JP4406510B2 - 移動を阻止するために多孔度の減少を利用したアッセイ法 - Google Patents
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Description
(技術分野)
本発明は分析物を測定するためのアッセイ装置に関するものであり、詳細には従来の免疫捕獲法を用いるのではなく、分析物を多孔質材内で機械的に捕獲する装置に関する。
【0002】
(発明の背景)
標準迅速試験側方流動装置の形式はこの約10年間変化していない。典型的には、この装置にはニトロセルロースのストリップが含まれる。試料は、試料適用域に添加され、問題となる分析物に特異的な、可視的に標識された抗体を担持する領域へと毛細管現象によって流動する。そして、遊離又は結合した標識物質は捕獲領域へとさらに移動し続け、そこで固定化された分析物特異抗体が分析物−標識複合体と結合する。遊離の標識(未結合抗体)は移動を続け、分析物に特異的なシグナルは捕獲領域に留まる。このようなタイプの側方流動装置はEP-A-0284232などに開示されている。また、基本アッセイへの種々の改変がWO92/12428、EP-A-0613005、WO97/06439、及びUS-5,741,662などに開示されている。
【0003】
これらの方法はいずれにおいても、分析物−標識複合体は固定化された試薬、一般的には分析物に特異的な抗体によって媒介される。しかし、この方法には多くの点で不都合が見受けられる。
【0004】
第1に、製造品質管理が難しい。固相捕獲膜には一般にニトロセルロースが用いられ、抗体が直接膜に添加される。しかし、ニトロセルロース製品は均質ではない。そこで、固相抗体の品質管理においては、同一の、しかし不均質なバッチからの装置の統計学的サンプルを試験し、バッチ全体として一定の許容範囲内の結果が得られると仮定することに限られている。しかし、一つのバッチあるいはロット番号が同じであっても膜ごとにかなりのばらつきがあることは良く知られている。
【0005】
第2に、製造が比較的複雑である。ストリップへの固定化する抗体の添加と可動性の標識抗体の添加には別々の工程が必要である。捕獲用の抗体はニトロセルロースのストリップに直接散布できるが、標識用の抗体は続いて毛細管現象が確実に起きるように重なりを持たせてニトロセルロースのストリップと接合させる物質に浸漬させる必要がある。
【0006】
第3に、抗体は膜に溶液を吹き付けて固定化される。しかし、膜と強力に結合しない抗体や、固定化された抗体に付着しているだけの抗体が存在する。このような半結合または未結合の抗体は溶媒の先端が通過する際に移動する可能性があり、検出領域における標識物質の結合の減少を招く。装置が対照ラインを有する場合には、検出領域で捕獲されるべきであった付加的な標識物質を捕獲することになる。従って、排卵予測キットのように対照ラインと検出ラインの間の色強度の比較に依存する試験では誤った結果が得られる可能性がある。さらに、吹き付けによる添加では膜内への拡散を避けることができないため、より拡散した、集中していない検出シグナルとなる。
【0007】
第4に、装置の感度が装置の形態によって制限される。分析物と標識抗体は膜を移動する間に反応する。従って、分析物−標識複合体が形成される時間を最大とするため、標識抗体が溶媒の先端を流れるように流速の調節を行う。しかし複合体は捕獲用抗体上を短時間で通過し、このことが、試験のデザインや性能特性に制約を加えている。反応時間が短いと感度が低下するため、親和性の高い捕獲用抗体が必要となる。
【0008】
最後に、このような試験装置では膜上に固定された捕獲用抗体が時間の経過に従って変性するため、それによって依存期間が制限されることが多い。
【0009】
分析物−標識複合体の捕獲に、固定化された抗体を使用しない本発明では、従来の技術による装置の欠点が解決される。
【0010】
(発明の開示)
本発明は、捕獲領域と連絡する、標識物質がそこで分析物と結合する標識領域において、当該捕獲領域の細孔サイズが分析物に未結合の標識は通過できるが、分析物に結合した標識は通過できないサイズである上記捕獲領域を含む、分析物のアッセイ装置を提供する。
【0011】
標識領域から捕獲領域への移動の間において、未結合標識物質は捕獲領域に浸入および通過が可能であるが、結合した標識物質は標識領域と捕獲領域の接続部で捕獲される。捕獲領域の入口で捕獲される標識物質の量と捕獲領域を通過する量を比較することにより、分析物の濃度を測定することができる。分析物の濃度が高いと標識領域と捕獲領域の接続部に蓄積される標識物質の量も増加する。
【0012】
遊離の標識物質が捕獲領域に停留しないよう、本発明では、分析物よりも小さい標識物質に依ることは明白である。
【0013】
本装置は生物学的細胞等のように標識物質(標識抗体など)に比べ大きい分析物のアッセイに特に適している。アッセイに好適な細胞とは、精子やバクテリアなどの微生物である。
【0014】
標識領域とは標識物質が分析物と接触する場所である。これはHDPE素材、結合性ポリエステル繊維、ガラス繊維などのパッドのような繊維状物質で形成されることが望ましい。細孔サイズは、捕獲領域の細孔に比べると、分析物が比較的自由に通過することのできる大きさでなければならない。
【0015】
標識物質は典型的には分析対象となる分析物に結合能を有する抗体であり、適切に標識されたものである。例えば、蛍光標識、金コロイド(桃色に目視可能)等の粒子標識、またはエオジン等による染色といった、肉眼で可視的な標識が望ましい。「抗体」という用語には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、さらには必要な生物学的特異性が保持される抗体フラグメント(F(ab)2, Fcなど)も含まれることに留意されたい。
【0016】
捕獲領域はどのような適当な多孔質材であってもよいが、未結合標識物質は移動可能で、分析物と結合した標識物質は移動できないものでなければならない。この要求が捕獲領域の細孔サイズに反映される。一の態様においては、公称細孔サイズが1〜75μm、好ましくは10〜50μm、さらに好ましくは20〜35μmのHDPR素材で捕獲領域が形成される。第二の態様においては、公称細孔サイズが約1〜15μm、好ましくは3〜10μm、さらに好ましくは5〜8μmのニトロセルロース素材を用いて捕獲領域が形成される。
【0017】
いくつかの態様においては、標識領域と捕獲領域に1枚の細孔サイズを低下させた領域を有する多孔質材を用いることも可能である。例えば、多孔質材の一部を押しつぶす又は圧縮して細孔サイズを狭め、分析物と結合した標識物質の圧縮部位への浸入を阻止すること、つまり捕獲領域の形成が可能である。代替的に、素材の細孔の一部を遮蔽して同様の効果を得ることも可能である。
【0018】
従来公知のように、多孔性物質の公称細孔サイズは、硬質粒子のチャレンジテスト、すなわち膜を通過し得る球状粒子の最大直径を測定することによって決定される。代わりに素材の細孔サイズはその「バブルポイント」を測ることによっても決定可能である。バブルポイントは(水に)浸漬した膜に空気を通過させるのに必要な圧力であり、粒子捕捉で測定される細孔サイズに相関を示す(ただし、圧力や細孔サイズが極端の場合には相関は低くなると思われる)。バブルポイントは一般に粒子捕捉法よりも測定が簡単であることから、細孔サイズの測定試験法として好まれる。
【0019】
本発明の装置を特に運動性の分析物(運動性精子や運動性微生物など)の検出および測定に用いる場合には、適切な細孔サイズをルーチン試験によって経験的に決定してもよい。
【0020】
好ましい態様においては、分析物と未結合の標識を捕捉する領域(「標識対照」領域)を捕獲領域内に含む。これは典型的には分析物特異的な標識物質と結合することがでいる抗体を捕獲領域に固定したものを含む。捕獲領域の入口で捕獲されずに捕獲領域を通過する標識物質を、この「標識対照」領域で捕獲し測定することができる。例えば、分析物特異的な標識物質がげっ歯類モノクローナル抗体である場合、捕獲領域には固定化した抗マウス抗体を含む領域を含ませてもよい。このように、未結合標識物質は標識領域と捕獲領域の接続部または「標識対照」領域のいずれかに保持される。これら2つの位置における標識物質の量を比較することで、評価対象の先の試料に含有される分析物の量の測定が可能となる。
【0021】
また、別の構成として、別々に標識した2種の抗体であってそのうち一方のみが分析物に特異的であるものを装置の標識領域で使用することもできる。分析物を認識しない標識物質は、「標識対照」領域の抗体に特異的である。この標識物質は捕獲領域を通過し、「標識対照」領域に蓄積されるので、捕獲領域の入口における分析物特異的なシグナルとの比較基準となる。分析物特異的な標識物質は「標識対照」抗体とは結合せず、移動を続ける。
【0022】
標識領域と捕獲領域の間の境界面は捕獲領域の長さよりも狭い方が好ましい。標識領域と捕獲領域が素材の一部を重ね合わせたストリップで形成される場合には、重なり部分の大半を非多孔質材で覆うことで2つの領域の接続領域を狭めることが可能である。標識領域と捕獲領域の間の接続部を確実に狭くすることで分析物−標識複合体は標識領域と捕獲領域の接続部に集中し、鮮明なシグナルを得ることができる。
【0023】
分析物は好ましくは精子である。標識物質は好ましくはサブセットよりも精子の大半の細胞群に存在する表面抗原を認識する。従ってどの表面抗原を用いても良いが、(P34H(WO97/40836)、SP-10(WO95/29188)、さらにはEP-A-0387873を参照)、「普遍的」な抗原、例えばCD59が好んで用いられる。抗原が精子に特異的でない場合(つまり、CD59のように他の細胞種にも存在する場合)、分析する試料には精子以外の細胞の除去処理が必要となる。捕獲領域で精子の移動を阻止するためには、公称孔径が5〜8μmの範囲のニトロセルロース膜が好ましい。分析に先だって、精子試料に、運動性と非運動性の細胞に分離する処理を行ってもよい(国際出願番号 PCT/GB99/01929 および PCT/GB99/02685を参照)。本発明の装置を用いて、このような分離処理後の結果を比較することにより、試料中の運動性細胞と非運動性細胞の数の比を測定することができる。操作後に3つのシグナル、即ち非運動性細胞と結合した標識物質、運動性細胞と結合した標識物質、および未結合標識物質を明確に区別できるように、運動性の精子を非運動性の精子から捕獲領域に入る前に分離する方法を本発明の装置に含ませてもよい。しかし、このような方法で細胞の分離を行うことはすべての試験で必ずしも必要ではなく、例えば精管切除術の確認検査のような場合には、この方法で運動性の有無に関わらず精子全体のレベルを簡単に示すことができる。一般的には、分析に供する精子含有試料には精液の「原液」ではなく、希釈し、できれば精子以外の細胞を除去したものを用いる。「原液」の精液を分析する場合には、一般に精子以外の細胞が標識されないよう、精子に特異的な標識物質を用いる必要がある。
【0024】
代替的に、分析物は微生物であってもよい。微生物は、腸内毒素原性大腸菌(「ETEC」)[例えばLevin (1987) J. Infect. Dis 155:377-289 を参照]のようなバクテリアであってもよく、そのためには適切に標識したETEC特異的な抗体、例えば金を結合した抗CFA/Iモノクローナル抗体などを標識物質として用いることができる。また、微生物はカンジダなどの酵母であってもよい。
【0025】
好ましい態様においては、標識領域前および/または捕獲領域後の吸水材が毛細管現象を補助することにより、試料の捕獲領域への移動が補助される。
【0026】
本発明のいくつかの態様では、試料を捕獲領域に直接添加するものであってもよい。この場合には、標識物質は標識領域から捕獲領域を通って移動し、そこで試料と遭遇する。標識物質は捕獲領域に担持されている分析物と結合して留まり、未結合標識物質は移動を続ける。
【0027】
本発明の装置は試験用ストリップやディップスティックといった便利な形態で、容易かつ低価格に製造することが可能である。さらに、例えば家庭でのユーザーによっても、極めて簡単に用いられる。このように、本発明は例えば男性の受精能などの基本的なスクリーンを家庭で行うことのできるアッセイ装置を提供する。
【0028】
(本発明の実施形態)
例1 基本の側方流動試験装置
図1に示す装置は濾紙のストリップ(1)、金で標識した抗精子標識抗体を含有する第1吸収パッド(2)、精子を含有する試料を受領するための第2吸収パッド(3)、ニトロセルロース膜(4)、および上部吸水材(5)を含む。吸収パッド(3)とニトロセルロース膜(4)の間には、わずかなマージン(7)を残してパッド(3)と膜(4)の接触を妨げる薄いアセテート製ストリップがある。膜(4)には、未結合の抗精子標識抗体と反応し得る抗体を固定化したライン(8)が含まれる。
【0029】
ニトロセルロース膜(4)は5mm×25mmの大きさで、5mm×73mmの大きさの堅いプラスティック製の裏板上に載せる。膜(4)の一端に5mm×30mmの大きさの上部吸水材(5)を重複部分が5mmとなるように付し、別の一端に5mm×4mmの大きさの薄いアセテート製ストリップ(6)を貼付する。5mm×5mmの大きさの吸収パッド(3)をアセテート製ストリップ(6)上に置き、5mm×1mmのマージンを持ちニトロセルロースストリップ(4)と接触させる。5mm×5mm大の吸収パッド(2)をパッド(3)とストリップ(6)の両方に接するように取り付ける。20mm×5mm大の濾紙(1)を吸収パッド(2)の下に2mm重なるように取り付ける。
【0030】
濾紙(1)はAhlstromブロッティンググレードの濾紙No.222を用いる。吸収パッド(2)は厚さ0.6mm、公称細孔サイズ99μm のHDPE結合素材(Sintair Ltd, イングランド)である。これを40nmの金粒子を結合した抗CD59モノクローナル抗体(Bristol 大学, 英国)溶液(5%トレハロース、0.1%Triton-X(Sigma)、および1%BSAを含有する精製水で希釈)に浸し、減圧下で完全に乾燥させた。吸収パッド(3)は同じHDPE素材で作成するが、pH6.6の1%BSAおよび0.1%Triton-Xに浸漬した後に乾燥させた。ニトロセルロース膜(4)はAdvanced MicroDevices 社製の8μmニトロセルロース膜(CNPF-S1-L2-H50, ロット番号HF322228/731)である。上部吸水材(5)の作成には、Whatman社製 クロマトグラフ用紙(カタログ番号3MM CHR, ロット番号3030640)を供給されたまま処理せずに用いる。
【0031】
対照抗体の細いライン(8)[Jackson's AffiniPure のFCおよびフラグメント特異的ヤギ抗マウスIgG(ヒト、ウシ、および馬の血清蛋白との交差反応は最小;コード115-005-071、ロット36019)、2mMリン酸および0.017%BSAで希釈] は、マージン(7)と上部吸水材(5)の間の膜上(4)に固定化した。
【0032】
この装置を使用するには、精子を含有する試料を吸収パッド(3)に添加し、濾紙(1)を適切な緩衝液等の中に設置する。緩衝液は濾紙(1)、吸収パッド(2)を通って移動し、金結合抗体を運んでパッド(3)の精子と接触させる。溶液がパッド(3)からマージン(7)へと移動する間に抗体は試料と結合することができる。標識された精子はその細孔サイズが小さいためニトロセルロース膜(4)を通過できず、マージン(7)に留まることになる。このように、マージン(7)は、大きすぎて膜(4)の細孔を通過できない物質を捕獲する「チョーク領域」としての役割を果たす。しかし、未結合の金結合抗体は、それらと結合する抗体ライン(8)に到達するまで移動を続ける。この段階で2本の目視可能なライン(1本は移動してきた標識物質が精子と結合して捕獲される「チョーク領域」(7)、もう1本は固定化した対照抗体と結合することによって捕獲されるライン(8)領域)が出現する。
【0033】
例2 − 精子の定性的試験
テスト実験において2種の試料を用いた−第一の試料は運動性精子(生殖能を有する男性の射精液から非直接的スイムアップ法により入手)を含有するHEPES緩衝液であり、第2の試料はHEPES緩衝液のみとした。別々の2つの装置の吸収パッド(3)上に各試料75μlずつを添加し、各々75μlのHEPESを含む別々のウェル中に置いた。
【0034】
15分後には、第1の試料を用いた装置には2本の明瞭な赤いラインが膜上(4)に現れた。1本目は吸収パッドの約1mm上、2本目はライン(8)であった。しかし、もう一方の装置では、ライン(8)上に1本の赤いラインを含むのみであった。このように、この装置は精子を機械的に「チョーク領域」近辺に捕獲することが可能である。
【0035】
例3 − 精子の定量的試験
次の試験においても、HEPES緩衝液中の運動性精子試料は生殖能を有する男性の射精液から非直接的スイムアップ法により入手した。スイムアップ後のHEPES緩衝液1mlあたりの運動性精子数は、計数室を用いて算定した結果350万個であった。この試料をさらにHEPESで希釈し、精子数がそれぞれ200、100、50、および25万個/mlの4試料を調製した。これら5つの試料から各々75μlを5つの別々の装置の吸収パッド(3)上に置き、HEPES75μlの入った別々のウェル中に置いた。また、緩衝液のみを対照として用いた。
【0036】
15分後、それぞれの装置に2本の明瞭な赤いラインが、1本目は吸収パッド(3)の約1mm上、2本目はライン(8)に出現した。しかし、図2で明確に示されるように、1本目のラインの強度は希釈によって精子数が減少するに従って弱くなった。対照試料では1本目のラインは認められなかった。以上のように、本装置は「チョーク領域」付近に用量依存的捕獲を行うことができる。
【0037】
(その他の態様)
本発明を説明する上述の態様は例にすぎず、本発明の範囲および意図を越えることなく改変を加えることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明における側方流動装置を示す図である。
【図2】 本装置を用いた用量−反応曲線試験の結果を示す図である。
Claims (10)
- 形態が検査用ストリップまたはディップスティックである、分析物のアッセイ装置であって、
捕獲領域と連絡する、標識物質がそこで分析物に結合することができる標識領域を含み、該捕獲領域の細孔サイズが、分析物に未結合の標識物質は通過できるが、分析物に結合したものは通過できないサイズであり、
(a)分析物が精子であり、(b)標識物質が分析物より小さいことを特徴とする、
上記アッセイ装置。 - 標識物質は対象の分析物と結合しうる抗体である、請求項1記載の装置。
- 抗体が肉眼で目視可能である、請求項2記載の装置。
- 抗体が金コロイドで標識される、請求項3記載の装置
- 捕獲領域がニトロセルロースである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の装置。
- 標識領域と捕獲領域が細孔サイズを減少させた領域を有する一片の多孔質材から形成される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の装置。
- 捕獲領域が、分析物に未結合の標識物質を保持する固定化された抗体の領域を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の装置。
- 標識領域と捕獲領域の間の境界面が、標識領域と捕獲領域の間の流れの方向に沿って測定したとき、捕獲領域の長さに比べて狭い、請求項1〜7のいずれか一項に記載の装置。
- 標識物質がCD59を認識する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の装置。
- 試料の捕獲領域への移動が標識領域前および/または捕獲領域後の吸水材によって補助される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の装置。
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