CN116223813A - 一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白i的试剂盒及其测定方法 - Google Patents

一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白i的试剂盒及其测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒及其测定方法，包括：样本稀释液、试纸条；所述试纸条由样品垫、结合物垫、NC膜、吸水纸、PVC底板、丝网印刷电极组组成，所述样品垫、结合物垫、NC膜、吸水纸依次设置在PVC底板上；所述NC膜上设有检测T线和质控C线；所述PVC底板上设有凹槽，用于放置丝网印刷电极组，该丝网印刷电极组置于检测T线正下方。本发明采用电化学发光原理进行检测的层析试纸条，不仅拥有层析试纸条所具备的使用简便、检测快速的特点，而且拥有电化学发光免疫分析法所具备的灵敏度高、线性范围宽、准确度高；可通过CCD相机采集发光信号从而进行全血、血清或血浆中心肌肌钙蛋白I含量测定。

Description

一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒及其测 定方法
技术领域
本发明涉及，特别涉及一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒及其测定方法。
背景技术
三联吡啶钌[Ru(bpy)2+3]电化学发光(Electrochemiluminescence，简称ECL)具有原位响应、检测灵敏度高、线性范围宽、信号干扰低等优点，在免疫检测领域得到了广泛应用。与吖啶酯化学发光、鲁米诺/ALP化学发光、ABEI化学发光等化学发光法相比，电化学发光灵敏度更高、重复性更好。
急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)是一种临床常见的心脏疾病，病因是心肌缺血性坏死造成急性冠状动脉闭塞和血流中断。因其较高的致死率和危害性，AMI的准确诊断具有相当重要的临床价值。目前监测AMI的特异性心肌标志物有肌红蛋白(MYO)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌肌钙蛋白I(cTnI)。其中cTnI的心肌特异性最优，且在AMI发生后，心肌组织中的心肌肌钙蛋白I(cTnI)被迅速的释放到血液中并能保持5-10天的时间窗口，因而可作为心脏损伤前筛查，也是AMI诊断最有效的途径之一。通常认为cTnI在血液中的浓度大于0.5ng/mL时出现心肌损伤，AMI患者血液cTnI通常在1-25ng/mL的范围内。
心肌肌钙蛋白I(cTnI)在心肌组织中表达，在胎儿、健康人或疾病状态下的成人骨骼肌中不表达，因而对心肌具有高度特异性。于1994-1995年被美国国家食品与药品管理局(FDA)批准应用于临床急性心肌梗死(AMI)的诊断。肌钙蛋白(Tn)属于调节蛋白，由三个亚单位组成，即肌钙蛋白C(TnC)、肌钙蛋白I(TnI)及肌钙蛋白T(TnT)。TnI是一种碱性蛋白，由209个氨基酸组成，是一个延伸分子，采取反向平行与TnC形成二元复合物。TnC是钙离子受体，参予调节细丝的活化过程。TnT是一种非对称性蛋白质，伴有一球形C端功能区，它有一个与原肌球蛋白结合的位点。cTnI以不同形式存在于心肌细胞中，如以游离形式存在于胞浆内cTnI只占很少部分，大部分与肌钙蛋白T及C亚单位结合以复合体形式存在。当心肌损伤时，外周血中cTnI主要以cTnI-TnC复合物形式居多(90％以上)。cTnI-cTnT复合物仅发现存在于50％以下病人的血中，因此，检测的重要性远不如cTnI-cTnC复合物；其他形式的cTnI(如氧化型、还原型、磷酸化、去磷酸化、蛋白降解形式)较少。当心肌细胞膜的完整性受破坏，cTnI先从胞浆内释放，因此，血清水平很快升高，而结合的cTnI由于相对分子质量大，从心肌细胞结构蛋白缓慢持续的释放。心肌损伤后，外周血中心肌肌钙蛋白I一般在5～8h出现增高，在12～24h达最高值，且高水平往往维持7～10d。
cTnI的测定始于20世纪80年代中期，多采用放射免疫法和ELISA测定法。在20世纪90年代末期，当时的cTnI和cTnT试剂可以检出患者体内ng/mL级的肌钙蛋白。这种灵敏度水平的试剂仅能在缺血症状如胸痛发作3-6小时后可靠地检测到肌钙蛋白。这使得肌钙蛋白只能作为AMI的晚期标志物。而现在超敏肌钙蛋白检测系统的灵敏度可以达到pg/mL，能检出任何形式的心肌损伤，包括发病1-3小时的AMI患者，节省的3小时黄金时间更有利于迅速进行患者管理。超敏肌钙蛋白检测使得肌钙蛋白成为AMI的早期标志物。目前对cTnI的检测多采用化学发光法，用化学发光物质标记抗cTnI抗体大大提高了对cTnI测定的精确性和敏感性。
cTnI测定方法包括放射免疫测定法、酶联免疫吸附(ELISA)法、胶体金法、荧光免疫层析法和化学发光免疫分析法等。常规化学发光免疫分析法检测cTnI需要配套使用较大型设备、检测存在潜在的交叉污染、试剂在液态下的运输和储存稳定性受到很大限制，而且通常集中在检验科使用会导致样本的流转时间延长；胶体金法或荧光免疫层析法等床旁检测cTnI，虽然检测更为简便，但检测灵敏度低、测量范围窄、准确度较差。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒及其测定方法，采用该方法可通过CCD相机采集发光信号从而进行全血、血清或血浆中心肌肌钙蛋白I含量测定。
为了实现上述目的，本发明提供一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒，包括：样本稀释液、试纸条；所述试纸条由样品垫、结合物垫、NC膜、吸水纸、PVC底板、丝网印刷电极组组成，所述样品垫、结合物垫、NC膜、吸水纸依次设置在PVC底板上；所述NC膜上设有检测T线和质控C线；所述PVC底板上设有凹槽，用于放置丝网印刷电极组，该丝网印刷电极组置于检测T线正下方；所述检测T线包被有T线抗体，所述质控C线包被有C线抗体；所述结合物垫含有包被了cTnI抗体的三联吡啶钌负载介孔硅球免疫复合物颗粒。
优选的，所述样品垫的头部还与结合物垫的尾部粘贴，所述结合物垫的头部与NC膜尾部粘贴，所述NC膜头部与吸水纸尾部粘贴。
优选的，所述样本稀释液包括3％-5％甘露醇、2％-6％三丙胺的20-100mM四硼酸钠缓冲液，且PH＝8.45-8.55。
优选的，所述样品垫的材料包括玻璃纤维膜或聚酯膜，该样品垫的制备过程：选用玻璃纤维膜或者聚酯膜材料，放置在样品垫预处理液中充分浸泡，待其饱和后从液体中捞出，然后在37℃的烘箱中烘干6-12h，得到所需样品垫。
优选的，所述样品垫预处理液包括3％-5％抗RBC(鼠源性)、1％-2％BSA、0.2％-1％酪蛋白、0.1％-1％曲拉通X-100的50mM HEPES缓冲液。
优选的，所述结合物垫的材料包括玻璃纤维膜或聚酯膜，该结合物垫的制备过程：选用玻璃纤维膜或聚酯膜等材料，经结合物垫处理液预处理后烘干，然后将制备好的包被cTnI抗体1的负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球免疫复合物颗粒用免疫复合物稀释液稀释后，均匀的喷在结合物垫上，然后在37℃烘箱中烘干6-12h，得到所需的结合物垫。
优选的，所述负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球免疫复合物颗粒制备过程：
步骤X1，负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球的制备：将500μL10mg/mL的羧基化介孔硅球放入5mL棕色玻璃瓶中，放入磁力搅拌子进行旋转搅拌；
再加入50-200μL 5mg/mL的[Ru(bpy)3 2+]，在室温下避光搅拌12-24h；再将上述溶液置于1.5mL EP管中，于RCF＝9,000-10,000×g条件下离心10-25min，取出去除上清，加入500μL纯化水，超声分散；再重复上述操作2次，然后用100μL纯化水重悬，得到负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球，并置于2-8℃条件下保存；
步骤X2：负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球抗体标记：
取50μL步骤X1中所得的负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球，加入950μL纯化水，混匀后于RCF＝9,000-10,000×g条件下离心15-30min，弃上清；然后加入800μL的50mM MES缓冲液，混匀后加入50-200μL的20mg/mL EDC溶液、50-200μL的10mg/mL sulfo-NHS溶液，室温下振荡1-2h；再用50mM MES缓冲液清洗2次，于RCF＝9,000-10,000×g条件离心20-30min，然后用990μL的10mM PB缓冲液重悬；再加入10-20μg cTnI包被抗体，室温孵育2h；然后加入100μL封闭液(含2％甘氨酸、10％BSA的10mM PBS缓冲液)，室温封闭20-40min，于RCF＝9,000-10,000×g条件离心20-40min，再用10mM PBS缓冲液清洗2次，待清洗完成后，加入100μL含0.1％BSA的10mM PBS缓冲液重悬，再置于2-8℃条件下保存。
优选的，所述结合物垫预处理液包括1％-3％BSA、3％-5％海藻糖、0.1％-1％吐温-20的10-50mM PBS缓冲液，且PH＝7.35-7.45；
所述免疫复合物稀释液包括：0.2％-2％聚乙烯吡咯烷酮、0.5％-2％曲拉通X-100的10-50mM PBS缓冲液，且PH＝7.35-7.45。
优选的，所述NC膜的具体制备过程：将NC膜粘贴在PVC背衬的相应位置，用包被抗体稀释液稀释C线抗体及T线抗体，然后通过喷金滑膜仪将稀释后的C线抗体及T线抗体包被在NC膜上，若干在37℃烘箱中烘干4-8h。
优选的，所述包被抗体稀释液包括：1％-5％海藻糖、3％-5％甲醇的10-50mM PBS缓冲液，且PH＝7.35-7.45；所述C线抗体包括0.8-1.0mg/mL的羊抗鼠IgG；所述T线抗体包括0.5-1.5mg/mL的cTnI抗体。
本发明还提供一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的测定方法，包括如下步骤：
步骤S1：将样本用样本稀释液稀释；
步骤S2：将稀释后的样本加至加样孔；
步骤S3：当样本滴加在样品垫上后，在毛细作用下层析至结合物垫；
步骤S4：样本中的cTnI抗原与结合物垫中的已包被cTnI抗体1的负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球免疫复合物颗粒发生特异性结合；
步骤S5：然后在毛细作用下层析至NC膜上，cTnI抗原游离端与预包被在NC膜上的‘T线抗体’(cTnI标记抗体)结合形成‘双抗体夹心免疫复合物’；
步骤S6：待充分反应10-15min后，在‘检测T线’下的丝网印刷电极组上施加恒定电压；
步骤S7：使在‘检测T线’位置形成的双抗体夹心免疫复合物中的三联吡啶钌与样本稀释液中的三丙胺在电压的作用下反应释放光信号；
步骤S8：再通过CCD相机收集光信号，从而实现cTnI的定量测定；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
采用本发明的技术方案，具有以下有益效果：
1、本发明通过将电化学发光的高检测灵敏度与层析试纸的使用便捷性相结合，以制备一种使用方便、检测系统简单、并且拥有高灵敏度的cTnI测定试剂；该试剂盒可以简便、快速、高灵敏地测定心肌肌钙蛋白I的浓度；本发明所述的基于电化学发光原理的cTnI免疫层析试剂，通过侧向流层析的方式对抗原与包被抗体复合物进行分离、富集与检测；当加入样本后，样本中的cTnI抗原从样品垫层析至结合物垫，与预固定在结合物垫上的包被cTnI抗体1的负载三联吡啶钌的介孔硅球复合颗粒发生特异性结合，然后在结合物垫形成的免疫复合物层析至NC膜，与包被在NC膜上的cTnI抗体2结合形成双抗体夹心免疫复合物，从而实现对检测标志物的分离、富集与检测；当最终在NC膜上的双抗体夹心免疫复合物稳定形成后，通过丝网印刷电极施加恒定电压，从而在免疫复合物检测区形成稳定的电场进而发出发光信号，可以通过CCD相机采集电化学发光信号，从而可实现对心肌肌钙蛋白I的定量测定。
2、本发明为采用电化学发光原理进行检测的层析试纸条，不仅拥有层析试纸条所具备的使用简便、检测快速的特点，而且拥有电化学发光免疫分析法所具备的灵敏度高、线性范围宽、准确度高；
与化学发光免疫分析法相比，由于本法采用层析试纸方式，试剂稳定性好、存储运输方便、配备的仪器体积小、操作简便、无需专业检验人员就可操作，可检测的样本类型更加多样，可以更好的满足临床客户需求；
与胶体金或荧光免疫层析法相比，本法采用电致化学发光，试剂灵敏度更高、准确度好、抗干扰能力强，可以为临床诊疗提高更加可靠的结果。
与单人份化学发光试剂相比，本试剂操作简便、仪器占用空间小、成本更低。
3、本发明采用介孔硅球纳米颗粒作为固相载体，可以在包被cTnI抗体的同时负载三联吡啶钌，从而形成发光标记抗体免疫复合物，该复合物在单位发光强度上明显优于传统标记物，因为介孔硅球的表面积更大、可以交联更多抗体而且该复合物单位抗体所连接的发光标记物量更多；介孔硅球的粒径较大，较常规磁珠包被灵敏度高；介孔硅球为中空多孔结构，三联吡啶钌可以物理吸附或功能团交联的方式负载在硅球上，与常规化学发光免疫分析相比，单个免疫复合物可以被激发出更多的发光信号，从而使试剂的检测灵敏度更高。
4、本发明采用丝网印刷电极提供电化学发光所需的电场，丝网印刷电极可以回收使用，可以降低检测成本。
5、本发明采用样本稀释液，样本稀释液中含有电致化学发光所需的三丙胺，测试时先用样本稀释液稀释样本，然后将稀释后的样本滴加在样品垫上。通过样本稀释液的方式加入TPA，可以减少操作步骤、缩短测试时间，从而使检测更加简便。
附图说明
图1为本发明试纸条结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明进一步说明。
参照图1，本发明提供一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒，包括：样本稀释液、试纸条；所述试纸条由样品垫200、结合物垫300、NC膜400、吸水纸500、PVC底板100、丝网印刷电极组(图中未画出)组成，所述样品垫200、结合物垫300、NC膜400、吸水纸500依次设置在PVC底板100上；所述NC膜400上设有检测T线600和质控C线700；所述PVC底板100上设有凹槽，用于放置丝网印刷电极组，该丝网印刷电极组置于检测T线600正下方；所述检测T线600包被有T线抗体，所述质控C线700包被有C线抗体；所述结合物垫300含有包被了cTnI抗体的三联吡啶钌负载介孔硅球免疫复合物颗粒；所述样品垫200的头部还与结合物垫300的尾部粘贴，所述结合物垫300的头部与NC膜400尾部粘贴，所述NC膜400头部与吸水纸500尾部粘贴。所述样本稀释液包括3％甘露醇、2％三丙胺的50mM四硼酸钠缓冲液，且PH＝8.45-8.55；所述吸水纸：可以选用吸水滤纸、吸水纤维等材料。
所述样品垫200的材料包括玻璃纤维膜或聚酯膜，该样品垫200的制备过程：选用玻璃纤维膜或者聚酯膜材料，放置在样品垫预处理液中充分浸泡，待其饱和后从液体中捞出，然后在37℃的烘箱中烘干6-12h，得到所需样品垫。
所述样品垫预处理液包括5％抗RBC(鼠源性)、1％BSA、0.5％酪蛋白、0.2％曲拉通X-100的50mM HEPES缓冲液。
所述结合物垫300的材料包括玻璃纤维膜或聚酯膜，该结合物垫的制备过程：选用玻璃纤维膜或聚酯膜等材料，经结合物垫处理液预处理后烘干，然后将制备好的包被cTnI抗体1的负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球免疫复合物颗粒用免疫复合物稀释液稀释后，均匀的喷在结合物垫上，然后在37℃烘箱中烘干6-12h，得到所需的结合物垫。
所述负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球免疫复合物颗粒制备过程：
步骤X1，负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球的制备：将500μL10mg/mL的羧基化介孔硅球放入5mL棕色玻璃瓶中，放入磁力搅拌子进行旋转搅拌；
再加入100μL 5mg/mL的[Ru(bpy)3 2+]，在室温下避光搅拌18h；再将上述溶液置于1.5mL EP管中，于RCF＝10,000×g条件下离心15min，取出去除上清，加入500μL纯化水，超声分散；再重复上述操作2次，然后用100μL纯化水重悬，得到负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球，并置于2-8℃条件下保存；
步骤X2：负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球抗体标记：
取50μL步骤X1中所得的负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球，加入950μL纯化水，混匀后于RCF＝10,000×g条件下离心20min，弃上清；然后加入800μL的50mM MES缓冲液，混匀后加入100μL的20mg/mL EDC溶液、100μL的10mg/mL sulfo-NHS溶液，室温下振荡1h；再用50mM MES缓冲液清洗2次，离心条件为RCF＝10,000×g离心20min，然后用990μL的10mM PB缓冲液重悬；再加入10μg cTnI包被抗体，室温孵育2h；然后加入100μL封闭液(含2％甘氨酸、10％BSA的10mM PBS缓冲液)，室温封闭30min，在离心条件为RCF＝10,000×g离心20min，再用10mM PBS缓冲液清洗2次，待清洗完成后，加入100μL含0.1％BSA的10mM PBS缓冲液重悬，再置于2-8℃条件下保存。
所述结合物垫预处理液包括1％BSA、5％海藻糖、0.1％吐温-20的10mM PBS缓冲液，且PH＝7.35-7.45；所述免疫复合物稀释液包括：0.5％聚乙烯吡咯烷酮、1％曲拉通X-100的10mM PBS缓冲液，且PH＝7.35-7.45。
所述NC膜400的具体制备过程：将NC膜粘贴在PVC背衬的相应位置，用包被抗体稀释液稀释C线抗体700及T线抗体600，然后通过喷金滑膜仪将稀释后的C线抗体700及T线抗体600包被在NC膜400上，若干在37℃烘箱中烘干4-8h。所述包被抗体稀释液包括：2％海藻糖、4％甲醇的10mM PBS缓冲液，且PH＝7.35-7.45；所述C线抗体包括1.0mg/mL的羊抗鼠IgG；所述T线抗体包括0.8mg/mL的cTnI抗体。
本发明还提供一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的测定方法，包括如下步骤：
步骤S1：将样本用样本稀释液稀释；
步骤S2：将稀释后的样本加至加样孔；
步骤S3：当样本滴加在样品垫上后，在毛细作用下层析至结合物垫；
步骤S4：样本中的cTnI抗原与结合物垫中的已包被cTnI抗体1的负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球免疫复合物颗粒发生特异性结合；
步骤S5：然后在毛细作用下层析至NC膜上，cTnI抗原游离端与预包被在NC膜上的‘T线抗体’(cTnI标记抗体)结合形成‘双抗体夹心免疫复合物’；
步骤S6：待充分反应10-15min后，在‘检测T线’下的丝网印刷电极组上施加恒定电压；在丝网印刷电极的阳极表面，三联吡啶钌与三丙胺同时失去电子发生氧化反应，2价的[Ru(bpy)3 2+]标记物被氧化成3价的[Ru(bpy)3 3+]标记物，TPA被氧化成阳离子自由基TPA+*，TPA+*很不稳定，自发地失去一个质子而形成自由基TPA*，其为强还原剂，将一个电子给3价的[Ru(bpy)3 3+]，使其成为激发态的[Ru(bpy)3 2+*]，而TPA自身被氧化成氧化产物。激发态的[Ru(bpy)3 2+*]衰减时发射一个波长620nm的光子，重新形成基态的[Ru(bpy)3 2+]。这一过程在电极表面循环进行，持续产生光子，使得光信号得以检测：
Ru(bpy)3 2+-e-→Ru(bpy)3 3+
TPA-e-→TPA+*
TPA-H+→TPA*
Ru(bpy)3 3++TPA*→Ru(bpy)3 2+*
Ru(bpy)3 2+*→Ru(bpy)3 2++hv(λ＝620nm)；
步骤S7：使在‘检测T线’位置形成的双抗体夹心免疫复合物中的三联吡啶钌与样本稀释液中的三丙胺在电压的作用下反应释放光信号；
步骤S8：再通过CCD相机收集光信号，从而实现cTnI的定量测定，通过CCD相机采集发光信号从而进行全血、血清或血浆中心肌肌钙蛋白I含量测定。
1、根据本案制备的试纸条，进行空白限测试：
根据本案制备的试纸条，用零浓度稀释液作为空白限样本，准备4个空白限样本，每个样本测试5次，总共得到20个测量结果的RLU值，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，同时相邻浓度的样品重复测试2次，根据零浓度稀释液和相邻低浓度样品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值代入上述方程中，求出对应的浓度值即为空白限，如下表1：
表1
Figure BDA0004106670330000131
其中上表中的1035为浓度(1.0pg/mL)所对应的相对光强度(RLU)；由上表1可知，本发明的空白限为0.153pg/mL。
2、检出限测试：
根据本案制备试纸条，对5份浓度近似最低检出限(应不高于1.0pg/mL)的心肌肌钙蛋白I(cTnI)参考品进行检测，每份样本检测5次，对检测结果按照大小进行排序，检查25次结果中低于空白限数值的数量，应不大于3个，如下表2：
表2
Figure BDA0004106670330000141
由上表2可知，不存在低于空白限的检测结果，本发明的检出限为1.0pg/mL。
3、线性测试：
根据本案制备的试纸条，将接近线性范围上限(100ng/ml)的高值样品按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度的样品须接近0.001ng/ml。对每一浓度的样品均重复检测3次，计算其平均值，即为实测浓度，将稀释浓度和实测浓度用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r，r不小于0.99，如下表3：
表3:
Figure BDA0004106670330000151
由上表3可知，本发明的线性范围1pg/mL-100ng/mL，R2＝0.9999。
3、与商品化试剂性能比较：
表4
Figure BDA0004106670330000152
由上表4可知，本发明的试剂灵敏度与线性范围较现有商品化试剂有明显改善。
由上述实施例可知，本发明通过将电化学发光的高检测灵敏度与层析试纸的使用便捷性相结合，以制备一种使用方便、检测系统简单、并且拥有高灵敏度的cTnI测定试剂；该试剂盒可以简便、快速、高灵敏地测定心肌肌钙蛋白I的浓度；本发明所述的基于电化学发光原理的cTnI免疫层析试剂，通过侧向流层析的方式对抗原与包被抗体复合物进行分离、富集与检测；当加入样本后，样本中的cTnI抗原从样品垫层析至结合物垫，与预固定在结合物垫上的包被cTnI抗体1的负载三联吡啶钌的介孔硅球复合颗粒发生特异性结合，然后在结合物垫形成的免疫复合物层析至NC膜，与包被在NC膜上的cTnI抗体2结合形成双抗体夹心免疫复合物，从而实现对检测标志物的分离、富集与检测；当最终在NC膜上的双抗体夹心免疫复合物稳定形成后，通过丝网印刷电极施加恒定电压，从而在免疫复合物检测区形成稳定的电场进而发出发光信号，可以通过CCD相机采集电化学发光信号，从而可实现对心肌肌钙蛋白I的定量测定。
2、本发明为采用电化学发光原理进行检测的层析试纸条，不仅拥有层析试纸条所具备的使用简便、检测快速的特点，而且拥有电化学发光免疫分析法所具备的灵敏度高、线性范围宽、准确度高；
与化学发光免疫分析法相比，由于本法采用层析试纸方式，试剂稳定性好、存储运输方便、配备的仪器体积小、操作简便、无需专业检验人员就可操作，可检测的样本类型更加多样，可以更好的满足临床客户需求；
与胶体金或荧光免疫层析法相比，本法采用电致化学发光，试剂灵敏度更高、准确度好、抗干扰能力强，可以为临床诊疗提高更加可靠的结果。
与单人份化学发光试剂相比，本试剂操作简便、仪器占用空间小、成本更低。
4、本发明采用介孔硅球纳米颗粒作为固相载体，可以在包被cTnI抗体的同时负载三联吡啶钌，从而形成发光标记抗体免疫复合物，该复合物在单位发光强度上明显优于传统标记物，因为介孔硅球的表面积更大、可以交联更多抗体而且该复合物单位抗体所连接的发光标记物量更多；介孔硅球的粒径较大，较常规磁珠包被灵敏度高；介孔硅球为中空多孔结构，三联吡啶钌可以物理吸附或功能团交联的方式负载在硅球上，与常规化学发光免疫分析相比，单个免疫复合物可以被激发出更多的发光信号，从而使试剂的检测灵敏度更高。
4、本发明采用丝网印刷电极提供电化学发光所需的电场，丝网印刷电极可以回收使用，可以降低检测成本。
5、本发明采用样本稀释液，样本稀释液中含有电致化学发光所需的三丙胺，测试时先用样本稀释液稀释样本，然后将稀释后的样本滴加在样品垫上。通过样本稀释液的方式加入TPA，可以减少操作步骤、缩短测试时间，从而使检测更加简便。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒，其特征在于，包括：样本稀释液、试纸条；所述试纸条由样品垫、结合物垫、NC膜、吸水纸、PVC底板、丝网印刷电极组组成，所述样品垫、结合物垫、NC膜、吸水纸依次设置在PVC底板上；所述NC膜上设有检测T线和质控C线；所述PVC底板上设有凹槽，用于放置丝网印刷电极组，该丝网印刷电极组置于检测T线正下方；所述检测T线包被有T线抗体，所述质控C线包被有C线抗体；所述结合物垫含有包被了cTnI抗体的三联吡啶钌负载介孔硅球免疫复合物颗粒。
2.根据权利要求1所述的电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒，其特征在于，所述样品垫的头部还与结合物垫的尾部粘贴，所述结合物垫的头部与NC膜尾部粘贴，所述NC膜头部与吸水纸尾部粘贴。
3.根据权利要求1所述的电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液包括3％-5％甘露醇、2％-6％三丙胺的20-100mM四硼酸钠缓冲液，且PH＝8.45-8.55。
4.根据权利要求1所述的电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒，其特征在于，所述样品垫的材料包括玻璃纤维膜或聚酯膜，该样品垫的制备过程：选用玻璃纤维膜或者聚酯膜材料，放置在样品垫预处理液中充分浸泡，待其饱和后从液体中捞出，然后在37℃的烘箱中烘干6-12h，得到所需样品垫；
所述样品垫预处理液包括3％-5％抗RBC、1％-2％BSA、0.2％-1％酪蛋白、0.1％-1％曲拉通X-100的20-100mM HEPES缓冲液。
5.根据权利要求1所述的电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒，其特征在于，所述结合物垫的材料包括玻璃纤维膜或聚酯膜，该结合物垫的制备过程：选用玻璃纤维膜或聚酯膜等材料，经结合物垫处理液预处理后烘干，然后将制备好的包被cTnI抗体1的负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球免疫复合物颗粒用免疫复合物稀释液稀释后，均匀的喷在结合物垫上，然后在37℃烘箱中烘干6-12h，得到所需的结合物垫。
6.根据权利要求5所述的电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒，其特征在于，所述负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球免疫复合物颗粒制备过程：
步骤X1，负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球的制备：将500μL 10mg/mL的羧基化介孔硅球放入5mL棕色玻璃瓶中，放入磁力搅拌子进行旋转搅拌；再加入50-200μL 5mg/mL的[Ru(bpy)3 2+]，在室温下避光搅拌12-24h；再将上述溶液置于1.5mL EP管中，于RCF＝9,000-10,000×g条件下离心10-25min，取出去除上清，加入500μL纯化水，超声分散；再重复上述操作2次，然后用100μL纯化水重悬，得到负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球，并置于2-8℃条件下保存；
步骤X2：负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球抗体标记：
取50μL步骤X1中所得的负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球，加入950μL纯化水，混匀后于RCF＝9,000-10,000×g条件下离心15-30min，弃上清；然后加入800μL的50mM MES缓冲液，混匀后加入50-200μL的20mg/mL EDC溶液、50-200μL的10mg/mL sulfo-NHS溶液，室温下振荡1-2h；再用50mM MES缓冲液清洗2次，于RCF＝9,000-10,000×g条件下离心20-30min，然后用990μL的10mM PB缓冲液重悬；再加入10-20μg cTnI包被抗体，室温孵育2-4h；然后加入100-150μL封闭液，室温封闭20-40min，于RCF＝9,000-10,000×g条件下离心20-40min，再用10mM PBS缓冲液清洗2次，待清洗完成后，加入100μL含0.1％BSA的10mM PBS缓冲液重悬，再置于2-8℃条件下保存。
7.根据权利要求5所述的电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒，其特征在于，所述结合物垫预处理液包括1％-3％BSA、3％-5％海藻糖、0.1％-1％吐温-20的10-50mMPBS缓冲液，且PH＝7.35-7.45；
所述免疫复合物稀释液包括：0.2％-2％聚乙烯吡咯烷酮、0.5％-2％曲拉通X-100的10-50mM PBS缓冲液，且PH＝7.35-7.45。
8.根据权利要求1所述的电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒，其特征在于，所述NC膜的具体制备过程：将NC膜粘贴在PVC背衬的相应位置，用包被抗体稀释液稀释C线抗体及T线抗体，然后通过喷金滑膜仪将稀释后的C线抗体及T线抗体包被在NC膜上，然后在37℃烘箱中烘干4-8h。
9.根据权利要求8所述的电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒，其特征在于，所述包被抗体稀释液包括：1％-5％海藻糖、3％-5％甲醇的10-50mM PBS缓冲液，且PH＝7.35-7.45；所述C线抗体包括0.8-1.0mg/mL的羊抗鼠IgG；所述T线抗体包括0.5-1.5mg/mL的cTnI抗体。
10.根据权利要求书1-9任一项所述的电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1：将样本用样本稀释液稀释；
步骤S2：将稀释后的样本加至加样孔；
步骤S3：当样本滴加在样品垫上后，在毛细作用下层析至结合物垫；
步骤S4：样本中的cTnI抗原与结合物垫中的已包被cTnI抗体1的负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球免疫复合物颗粒发生特异性结合；
步骤S5：然后在毛细作用下层析至NC膜上，cTnI抗原游离端与预包被在NC膜上的‘T线抗体’结合形成‘双抗体夹心免疫复合物’；
步骤S6：待充分反应10-15min后，在‘检测T线’下的丝网印刷电极组上施加恒定电压；
步骤S7：使在‘检测T线’位置形成的双抗体夹心免疫复合物中的三联吡啶钌与样本稀释液中的三丙胺在电压的作用下反应释放光信号；
步骤S8：再通过CCD相机收集光信号，从而实现cTnI的定量测定；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
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