(450nm)；高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL；37℃恒温箱，去离子水，吸水纸等。其中Elisa试剂盒均购买自上海名劲生物科技有限公司，酶标仪购买自北京科华生物ST360。

实施步骤：(1)乳腺癌组及良性疾病组患者均在采取治疗前3天抽取清晨空腹静脉血，正常对照组抽取清晨空腹静脉血，分离血清，收集血液后静止凝固，所有标本均在4h内用低温离心机3000rpm离心10min，取血清分装于EP管中，-80℃冰箱保存待测；

(2)取出试剂盒从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条；

(3)包被：用0.05M PH9.0碳酸盐包被缓冲液将各自抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；

(4)设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

(5)将待测样本在-80℃取出，平衡至室温，样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL，置37℃孵育1小时，然后洗涤；

(6)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min；

(7)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；

(8)每孔加入底物A、B各50μL，(TMB-过氧化氢尿素溶液底物)37℃避光孵育15min；

(9)每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

上述五种标志物抗体血清水平检测的实验步骤均严格按照试剂盒中说明书进行，大致实验步骤一致如下所示：

值得注意的是各试剂盒的标准品浓度设置是有区别的，下面一一列出各试剂盒的原理以及检测步骤：

其中CEA试剂盒原理：本试剂盒采用双抗体夹心法测定标本中人癌胚抗原(CEA)水平。用纯化的人癌胚抗原特异性抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入癌胚抗原(CEA)，再与HRP标记的癌胚抗原特异性抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色深浅与样品中的癌胚抗原呈正相关。用酶标仪在450nm下测OD值。

CEA标准品浓度分别为：50、100、200、400、800pg/ml，浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。注：标准品用标准品稀释液依次做倍比稀释

实验步骤严格按照试剂盒说明书中进行：

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品加样50μL，待测样品孔先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

3.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

4.加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外；

5.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7.显色：每孔加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；

8.终止：每孔加入终止液50μL，终止反应；

9.测定：以空白孔调零，450nm波长依次序测量各孔的吸光度，测定应在加终止液后15分钟以内进行。

P53试剂盒检测原理：本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法，用抗TP53抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品种的TP53会与包被抗体结合，游离成分被洗去。依次加入生物素化的抗人TP53抗体和辣根过氧化酶标记亲和素。抗人TP53抗体与结合在包被抗体上的人TP53结合、生物素与亲和素特异性结合形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm和630nm波长下测OD值，计算P53指数。

其中P53标准品浓度为0、78.13、156.25、312.5、625、1250、2500、5000pg/ml，洗涤液1:25稀释。

实验步骤严格按照试剂盒说明书中进行：

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μL，余孔分别加标准品或待测样品100μL，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应90分钟；

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每空加生物素话抗体工作液100μL，37℃，60分钟；

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μL/孔，甩干；

4.每孔加酶结合底物100μL，37℃，60分钟；

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μL/孔，甩干；

6.依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光显色(30分钟内)；

7.依序每孔加终止液50μL，终止反应；

8.用酶标仪在450nn、630nm处依序测量各孔的OD值，在加入终止液15分钟后测量。

CYFRA21-1试剂盒原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人细胞角蛋白21-1片段水平。用纯化的人细胞角蛋白21-21片段抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入细胞角蛋白21-1片段，再与HRP标记的细胞角蛋白21-1片段抗体结合，形成抗体抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色深浅与样品中的癌胚抗原呈正相关。用酶标仪在450nm下测OD值。

其中CYFRA21-1标准品浓度依次为：2.5、5、10、20、40ng/ml，洗涤液1:30稀释。

实验步骤严格按照试剂盒说明书中进行：

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品加样50μL，待测样品孔先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

3.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

4.加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外；

5.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7.显色：每孔加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；

8.终止：每孔加入终止液50μL，终止反应；

9.测定：以空白孔调零，450nm波长依次序测量各孔的吸光度，测定应在加终止液后15分钟以内进行。

sHLA-G试剂盒原理：本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中sHLA-G水平。用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入HLA-G抗原、生物素化的抗人HLA-G抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色深浅和样品中HLA-G抗体呈正相关。用酶标仪测450nm下的OD值，计算样品浓度。

其中sHLA-G标准品浓度：200、100、50、25、12.5、6.25、3.12U/ml。

实验步骤严格按照试剂盒说明书进行：

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μL，余孔分别加标准品或待测样品100μL，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟；

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。没空加检测溶液A工作液100μL，37℃，60分钟；

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μL/孔，甩干；

4.每孔加检测溶液B工作液100μL，37℃，60分钟；

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μL/孔，甩干；

6.依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光显色(30分钟内)；

7.依序每孔加终止液50μL，终止反应；

8.用酶标仪在450nn处依序测量各孔的OD值，在加入终止液15分钟后测量。CA153试剂盒原理：

采用酶联免疫夹心法及亲和素、生物素放大检测系统检测血清中CA153含量。首先用亲和素包被微孔板，制成固相亲和素，然后加入生物素标记抗体和标准品或待测血清，洗涤后再加入辣根过氧化物酶标记单抗，使之形成亲和素-生物素标记单抗-CA153-酶标单抗的复合物，经此案色后再酶标仪测定OD值，计算出CA153含量。

其中CA153标准品浓度10、40、80、160U/ml，浓缩洗涤液1:20稀释。

实验步骤严格按照试剂盒说明书进行：

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品加样25μL，待测样品孔加待测样品25μL(用样品稀释液1:41稀释)，然后各孔加入生物素标记抗体25μL(空白对照孔除外)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟；

3.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

4.加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外；

5.温育：用封板膜封板后置37℃温育120分钟；

6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7.显色：每孔加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；

8.终止：每孔加入终止液50μL，终止反应；

9.测定：以空白孔调零，450nm波长依次序测量各孔的吸光度，测定应在加终止液后15分钟以内进行。

检测数据计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

统计分析：采用SPSS19.0统计软件分析，检测结果均采用均数±标准差(X±s)表示，分析CA153、CEA、sHLA-G、CYFRA21-1和P53抗体五种标志物的三个组别中血清水平；分析五种标志物在乳腺癌不同分期中的血清水平，分析五种单一标志物及联合标志物在乳腺癌组不同分期、良性疾病组合正常对照组中的阳性率；分析以P＜0.05为差异有统计学意义，上述分析检测结果差异均具有统计学意义。

判定标准：CEA的临界值为5ng/ml，CA153的临界值为25U/ml，CYFRA21-1的临界值为2.5ng/ml，sHLA-G的临界值为82.3U/ml，P53采用P53指数，当P53指数>1.7为阳性，其中P53指数＝样本(OD₄₅₀/OD₆₃₀)/对照血清(OD₄₅₀/OD₆₃₀)，超出临界值判定为阳性。

检测方法：分别检测乳腺癌组、良性乳腺疾病组合、正常对照组血清中CEA、CA153、sHLA-G、CYFRA21-1和P53抗体五种血清标志物的含量，对比三组之间数据差异，并分析了乳腺癌临床分期与各标志物水平的关系，最后做了单项指标以及五种指标联合检测用于乳腺癌诊断中的比较。

检测结果如表1-3：

表1.三组之间5种标志物水平的比较

结果分析：乳腺癌组五种血清指标含量明显高于良性乳腺疾病组和正常对照组，并且差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2乳腺癌临床分期与各标志物水平的关系

结果分析：通过对乳腺癌不同分期患者检测相应的5中血清标志物指标，明显看出随着分期的增高，标志物的含量都处于一个快速增长的趋势，并且五种标志物的趋势是一致的，差异非常明显，不同分期各指标含量的差异具有统计学意义。

表3.单项指标及五种联合指标用于乳腺癌诊断的比较(例数(％))

分析：结果根据我们的实验结果可以看出分别检测CEA、CA153、sHLA-G、CYFRA21-1以及P53抗体，对比乳腺癌组、良性疾病组和正常对照组阳性率，CEA分别为41.5％、6％、2％；CA153分别为50.94％、20％、4％；sHLA-G分别为39.62％、2％、0；CYFRA21-1分别为45.28％、4％、2％；P53抗体分别为28.3％、2％、0；差异具有一统计学意义。CEA、CA153、sHLA-G、CYFRA21-1以及P53抗体五种血清标志物对对乳腺癌检出的阳性率分别为41.5％、50.94％、39.62％、45.28％、28.3％。特异性分别是96.15％、89.28％、99％、97.09％、99％。阳性率也就是敏感性最高的是CA153，特异性方面各标志物都很高，联合五种标志物检测敏感性提升到了90.57％,特异性仍然保持在较高水平88.5％。说明联合五种标志物检测对于乳腺癌的检出率得到大幅度的提高，弥补了单一标志物敏感性太低的缺陷，为预后以及复发转移提供辅助诊断，为医生的个体化用药以及诊断提供支持。

其中乳腺癌的分期标准：第1期：肿块完全限于乳腺组织内，直径不超过2cm，与皮肤无粘连，腋窝淋巴结无转移；第2期：肿瘤直径为3～5cm，与皮肤有粘连或无粘连，有一定活动度，腋窝有肿大淋巴结，但无融合趋势；第3期：肿瘤直径超过5cm，与皮肤有粘连，或与胸肌有粘连，或穿破皮肤，同侧腋窝淋巴结肿大，有融合。第4期：肿瘤广泛侵犯乳腺皮肤，或形成卫星结节，或与胸壁固定，或广泛淋巴结转移，或远处转移。

Claims (4)

1.一种用于检测乳腺癌的标志物，其特征在于，该标志物为CA153、CEA、sHLA-G、CYFRA21-1和P53抗体。

2.一种联合检测五种生物标志物抗体用于检测乳腺癌的方法，其特征在于，所述五种标志物的血清水平检测均采用ELISA方法中的双抗体夹心法进行检测；临界值设定：CEA的临界值为5ng/ml，CA153的临界值为25U/ml，CYFRA21-1的临界值为2.5ng/ml，sHLA-G的临界值为82.3U/ml，P53采用P53指数，当P53指数>1.7为阳性，其中P53指数＝样本(OD₄₅₀/OD₆₃₀)/对照血清(OD₄₅₀/OD₆₃₀)，超出临界值判定为阳性；

统计学分析：采用SPSS19.0统计软件分析，检测结果均采用均数±标准差(X±s)表示。

3.根据权利要求2所述的联合检测五种生物标志物抗体用于检测乳腺癌的方法，其特征在于，所述统计学分析：分析CA153、CEA、sHLA-G、CYFRA21-1和P53抗体五种标志物在乳腺癌组、良性疾病组患者以及正常对照组三个组别中血清水平；分析五种标志物在乳腺癌不同分期中的血清水平，分析五种单一标志物及联合标志物在乳腺癌组不同分期、良性疾病组合正常对照组中的阳性率；分析以P＜0.05为差异有统计学意义，上述分析检测结果差异均具有统计学意义。

4.根据权利要求2所述的联合检测五种生物标志物抗体用于检测乳腺癌的方法，其特征在于，所述ELISA双抗体夹心法进行血清水平检测的实验步骤为：

(1)乳腺癌组及良性疾病组患者均在采取治疗前3天抽取清晨空腹静脉血，正常对照组抽取清晨空腹静脉血，分离血清，收集血液后静止凝固，所有标本均在4h内用低温离心机3000rpm离心10min，取血清分装于采血管内，-80℃冰箱保存待测；

(2)取出试剂盒从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条；

(3)包被：用0.05M PH9.0碳酸盐包被缓冲液将各自的抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜，次日弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；

(4)设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

(5)将待测样本在-80℃取出，平衡至室温，样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL，置37℃孵育1小时，然后洗涤；

(6)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min；

(7)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；

(8)每孔加入TMB-过氧化氢尿素溶液底物底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；

(9)每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。