CN110596393A - 胃蛋白酶原ⅰ和胃蛋白酶原ⅱ的联合检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的联合检测方法，包括免疫层析试纸条组装、抗体包被、样品稀释液制备、样品检测等步骤；本发明利用荧光免疫层析技术，采用双抗夹心的方法，可在加样后10分钟检测出血清或者血浆中的胃蛋白酶原I/II的含量，具有简便快速的优势，避免了X‑射线对人体的侵害和胃镜的不便，同时经过对不同浓度样品的检测，灵敏度比较高，相关性良好。

Description

胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的联合检测方法
技术领域
本发明涉及体外诊断领域，具体涉及胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的联合检测方法。
背景技术
胃蛋白酶原(PG)是胃蛋白酶的前体，根据其生化性质和免疫原性将其分成2个亚群，1-5组分的免疫原性相同，称为胃蛋白酶原I，主要由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；6-7组分被称为胃蛋白酶原II，除由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌外，贲门腺和胃窦的幽门腺的黏液颈细胞以及十二指肠上段也能产生胃蛋白酶原II。血清胃蛋白酶原水平反映了不同部位胃粘膜的形态和功能：PGI是检测胃泌酸腺细胞功能的指针，胃酸分泌增多PGI升高，分泌减少或胃粘膜腺体萎缩PGI降低；PGII与胃底粘膜病变的相关性较大(相对于胃窦粘膜)，其升高与胃底腺管萎缩、胃上皮化生或假幽门腺化生、异型增值有关；PGI/II比值进行性降低与胃粘膜萎缩进展相关。因此，联合测定PGI和PGII比值可起到胃底腺粘膜“血清学活检”的作用，通过其血清测量值的不同，在各胃部疾病中均有不同程度的改变，为临床提供可靠的诊断价值。
目前临床胃部疾病及胃癌的检测方法主要包括内窥镜、B超、X线检测、肿瘤标志物等。X线作为传统的胃癌检测手段，对进展期胃癌或弥散型胃癌更有诊断价值，但此法存在射线暴露，检查费用较高等问题，而且对早期胃癌的判定显得无能为力；内窥镜费用较高，对操作人员的技术要求高，而且下胃镜又令患者很痛苦，结果使不少患者望而却步，对亚临床症状患者尚不能作为普查手段；与胃癌有关的肿瘤标志物对于普通胃病及早期胃癌的诊断价值不大。
相比与其他胃部检测手段，血清PGI/PGII联合检测具有无创伤、简便、可靠和费用低廉等优点，目前已建立多种检测方法，如酶联免疫法、化学发光法、免疫比浊法、时间分辨等，并且已在医院和体检中心广泛使用，但是往往需要昂贵的仪器和试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的联合检测方法，灵敏度高、相关性良好。
为实现上述目的，本发明的技术方案提供胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的联合检测方法，包括如下步骤：
(1)免疫层析试纸条组装：将样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫依次搭接并粘贴固定在底板上，反应膜上远离结合垫的一端设置有控制线，在控制线和结合垫之间还设置有检测线I、检测线II；
(2)抗体包被：将荧光乳胶标记的胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、荧光乳胶标记的胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和鼠抗兔IgG涂覆于结合垫上，将胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和兔IgG分别包被在层析试纸的检测线1、检测线2和控制线上；
(3)样品稀释液制备：样品稀释液为含有牛血清白蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和防腐剂的缓冲液；
(4)样品检测：将血清样品与样品稀释液混合均匀后，滴加至样品垫上进行免疫层析反应，随后在荧光检测仪下进行荧光检测。
所述步骤(1)中，底板的厚度为0.2-0.5mm，长度为5-7cm，宽度为2-4mm。
所述步骤(1)中，检测线II位于检测线I和控制线之间。
所述步骤(2)中，荧光乳胶标记的胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、荧光乳胶标记的胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和鼠抗兔IgG的浓度均为0.4mg/ml，将胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和兔IgG的浓度均为0.8mg/ml。
所述步骤(3)中，缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种，表面活性剂为吐温20、曲拉通X-100、聚乙二醇中的一种，所述防腐剂为叠氮钠或proclin，蛋白保护剂为甘露醇或甘氨酸。
所述步骤(3)中，缓冲液为PBS缓冲液，表面活性剂为Tween-20，所述防腐剂为叠氮钠，蛋白保护剂为甘氨酸。
本发明具有有益效果：胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ的联合检测试剂盒用于检测血清或者血浆中的胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ的含量，具有简便、快速的优势，避免了X-射线对人体的侵害和胃镜的不便，同时本发明灵敏度比较高，相关性良好。
附图说明
图1为免疫层析试纸条的示意图；
图2为实施例1检测不同浓度样品的标准曲线图；
图3为实施例2检测不同浓度样品的标准曲线图；
图中：1-样品垫，2-结合垫，3-反应膜，4-吸水垫，5-底板，6-检测线I，7-检测线II，8-控制线。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的联合检测方法，包括如下步骤：
(1)免疫层析试纸条组装：将样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫依次搭接并粘贴固定在底板上，底板的厚度为0.2mm，长度为7cm，宽度为4mm，在控制线和结合垫之间还设置有检测线I、检测线II，检测线II位于检测线I和控制线之间，
(2)抗体包被：将浓度为0.4mg/ml的荧光乳胶标记的胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、浓度为0.4mg/ml的荧光乳胶标记的胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和浓度为0.4mg/ml的鼠抗兔IgG涂覆于结合垫上，将浓度为0.8mg/ml的胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、浓度为0.8mg/ml的胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和浓度为0.8mg/ml的兔IgG分别包被在层析试纸的检测线1、检测线2和控制线上；
(3)样品稀释液制备：取1L，将9ml Tween-20，15g甘氨酸，6.1g牛血清白蛋白，0.19g叠氮钠加入到PBS缓冲液中(0.05M pH7.5)，定容至1L，超声直至固体全部溶解，混匀。
(4)样品检测：将血清样品与样品稀释液混合均匀后，滴加至样品垫上进行免疫层析反应，随后在荧光检测仪下进行荧光检测。
实施例2
胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的联合检测方法，包括如下步骤：
(1)免疫层析试纸条组装：将样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫依次搭接并粘贴固定在底板上，底板的厚度为0.3mm，长度为6cm，宽度为4mm，在控制线和结合垫之间还设置有检测线I、检测线II，检测线II位于检测线I和控制线之间，
(2)抗体包被：将浓度为0.4mg/ml的荧光乳胶标记的胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、浓度为0.4mg/ml的荧光乳胶标记的胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和浓度为0.4mg/ml的鼠抗兔IgG涂覆于结合垫上，将浓度为0.8mg/ml的胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、浓度为0.8mg/ml的胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和浓度为0.8mg/ml的兔IgG分别包被在层析试纸的检测线1、检测线2和控制线上；
(3)样品稀释液制备：取1L，将9ml Tween-20，10g甘露醇，6.1g牛血清白蛋白，0.19g叠氮钠加入到PBS缓冲液中(0.05M pH7.5)，定容至1L，超声直至固体全部溶解，混匀。
(4)样品检测：将血清样品与样品稀释液混合均匀后，滴加至样品垫上进行免疫层析反应，随后在荧光检测仪下进行荧光检测。
实施例3
本发明还包括荧光胶乳标记的胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体的制备方法：
将2％BSA加入pH值为7.5的0.05MPBS溶液，4℃保存，制备成标记洗涤液；将50mg/mlEDC溶液加入pH值为7.5的0.05MPBS溶液缓冲液中，制备成胶乳交联剂。将1％BSA，0.5％脱脂奶，0.05％NaN3、0.1％的Tween-20和pH值为7.5的0.01MPBS溶液混合均匀，制备成胶乳保存液；按每10毫升荧光胶乳中加入1毫升胶乳交联剂，室温反应1小时后，离心15min，用0.05MPBS反复离心3次，得到活化的荧光胶乳；按每毫升活化的荧光胶乳加入0.4mg的胃蛋白酶原I单克隆抗体，混合后，室温搅拌反应2～4h，离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次弃去上清，将沉淀用相同荧光胶乳体积的胶乳保存液溶解，置于4℃备用，得到荧光胶乳标记的胃蛋白酶原I单克隆抗体。
本发明还包括荧光胶乳标记的胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体的制备方法：
将2％BSA加入pH值为7.5的0.05MPBS溶液，4℃保存，制备成标记洗涤液；将50mg/mlEDC溶液加入pH值为7.5的0.05MPBS溶液缓冲液中，制备成胶乳交联剂。将1％BSA，0.5％脱脂奶，0.05％NaN3、0.1％的Tween-20和pH值为7.5的0.01MPBS溶液混合均匀，制备成胶乳保存液；按每10毫升荧光胶乳中加入1毫升胶乳交联剂，室温反应1小时后，离心15min，用0.05MPBS反复离心3次，得到活化的荧光胶乳；按每毫升活化的荧光胶乳加入0.4mg的胃蛋白酶原II单克隆抗体，混合后，室温搅拌反应2～4h，离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次弃去上清，将沉淀用相同荧光胶乳体积的胶乳保存液溶解，置于4℃备用，得到荧光胶乳标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体。
本发明还包括荧光胶乳标记的鼠抗兔IgG单克隆抗体的制备方法：
将2％BSA加入pH值为7.5的0.05MPBS溶液，4℃保存，制备成标记洗涤液；将50mg/mlEDC溶液加入pH值为7.5的0.05MPBS溶液缓冲液中，制备成胶乳交联剂。将1％BSA，0.5％脱脂奶粉，0.05％NaN3、0.1％的Tween-20和pH值为7.5的0.01MPBS溶液混合均匀，制备成胶乳保存液；按每10毫升荧光胶乳中加入1毫升胶乳交联剂，室温反应1小时后，离心15min，用0.05MPBS反复离心3次，得到活化的荧光胶乳；将活化的荧光胶乳恢复原始体积，按每毫升荧光胶乳加入0.2mg的抗兔IgG单克隆抗体，混合后，室温搅拌反应2～4h，离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次弃去上清，将沉淀用相同荧光胶乳体积的胶乳保存液溶解，置于4℃备用，得到荧光胶乳标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体。
实施例4
本发明中实施例1和2的检测结果如下：
1)检测灵敏度：
以胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ抗原为待测样品来分别检测实施例1和实施例2的灵敏度。
将胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ抗原分别用含5％小牛血清的pH为7.4的0.05M PBS缓冲液分别配制成系列浓度(0、1、5、10、50、100、500ng/mL)，分别加入样品垫中，并采用荧光检测仪检测荧光强度。检测步骤：检测前先将待检测样品恢复室温(25℃)，用精确移液器取待检测样品100μl垂直缓慢滴入样品垫中，10分钟后用荧光检测仪进行测试。
检测结果如表1和表2所示，从检测结果中可以得出实施例1的检测胃蛋白酶原Ⅰ抗原的灵敏度为0.5ng/mL，检测胃蛋白酶原Ⅱ抗原的灵敏度为0.5ng/mL。根据检测值与浓度所作校准曲线，检测胃蛋白酶原Ⅰ抗原的相关系数R2＝0.991，线性范围为0-500ng/mL；检测胃蛋白酶原Ⅱ抗原的相关系数R2＝0.9881，线性范围为0-500ng/mL。实施例1胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ检测值与浓度的标准曲线如图2所示。从检测结果中可以得出实施例2的检测胃蛋白酶原Ⅰ抗原的灵敏度为0.5ng/mL，检测胃蛋白酶原Ⅱ抗原的灵敏度为0.5ng/mL。根据检测值与浓度所作校准曲线，检测胃蛋白酶原Ⅰ抗原的相关系数R2＝0.9854，线性范围为0-500ng/mL，检测胃蛋白酶原Ⅱ抗原的相关系数R2＝0.9928，线性范围为0-500ng/mL。实施例1胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ检测值与浓度的标准曲线如图3所示。
表1实施例1不同浓度样品的荧光强度比值
表2实施例2不同浓度样品的荧光强度比值
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的联合检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)免疫层析试纸条组装：将样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫依次搭接并粘贴固定在底板上，反应膜上远离结合垫的一端设置有控制线，在控制线和结合垫之间还设置有检测线I、检测线II；
(2)抗体包被：将荧光乳胶标记的胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、荧光乳胶标记的胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和鼠抗兔IgG涂覆于结合垫上，将胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和兔IgG分别包被在层析试纸的检测线1、检测线2和控制线上；
(3)样品稀释液制备：样品稀释液为含有牛血清白蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和防腐剂的缓冲液；
(4)样品检测：将血清样品与样品稀释液混合均匀后，滴加至样品垫上进行免疫层析反应，随后在荧光检测仪下进行荧光检测。
2.如权利要求1所述的胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的联合检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，底板的厚度为0.2-0.5mm，长度为5-7cm，宽度为2-4mm。
3.如权利要求1所述的胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的联合检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，检测线II位于检测线I和控制线之间。
4.如权利要求1所述的胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的联合检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，荧光乳胶标记的胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、荧光乳胶标记的胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和鼠抗兔IgG的浓度均为0.4mg/ml，将胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和兔IgG的浓度均为0.8mg/ml。
5.如权利要求1所述的胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的联合检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种，表面活性剂为吐温20、曲拉通X-100、聚乙二醇中的一种，所述防腐剂为叠氮钠或proclin，蛋白保护剂为甘露醇或甘氨酸。
6.如权利要求1所述的胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的联合检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，缓冲液为PBS缓冲液，表面活性剂为Tween-20，所述防腐剂为叠氮钠，蛋白保护剂为甘氨酸。
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