CN111044735A - 一种测定促卵泡激素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物检测方法的技术领域，具体涉及一种测定促卵泡激素的方法，包括以下步骤：(1)制作微流控芯片；(2)将水凝胶与捕获抗体混合后固化在微流控芯片内；(3)加入检测样本并孵育,使检测样本中的FSH与捕获抗体结合；(4)加入被染色的检测抗体并孵育，使染色后的检测抗体与FSH‑抗体结合物结合发出荧光；(5)对检测后的水凝胶进行拍照，并分析拍摄的图片的荧光强度，计算检测样品中促卵泡激素的含量。本发明的测定促卵泡激素的方法，通过微流控技术与ELISA的结合，产生了新型检测方式，所需样品量少，实现了对于检测样品中FSH含量的一步、快速定量检测。

Description

一种测定促卵泡激素的方法
技术领域
本发明涉及生物检测方法的技术领域，具体涉及一种测定促卵泡激素的方法。
背景技术
促卵泡激素(FSH)是由脑垂体前叶释放的促性腺激素。它通过刺激生殖细胞成熟和刺激卵泡生长，在女性生殖发育和体内平衡中起着关键作用。血液或血清中FSH浓度是下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)功能优劣的重要指标，其适用于哺乳动物青春期和发情期的阶段，以及人类月经周期的阶段。在每个发情期，循环血液中FSH的浓度会在很短的时间内发生剧烈的变化。对于此类事件中FSH浓度的快速监测，非常需要一种快速、可靠、灵敏且样品消耗量小的现场测量方法。
目前，血/血清中FSH(FSH)的浓度最常用放射免疫分析法(RIA)进行定量。RIA中使用的抗体是为竞争性免疫测定设计的，因此具有良好的特异性。这种方法被认为是定量血清中FSH浓度的金标准。然而,RIA测定FSH浓度也有一些不足：如灵敏度相对较低,大型测量的不确定性,较小的校测范围(2-60ng/mL),单个样品需要60μL的量。更重要的是，整个实验需要几天的时间来完成。在测量过程中，静脉血清需要被高倍稀释。这个操作可能会导致一些样本超出其测量范围。酶联免疫吸附试验(ELISA)，特别是夹心ELISA，为FSH的定量分析提供了一种新的方法。夹心ELISA由于使用了抗体对，对靶抗原的特异性较高。这项技术确实提高了FSH检测的效率(从2天到5小时)。然而，目前仍没有可靠的商用ELISA试剂盒可用于FSH检测(大多数商用试剂盒无法产生与金标准RIA方法相媲美的结果)。ELISA使用传统的96孔板患有其他技术的缺点,比如大样本/试剂消耗(100μL)和试验时间相对较长(5小时)。此外，目前ELISA检测所需的抗体仅在硅、玻璃或聚合物基材上的表面。对于低浓度的FSH检测，仅表面结合不能产生检测所需的信号。同时，ELISA检测需要专门的光谱仪来进行吸光度测量，该仪器价格较为昂贵，带来较大的检测成本。研究新的快速且灵敏的FSH检测方式迫在眉睫。
水凝胶是一种生物相容性高且可降解的新型材料，能够形成三维交联。在免疫测定中，它有助于抗原抗体在三维生物相容性基质中结合，增加测定的敏感性。微流控技术可以将复杂的化学反应及物理变化过程集成在一个小芯片上，形成“芯片实验室”，其具有体积小、成本低、试剂消耗量少等优点，已经在生化检测等方面展现出优异的性能，具有广泛的应用前景。同时，由于其便捷性，图像分析技术被广泛应用于科学研究中。
Image-Pro Plus是顶级的图像分析软件包，它适合于荧光成像、质量控制、材料成像及其它的多项科研、医学与工业应用。因此，它也可应用于结合微流控技术的FSH检测中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定促卵泡激素的方法，通过微流控技术与ELISA的结合，产生了新型检测方式，所需样品量少，实现了对于检测样品中FSH含量的一步、快速定量检测。
本发明实现目的所采用的方案是：一种测定促卵泡激素的方法，包括以下步骤：
(1)制作微流控芯片；
(2)将水凝胶与捕获抗体混合后固化在微流控芯片内；
(3)加入检测样本并孵育,使检测样本中的FSH与捕获抗体结合；
(4)加入被染色的检测抗体并孵育，使染色后的检测抗体与FSH-抗体结合物结合发出荧光；
(5)对检测后的水凝胶进行拍照，并分析拍摄的图片的荧光强度，计算检测样品中促卵泡激素的含量。
优选地，所述步骤(1)中，微流控芯片包括反应部及与反应部连通的三个入口流道和出口流道；所述步骤(2)中，将水凝胶与捕获抗体混合后并固化在所述反应部；所述步骤(3)和(4)中，分别通过不同的入口流道将检测样本和被染色的检测抗体注入反应部。
优选地，所述三个入口流道汇流后再通过多个入口支路与所述反应部连通。
优选地，所述入口流道的宽度为150-200μm，高度为80-100μm；所述反应部为圆形腔体，圆形腔体的半径为450-500μm，高度为80-100μm。出口流道的宽度为150-200μm，高度为80-100μm。
优选地，所述步骤(2)中，水凝胶为质量百分数为10％-30％的GelMA水凝胶，将捕获抗体溶液与水凝胶以1:8-10的体积比混合均匀，然后进行紫外光固化，再用PBS缓冲液进行冲洗；捕获抗体溶液中捕获抗体的浓度为2-5mg/L。
GelMA水凝胶的配比方法为将7-9mlPBS缓冲液加入装有LAP引发剂的棕色瓶中，并将其放入60℃水浴中溶解30min,然后取1-3g的GelMA材料于上述棕色瓶中，于60℃水中避光溶解30min。
优选地，所述步骤(3)中，检测样本为血液或者血清样本，在22-25℃、45-50rmp下孵育至检测样本中的FSH与捕获抗体结合，再用PBS缓冲液进行冲洗。本发明中，检测样本的使用量为10μL。
优选地，所述步骤(4)中，检测抗体采用DY647P4染料进行染色，检测抗体与DY647P4染料的摩尔比为25-28:1，然后使用1mol/L的碳酸氢钠将混合物的pH调至9.0，在22-25℃、45-50rmp下孵育至染料与检测抗体结合，再用PBS缓冲液进行冲洗。
优选地，所述步骤(4)中，在22-25℃、45-50rmp下孵育至染色后的检测抗体与FSH-抗体结合物结合发出荧光，再用PBS缓冲液进行冲洗。
优选地，所述步骤(5)中，采用Image-Pro Plus对拍摄的图片进行荧光强度的分析，与标准荧光强度/含量曲线做对比，计算检测样品中促卵泡激素的含量。
本发明具有以下优点和有益效果：
本发明的测定促卵泡激素的方法利用基于荧光的三明治免疫分析法测定检测样品中FSH含量，利用微流控技术将一定浓度的捕获抗体包覆在水凝胶中。将检测样品注入到微流控芯片中与捕获抗体结合。然后再加入染色后的检测抗体进行免疫反应，检测抗体会发出荧光，对发出荧光的水凝胶进行拍照，再分析图片中的荧光强度，本发明人通过实验发现其荧光强度与检测样品中FSH的浓度成正比线性关系，通过与荧光强度/浓度的标准曲线进行对比，可以快速计算出检测样品中促卵泡激素的含量。
本发明的测定促卵泡激素的方法，通过微流控技术与ELISA的结合，产生了新型检测方式，所需样品量少，实现了对于检测样品中FSH含量的一步、快速定量检测。
本发明的测定促卵泡激素的方法，通过水凝胶将捕获抗体紧密固定在微流控芯片中，其三维网状结构保证样品能够很好地与捕获抗体结合，大大提高了检测精度。
本发明的测定促卵泡激素的方法，方便易得，可同时进行多个平行样检测，在节省反应时间的同时提高了检测的准确性。
附图说明
图1是本发明实施例1的微流控芯片的结构示意图；
图2是本发明实施例1的反应部的示意图；
图3为本发明实施例2中FSH标准液免疫反应后的荧光图片；
图4为本发明实施例2中标准液中FSH含量与荧光强度之间的标准曲线图；
图5为本发明实施例2中小鼠血清免疫反应后的荧光图片；
图6为本发明对比例中用ELISA试剂盒FSH含量与吸光度之间的标准曲线图。
图中，1、第一入口流道；2、第二入口流道；3、第三入口流道；4、入口支路；5、反应部；6、出口流道；7、废液收集部；8、移液枪。
具体实施方式
为更好的理解本发明，下面的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
如图1和图2所示，为本发明的微流控芯片，包括：第一入口流道1、第二入口流道2、第三入口流道3、多个入口支路4、反应部5、出口流道6和废液收集部7。
可采用移液枪8将检测样本通过第一入口流道1(任意入口流道均可)注入到反应部5中，PBS缓冲液可通过第二入口流道2进入并冲洗反应部5，染色后的检测抗体可通过第三入口流道3第三注入反应部5中，冲洗后产生的废液通过出口流道6流入与之相连的废液收集部7。本实施例中，第一入口流道1、第二入口流道2和第三入口流道3的宽度均为200μm，高度为100μm，出口流道6的宽度为200μm，高度为100μm。
设置多个入口支路4连通反应部5，每一个入口支路4的宽度均为30-50μm，高度均为80-100μm为了保证检测样品能够更大面积的与捕获抗体结合，提高检测精度。反应部5为圆形腔体，半径为500μm，高度为100μm。
具体的，微流控芯片可通过标准的紫外软光刻技术制成。具体制作步骤包括：先根据微流控芯片的结构，使用软件(L-edit)设计成芯片模板图(图3)，制作掩模版；然后通过紫外光刻技术，将图形显影于硅片表面的光刻胶，用作模具；再在模具上浇注未凝固的PDMS，在75℃的温度下热烘1小时，凝固得到半成品；最后经过剥片、切割、钻孔以及等离子火焰粘合看，制得微流控芯片。
实施例2
本实施例中所采用的捕获抗体为Anti-FSH R抗体(Hytext，芬兰)，检测抗体为Anti-h FSH6602SP-5(Medix Biochemica,芬兰)，染料为DY647P4荧光染料(Dyomics，德国)，检测样本为小鼠血清样本。
一种测定促卵泡激素的方法，包括以下步骤：
(1)制作微流控芯片；
(2)将水凝胶与捕获抗体混合后固化在微流控芯片的反应部，并用PBS多次冲洗，去除未固化的原料；
(3)加入10μL检测样本并孵育15min,使检测样本中的FSH与捕获抗体结合，并用PBS多次冲洗，洗除未结合的检测样本；
(4)加入被染色的检测抗体并孵育15min，使染色后的检测抗体与FSH-抗体结合物结合发出荧光，并用PBS进行多次冲洗，洗除未结合检测抗体；
(5)对检测后的水凝胶进行拍照，并分析拍摄的图片的荧光强度，计算检测样品中促卵泡激素的含量。
本实施例中，为了避免干扰，在样品实验前，用Image-Pro Plus记录玻片或微流控芯片背景和水凝胶荧光强度，对水凝胶进行背景信号校正。利用FSH标准液(2mIU/L,5mIU/L,10mIU/L,25mIU/L,50mIU/L)，然后分别执行上述步骤(1)-(5)的操作方法，拍下待检样品免疫反应后的荧光图片(图3)，并分析图片的光强信号，拟画出标准曲线(图4)，其线性关系为y＝15.14x-0.0734。
具体的，反应部的捕获抗体固化需要在PH为7.4的PBS缓冲液下，将捕获抗体与水凝胶以1:10的体积比混合，并以30rmp的转速下搅拌一小时，然后在紫外灯下照射1000ms进行光固化，并用PBS缓冲液进行冲洗，水凝胶为GelMA水凝胶，捕获抗体溶液中捕获抗体的浓度为4mg/L，水凝胶溶液中GelMA水凝胶的质量百分数为10％。
检测抗体(6.2μg/L)用DY647P4染料进行标记(混合比为28:1的摩尔比)。加入1mol/L的碳酸氢钠将PH调至9.0，孵化1小时(30rpm，25℃，30％CO2)。
用Image-Pro Plus记录并分析待检样品小鼠血清免疫反应后的光强信号，其反应后的荧光图片如图5所示，检测其荧光强度约为384mV。通过标准曲线所得的关系式推算得出其浓度为27.37mIU/ml。
对比例
本对比例使用的原料与实施例2中的一样，本对比例采用ELISA试剂盒对小鼠血清样本中的FSH含量进行检测。
检测步骤如下：
(1)取小鼠血清样本；
(2)在酶标包被板上加入浓度分别为9IU/L,6IU/L,3IU/L,1.5IU/L,0.75IU/L的标准液各50μl；
(3)分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余步骤操作相同)、待测样品孔，待测样品孔中加入50μL的样品；
(4)用封板膜封板后置37℃孵育30min；
(5)将30倍浓缩洗涤液用超纯水稀释30倍后备用；
(6)小心揭去封板莫，弃去液体，甩干，没空加满洗涤液，静置30S后倒去，反复5次，拍干；
(7)每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外；
(8)操作同步骤(4)；
(9)操作同步骤(5)；
(10)每孔加先加入显色剂A(50μL)，再加入显色剂B(50μL)。震荡混匀后，37℃避光显色15min；
(11)每孔加入终止液50μL，终止显色反应；
(12)在加入终止液15min内，用空白孔调零，450nm波长依次测量每孔的吸光度。
图6是本对比例中ELISA试剂盒测得的FSH浓度与吸光度的关系图，其线性关系为y＝0.1239x+0.1222，通过ELISA试剂盒测得该小鼠血清中FSH的浓度为25.35mIU/ml。该结果与用本发明方法检测的结果相近，证明本方法可行。表1为用ELISA试剂盒和新方法之间的对比。
表1ELISA试剂盒检测与本发明的方法之间的对比
FSH检测 所需抗体 样品消耗 检测时间
ELISA 100-1000ng ＞50μL 2h
本发明 5-50ng 10μL 30-45min
综上实验结果表明，本发明的检测方法具有结构简单，造价低，可同时进行平行样检测具有较高的检测精度(R2>0.95)和稳定性的优点。
以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种测定促卵泡激素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制作微流控芯片；
(2)将水凝胶与捕获抗体混合后固化在微流控芯片内；
(3)加入检测样本并孵育,使检测样本中的FSH与捕获抗体结合；
(4)加入被染色的检测抗体并孵育，使染色后的检测抗体与FSH-抗体结合物结合发出荧光；
(5)对检测后的水凝胶进行拍照，并分析拍摄的图片的荧光强度，计算检测样品中促卵泡激素的含量。
2.根据权利要求1所述的测定促卵泡激素的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，微流控芯片包括反应部及与反应部连通的三个入口流道和出口流道；所述步骤(2)中，将水凝胶与捕获抗体混合后并固化在所述反应部；所述步骤(3)和(4)中，分别通过不同的入口流道将检测样本和被染色的检测抗体注入反应部。
3.根据权利要求2所述的测定促卵泡激素的方法，其特征在于：所述三个入口流道汇流后再通过多个入口支路与所述反应部连通。
4.根据权利要求2所述的测定促卵泡激素的方法，其特征在于：所述入口流道的宽度为150-200μm，高度为80-100μm；所述反应部为圆形腔体，圆形腔体的半径为450-500μm，高度为80-100μm。
5.根据权利要求1所述的测定促卵泡激素的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，水凝胶为质量百分数为10％-30％的GelMA水凝胶，将捕获抗体溶液与水凝胶以1:8-10的体积比混合均匀，然后进行紫外光固化，再用PBS缓冲液进行冲洗；捕获抗体溶液中捕获抗体的浓度为2-5mg/L。
6.根据权利要求1所述的测定促卵泡激素的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，检测样本为血液或者血清样本，在22-25℃、45-50rmp下孵育至检测样本中的FSH与捕获抗体结合，再用PBS缓冲液进行冲洗。
7.根据权利要求1所述的测定促卵泡激素的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，检测抗体采用DY647P4染料进行染色，检测抗体与DY647P4染料的摩尔比为25-28:1，然后使用1mol/L的碳酸氢钠将混合物的pH调至9.0，在22-25℃、45-50rmp下孵育至染料与检测抗体结合，再用PBS缓冲液进行冲洗。
8.根据权利要求1所述的测定促卵泡激素的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，在22-25℃、45-50rmp下孵育至染色后的检测抗体与FSH-抗体结合物结合发出荧光，再用PBS缓冲液进行冲洗。
9.根据权利要求1所述的测定促卵泡激素的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，采用Image-Pro Plus对拍摄的图片进行荧光强度的分析，与标准荧光强度/含量曲线做对比，计算检测样品中促卵泡激素的含量。
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