CN112255403A - 一种胃蛋白酶原i和胃蛋白酶原ii联合定量检测试纸的制备方法及其检测方法 - Google Patents

一种胃蛋白酶原i和胃蛋白酶原ii联合定量检测试纸的制备方法及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测试纸的制备方法及其检测方法，包括以下步骤：步骤一：制备羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点：a.制备InP量子点溶液；b.配制巯基乙酸修饰镉盐前体溶液；c.制备羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点溶液；步骤二：制备样品垫；步骤三：制备标记垫：a.活化量子点溶液；b.制备复合抗体量子点标记液；c.制备标记垫：将标记液直接喷涂于玻璃纤维素膜上，喷膜浓度为2.5μl/cm，于37℃烘干，得到标记垫；步骤四：制备抗体包被的划线NC膜；步骤五：组装检测试纸。本发明首次利用羧基修饰量子点标记抗体，量子点表面大量的羧基与抗体中氨基反应，通过肽键的形式使二者稳定连接，最大限度地带动标记量，提高其灵敏度。

Description

一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测试纸的制备 方法及其检测方法
技术领域
本发明属于量子点免疫层析检测技术领域，具体涉及一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测试纸的制备方法及其检测方法。
背景技术
胃蛋白酶原始胃液中胃蛋白酶的无活性前体，由胃体的主细胞和黏液细胞分泌，大部分分泌到胃腔，少量可在血液中被检测到。根据其生化性质和免疫原性将其分成2个亚群，1-5组分的免疫原性相同，称为胃蛋白酶原I，主要由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；组分6和7被称为胃蛋白酶原II，除由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌外，贲门腺和胃窦的幽门腺的黏液颈细胞以及十二指肠上段也能产生胃蛋白酶原II。血清和血浆中胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II比值的降低与胃体萎缩的严重程度呈正相关，中、重度萎缩性胃炎时，其比值为＜0.3，其胃癌的发病率显著增加，因此，联合测定胃蛋白酶原I核胃蛋白酶原II比值可起到早期胃癌风险提示的作用，通过其血清测量值的不同，在各胃部疾病中均有不同程度的改变，为临床提供可靠的诊断价值。
目前临床胃部疾病及胃癌的检测方法主要包括内窥镜、B超、X线检测、肿瘤标志物等。X线作为传统的胃癌检测手段，对进展期胃癌或弥散型胃癌更有诊断价值，但此法存在射线暴露，检查费用较高等问题，而且对早期胃癌的判定显得无能为力；内窥镜费用较高，对操作人员的技术要求高，而且下胃镜又令患者很痛苦，结果使不少患者望而却步，对亚临床症状患者尚不能作为普查手段；与胃癌有关的肿瘤标志物对于普通胃病及早期胃癌的诊断价值不大。目前已建立多种检测方法，如酶联免疫法、化学发光法、免疫比浊法等，酶联免疫吸附法检测精确，能准确定量，具有很高的敏感性，但是检测样品需要加样、温浴、洗涤、显色、终止等步骤，操作程序繁琐，耗时长，样品从处理到得到结论需要至少40分钟，不适合大规模的体检筛查，样品检测需要洗板机和酶标仪，携带不便，因而不能在病人家庭或急救车上进行检测，另外其敏感性、特异性不够高，对低浓度样品检测的准确度不高。而化学发光免疫测定，虽然精确度高，检测速度快，但检测需要昂贵的化学发光免疫分析仪，要求特定的分析室，且其试剂成本也较高,无法广泛用于较基层的意愿和医疗机构中。相比其他胃部检测手段,血清PGI/PGII联合检测具有无创伤、简便、可靠和费用低廉等优点，荧光免疫层析法相比酶联免疫吸附法和化学发光免疫测定，检测灵敏度高、准确度高、操作简便、成本低，因而具有更大的产业价值。
量子点(简称QDs，又称半导体纳米粒子)是由II～VI族或III～V族元素组成的，半径小于或接近于激光波尔半径，能够接受激发光产生荧光的一类半导体纳米颗粒，其中研究较多的主要是CdX(x＝S、Se、Te)，直径约为2nm～6nm，存在显著的量子尺寸效应和表面效应，荧光强度高，激发光谱宽，发射光谱较窄且呈对称分布使得量子点可以用于多种组分的多色标记，实现多组份同步检测，但现有技术，主要通过将量子点或量子点与高聚物的复合物和抗体直接混合，进行标记，标记稳定性差，抗体有效标记量低，致使量子点荧光标记的精密度有待进一步提高。如申请号为CN201610327064.1的专利，公开一种胃功能检测用免疫层析试剂盒及其制备方法，利用量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液标记胃蛋白酶原I抗体。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测试纸的制备方法及其检测方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：制备羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点：
a.制备InP量子点溶液：在氮气气氛下，将InCl3加入十二烷胺溶剂中，加热至180～200℃，通入PH3，反应0.5h后，冷却至常温，丙酮清洗3次，70℃真空干燥6h，得到InP量子点固体粉末，并加入正己烷和乙醇的等体积比混合液中，超声分散10min，得到InP量子点溶液；InCl3、PH3、十二烷胺、正己烷和乙醇的等体积比混合液的用量比为5mmol：(12～18)mmol：45mL：10mL；
b.配制巯基乙酸修饰镉盐前体溶液：将CdCl2、巯基乙酸溶解于去离子水中，控制Cd2+、巯基乙酸、去离子水的用量比为3mmol：8～10mmol：10mL，得硫源修饰镉盐前体溶液；
c.制备羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点溶液：将巯基乙酸修饰镉盐前体溶液分五次加入InP量子点溶液中，期间不断搅拌，再加入氧化石墨烯，控制前体溶液、InP量子点溶液、氧化石墨烯的用量比为10mL：10mL：(0.1～0.15)g，并超声分散0.5h，用NaOH调节pH值为10，在紫外灯辐射下，搅拌反应1～3h，再加入一氯乙酸调节pH值为6.0，继续搅拌反应1～3h，制得羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点溶液；
步骤二：制备样品垫：配制0.05M Tris-HCL缓冲液并调节pH为8.2，加入1％的表面活性剂吐温20及0.2％酪蛋白钠，充分混匀溶解后将玻璃纤维素膜浸泡其中，待完全浸泡充分后于37℃烘干，得到样品垫；
步骤三：制备标记垫：
a.活化量子点溶液：取100uL羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点溶液分散于900uL的10mM、pH＝6.0MES缓冲液中，加入100uL的10mM偶联剂EDC，搅拌均匀后，37℃反应15min，以15000r/min转速离心20min，弃上清，用1.0mL的10mM pH＝6.0MES缓冲液重悬，超声辅助混匀，得到活化量子点溶液；
b.制备复合抗体量子点标记液：分别量取三组300μL活化量子点溶液，各加入10μg胃蛋白酶原I标记抗体或胃蛋白酶原II标记抗体或鸡IgY抗体中的一种，迅速混匀，37℃反应2h，再加入50μL封闭剂溶液，搅拌均匀，37℃反应1h，以15000r/min转速离心40min，弃上清，即得胃蛋白酶原I抗体/胃蛋白酶原II抗体/鸡IgY抗体标记复合物沉淀；并将所得三种标记沉淀混合均匀，再用处理液复溶至80μl，超声辅助混匀，得到复合抗体量子点标记液；
所述处理液配方为：pH＝7.20.02M PB缓冲液+1％(w/v)BSA+5％(w/v)海藻糖；
c.制备标记垫：将标记液直接喷涂于玻璃纤维素膜上，喷膜浓度为2.5μl/cm，于37℃烘干，得到标记垫；
步骤四：制备抗体包被的划线NC膜：以硝酸纤维素膜作为NC膜，在NC膜上依次等间隔划分出检测线T2、T1及质控线C，并用1.0mg/mL胃蛋白酶原I抗体涂覆包被T1线，1.0mg/mL胃蛋白酶原II抗体涂覆包被T2线，0.5mg/mL鸡IgY抗体涂覆包被C线，涂覆用量均为1μL/cm，于37℃烘干后，即得抗体包被的划线NC膜；
步骤五：组装检测试纸：将样品垫(2)、标记垫(3)、抗体包被的划线NC膜(4)、吸收垫(5)依次粘附在底板(1)上，且NC膜上的T2线与标记垫(3)相邻，并切条制成检测试纸。
优选的是，所述紫外灯辐射功率为60～100W。
优选的是，所述封闭剂溶液配方为150mmol/L甘氨酸+5％(w/v)BSA。
优选的是，所述检测试纸宽度为3.2～4.6mm，长度为5.0～7.0cm。
一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测方法：将血清样品直接滴加至所述检测试纸中样品垫上，进行免疫层析反应，并在荧光检测仪下进行检测读数。
本发明的有益效果：
1、本发明首次利用羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点标记胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体、鸡IgY抗体，量子点表面大量的羧基与抗体中氨基反应，通过肽键的形式使量子点与抗体稳定连接，最大限度地带动标记量，减少抗体用量，节约成本，提高其灵敏度，适用范围广。
2、本发明首次以羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点代替传统CdTe/ZnSe量子点或碳量子点，激发光谱宽，金属量子点和非金属量子点的组合，有效扩大激发光谱范围，并减小发射光谱范围，可将微弱的吸光度信号有效转化为荧光信号，检测灵敏度高，精确度高。
3、本发明方法不仅解决了一次取样同时诊断的技术问题，还能够同时定量检测胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II两个指标的具体浓度值，方便医生操作，一次取样，一次加样，即可检测两个指标，还能够根据PGI/PGII的比值多少判断胃部疾病中不同程度的改变，降低了患者痛苦及取样风险，避免了复杂的操作。
4、本发明质控线采用单独质控体系，降低了CV值，提高了其精密度。
5、本发明利用封闭剂进行封闭，也防止或减少非特异性吸附反应。
6、本发明利用双抗体夹心法免疫层析技术，实现血清中胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II的定量检测，具有简便快速、检测效率高的优势。
附图说明
图1为本发明胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测试纸的制备方法流程图；
图2为本发明胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测试纸的结构示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例一
一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：制备羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点：
a.制备InP量子点溶液：在氮气气氛下，将5mmol InCl3加入45mL十二烷胺溶剂中，加热至200℃，通入15mmol PH3，反应0.5h后，冷却至常温，丙酮清洗3次，70℃真空干燥6h，得到InP量子点固体粉末，并加入10mL正己烷和乙醇的等体积比混合液中，超声分散10min，得到InP量子点溶液；
b.配制巯基乙酸修饰镉盐前体溶液：将3mmol CdCl2、10mmol巯基乙酸溶解于10mL去离子水中，得硫源修饰镉盐前体溶液；
c.制备羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点溶液：将10mL巯基乙酸修饰镉盐前体溶液分五次加入10mL InP量子点溶液中，期间不断搅拌，再加入0.15g氧化石墨烯，并超声分散0.5h，用NaOH调节pH值为10，在功率为80W紫外灯辐射下，搅拌反应3h，再加入一氯乙酸调节pH值为6.0，继续搅拌反应3h，制得羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点溶液；
步骤二：制备样品垫：配制0.05M Tris-HCL缓冲液并调节pH为8.2，加入1％的表面活性剂吐温20及0.2％酪蛋白钠，充分混匀溶解后将玻璃纤维素膜浸泡其中，待完全浸泡充分后于37℃烘干，得到样品垫；
步骤三：制备标记垫：
a.活化量子点溶液：取100uL羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点溶液分散于900uL的10mM、pH＝6.0MES缓冲液中，加入100uL的10mM偶联剂EDC，搅拌均匀后，37℃反应15min，以15000r/min转速离心20min，弃上清，用1.0mL的10mM pH＝6.0MES缓冲液重悬，超声辅助混匀，得到活化量子点溶液；
b.制备复合抗体量子点标记液：分别量取三组300μL活化量子点溶液，各加入10μg胃蛋白酶原I标记抗体或胃蛋白酶原II标记抗体或鸡IgY抗体中的一种，迅速混匀，37℃反应2h，再加入50μL封闭剂溶液，搅拌均匀，37℃反应1h，以15000r/min转速离心40min，弃上清，即得胃蛋白酶原I抗体/胃蛋白酶原II抗体/鸡IgY抗体标记复合物沉淀；并将所得三种标记沉淀混合均匀，再用处理液复溶至80μl，超声辅助混匀，得到复合抗体量子点标记液；
所述处理液配方为：pH＝7.20.02M PB缓冲液+1％(w/v)BSA+5％(w/v)海藻糖；
c.制备标记垫：将标记液直接喷涂于玻璃纤维素膜上，喷膜浓度为2.5μl/cm，于37℃烘干，得到标记垫；
步骤四：制备抗体包被的划线NC膜：以硝酸纤维素膜作为NC膜，在NC膜上依次等间隔划分出检测线T2、T1及质控线C，并用1.0mg/mL胃蛋白酶原I抗体涂覆包被T1线，1.0mg/mL胃蛋白酶原II抗体涂覆包被T2线，0.5mg/mL鸡IgY抗体涂覆包被C线，涂覆用量均为1μL/cm，于37℃烘干后，即得抗体包被的划线NC膜；
步骤五：组装检测试纸：将样品垫2、标记垫3、抗体包被的划线NC膜4、吸收垫5依次粘附在底板1上，且NC膜上的T2线与标记垫3相邻，并切条制成宽度为4.0mm、长度为6.0cm检测试纸。
实施例2
一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测方法：将80μL血清样品直接滴加至实施例1制出的检测试纸中样品垫上，进行免疫层析反应，并在荧光检测仪下进行检测读数。
检测原理：测试时，样本滴入检测试纸后，样本中的胃蛋白酶原I与预先包被在NC膜上的羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点标记胃蛋白酶原I单克隆抗体结合，样本中的胃蛋白酶原II与预先包被在玻璃纤维膜上的羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点标记胃蛋白酶原II单克隆抗体结合，结合物在毛细效应下向上层析，随后胃蛋白酶原I结合物会被固定在膜上相应测试区(T1)的胃蛋白酶原I单克隆抗体结合捕获，胃蛋白酶原II结合物会被固定在膜上相应测试区(T2)的胃蛋白酶原II单克隆抗体结合捕获，样本中的胃蛋白酶原I越多，T1检测线上积聚的结合物越多，信号强度反应了被捕获的胃蛋白酶原I含量；样本中的胃蛋白酶原II越多，T2检测线上积聚的结合物越多，信号强度反应了被捕获的胃蛋白酶原II含量。
对比例1：与实施例1相同，区别在于：以7.5mg/mL石墨烯量子点溶液代替羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点溶液。
对比例2：与实施例1相同，区别在于：在步骤一量子点制备过程中不添加氧化石墨烯和一氯乙酸。
对比例3：与实施例1相同，区别在于：以1.5mmol/mL CdTe+2.5mmol/mL ZnSe量子点溶液代替羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点溶液。
分别选取3种不同浓度的胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ质控液，胃蛋白酶原Ⅰ质控液浓度设置为2.5ng/mL、80ng/mL、200ng/mL，胃蛋白酶原Ⅱ质控液浓度设置为2ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，利用实施例1及对比例1～3方法制出的同一批检测试纸按照实施例2所述的方法重复测量10次，根据10次的结果计算批内平均偏差CV％值。试验结果如表1所示：
胃蛋白酶原I检测范围在2.5到200ng/ml，胃蛋白酶原II在2到100ng/ml
表1：
Figure BDA0002726315170000051
按照实施例1及对比例1～3方法在相同生产环境下制备的3批检测试剂，分别选取3份不同浓度的样本，胃蛋白酶原Ⅰ质控液浓度设置为2.5ng/mL、80ng/mL、200ng/mL，胃蛋白酶原Ⅱ质控液浓度设置为2ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，每个批号分别重复测量10次，根据结果计算批间平均偏差CV％值。其检测结果如下表2所示。检测结果如下表2所示：
表2：
Figure BDA0002726315170000052
由表1和表2知，本发明首次以羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点代替传统CdTe/ZnSe量子点或碳量子点，金属量子点和非金属量子点的组合，有效扩大激发光谱范围，并减小发射光谱范围，可将微弱的吸光度信号有效转化为荧光信号，检测灵敏度高，精确度高。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (5)

1.一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：制备羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点：
a.制备InP量子点溶液：在氮气气氛下，将InCl3加入十二烷胺溶剂中，加热至180～200℃，通入PH3，反应0.5h后，冷却至常温，丙酮清洗3次，70℃真空干燥6h，得到InP量子点固体粉末，并加入正己烷和乙醇的等体积比混合液中，超声分散10min，得到InP量子点溶液；InCl3、PH3、十二烷胺、正己烷和乙醇的等体积比混合液的用量比为5mmol：(12～18)mmol：45mL：10mL；
b.配制巯基乙酸修饰镉盐前体溶液：将CdCl2、巯基乙酸溶解于去离子水中，控制Cd2+、巯基乙酸、去离子水的用量比为3mmol：8～10mmol：10mL，得硫源修饰镉盐前体溶液；
c.制备羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点溶液：将巯基乙酸修饰镉盐前体溶液分五次加入InP量子点溶液中，期间不断搅拌，再加入氧化石墨烯，控制前体溶液、InP量子点溶液、氧化石墨烯的用量比为10mL：10mL：(0.1～0.15)g，并超声分散0.5h，用NaOH调节pH值为10，在紫外灯辐射下，搅拌反应1～3h，再加入一氯乙酸调节pH值为6.0，继续搅拌反应1～3h，制得羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点溶液；
步骤二：制备样品垫：配制0.05M Tris-HCL缓冲液并调节pH为8.2，加入1％的表面活性剂吐温20及0.2％酪蛋白钠，充分混匀溶解后将玻璃纤维素膜浸泡其中，待完全浸泡充分后于37℃烘干，得到样品垫；
步骤三：制备标记垫：
a.活化量子点溶液：取100uL羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点溶液分散于900uL的10mM、pH＝6.0MES缓冲液中，加入100uL的10mM偶联剂EDC，搅拌均匀后，37℃反应15min，以15000r/min转速离心20min，弃上清，用1.0mL的10mM pH＝6.0MES缓冲液重悬，超声辅助混匀，得到活化量子点溶液；
b.制备复合抗体量子点标记液：分别量取三组300μL活化量子点溶液，各加入10μg胃蛋白酶原I标记抗体或胃蛋白酶原II标记抗体或鸡IgY抗体中的一种，迅速混匀，37℃反应2h，再加入50μL封闭剂溶液，搅拌均匀，37℃反应1h，以15000r/min转速离心40min，弃上清，即得胃蛋白酶原I抗体/胃蛋白酶原II抗体/鸡IgY抗体标记复合物沉淀；并将所得三种标记沉淀混合均匀，再用处理液复溶至80μl，超声辅助混匀，得到复合抗体量子点标记液；
所述处理液配方为：pH＝7.2、0.02M PB缓冲液+1％(w/v)BSA+5％(w/v)海藻糖；
c.制备标记垫：将标记液直接喷涂于玻璃纤维素膜上，喷膜浓度为2.5μl/cm，于37℃烘干，得到标记垫；
步骤四：制备抗体包被的划线NC膜：以硝酸纤维素膜作为NC膜，在NC膜上依次等间隔划分出检测线T2、T1及质控线C，并用1.0mg/mL胃蛋白酶原I抗体涂覆包被T1线，1.0mg/mL胃蛋白酶原II抗体涂覆包被T2线，0.5mg/mL鸡IgY抗体涂覆包被C线，涂覆用量均为1μL/cm，于37℃烘干后，即得抗体包被的划线NC膜；
步骤五：组装检测试纸：将样品垫、标记垫、抗体包被的划线NC膜、吸收垫依次粘附在底板上，且NC膜上的T2线与标记垫相邻，并切条制成检测试纸。
2.根据权利要求1所述一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测试纸的制备方法，其特征在于，所述紫外灯辐射功率为60～100W。
3.根据权利要求1所述一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测试纸的制备方法，其特征在于，所述封闭剂溶液配方为：150mM甘氨酸+5％(w/v)BSA。
4.根据权利要求1所述一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测试纸的制备方法，其特征在于，所述检测试纸宽度为3.2～4.6mm，长度为5.0～7.0cm。
5.一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测方法，其特征在于：将血清样品直接滴加至权利要求1～4任一项所述检测试纸中样品垫上，进行免疫层析反应，并在荧光检测仪下进行检测读数。
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