CN114113592B - 一种基于巯基苯硼酸功能化金纳米颗粒的侧流层析试纸及其检测方法 - Google Patents

一种基于巯基苯硼酸功能化金纳米颗粒的侧流层析试纸及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于巯基苯硼酸功能化金纳米颗粒的侧流层析试纸及检测方法，所述侧流层析试纸包括平板(1)、样品垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸收垫(4)，通过制备巯基苯硼酸功能化的金纳米颗粒、制备金‑巯基苯硼酸‑细菌结合物、制备侧流层析试纸条和侧流层析检测的步骤，即可完成所述侧流层析检测方法；本发明利用苯硼酸与细菌的强结合力，突破传统侧流免疫层析中双抗夹心法的局限性，大大节约了检测成本并且提高了检测限，能够通过本方法得到病原微生物的定性及定量结果，特异性强、灵敏度高、检测过程方便快捷，检测结果安全可靠。

Description

一种基于巯基苯硼酸功能化金纳米颗粒的侧流层析试纸及其 检测方法
技术领域
本发明涉及一种侧流层析试纸及其检测方法，尤其涉及一种基于巯基苯硼酸功能化金纳米颗粒的侧流层析试纸及其检测方法。
背景技术
细菌检测是关系公共安全的一个重要领域，侧向流动免疫层析技术(LFIA)是一种优秀而经典的生物传感技术，广泛应用于病原体快速监测领域，利用肉眼监测即可实现现场即时定性检测。传统的免疫侧向层析技术用于细菌检测通常使用双抗夹心法即“纳米材料-检测抗体-细菌-捕获抗体”夹心模式，其中检测抗体被标记能产生读出信号的纳米材料，如金纳米颗粒、量子点等，而捕获抗体被固定在条带T线区域。成对的抗体需要经过耗时的筛选过程获得，同时受到制备过程繁琐、化学不稳定或抗体与纳米材料之间复杂的交联等因素的限制。
采用非捕获抗体依赖的LFIA方法即“纳米材料-细菌-检测抗体”夹心策略，通常为采用静电吸附、氢键、疏水作用等弱结合力来捕获细菌，导致结果重现性低以及检测限较高。因此，使用共价键等强结合力捕获细菌以实现“纳米材料-细菌-抗体”夹心策略至关重要。
传统的基于胶体金的侧流层析检测技术采用的是双抗夹心法，该方法需要制备“胶体金-捕获抗体”探针，该探针具有化学不稳定性，在检测过程中，该探针可能存在部分失效的情况，因此检测限较高。现有非捕获抗体依赖的LFIA方法采用的是静电吸附、氢键、疏水作用等弱结合力来捕获细菌，导致捕获细菌的效率较低，简单来说就是每一个细菌上吸附的纳米颗粒较少，因此聚集在试纸条检测线上的纳米颗粒较少，因此检测限较高。
发明内容
发明目的：本发明针对现有技术中存在的侧流层析检测方法检测限高及不够灵敏的问题，提供一种基于巯基苯硼酸功能化金纳米颗粒的侧流层析试纸，还提供了该侧流层析的检测方法。
技术方案：本发明所述的基于巯基苯硼酸功能化金纳米颗粒的侧流层析试纸，包括平板、样品垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，样品垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘贴在平板的单侧表面，所述硝酸纤维素膜的表面包被检测线，所述检测线上包被病原微生物受体蛋白，金-巯基苯硼酸-待测细菌结合物通过与检测线上包被病原微生物受体蛋白结合，将金-巯基苯硼酸纳米颗粒聚集于检测线。
优选的，所述样品垫为聚酯膜通过曲拉通X-100、氯化钠、Tris-HCl和PB处理并烘干，所述样品垫和硝酸纤维素膜的交界重叠1-2mm，硝酸纤维素膜和吸收垫的交界重叠1-2mm。
优选的，所述金-巯基苯硼酸-细菌结合物，通过将巯基苯硼酸加入金纳米颗粒，制得巯基苯硼酸功能化的金纳米颗粒；将巯基苯硼酸功能化的金纳米颗粒加入待测细菌，混合后加入牛血清白蛋白得到金-巯基苯硼酸-细菌结合物。
本发明还公开了基于巯基苯硼酸功能化金纳米颗粒的侧流层析检测方法，包括以下步骤：
(1)巯基苯硼酸功能化的金纳米颗粒的制备：制备氯金酸溶液，加入还原剂柠檬酸钠，冷却静置得到金纳米颗粒，取金纳米颗粒，加入巯基苯硼酸，反应后乙醇洗涤，得到巯基苯硼酸功能化的金纳米颗粒；
(2)金-巯基苯硼酸-细菌结合物的制备：取单菌落加入培养基培养，取菌液加入培养基培养后得到细菌，取巯基苯硼酸功能化的金纳米颗粒加入待测细菌，混合后加入牛血清白蛋白，混合后得到了金-巯基苯硼酸-待测细菌结合物；
(3)侧流层析试纸条制备：将样品垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘贴到平板上彼此重叠1-2mm，组装成侧流层析试纸，所述硝酸纤维素膜的表面包被检测线，所述检测线上包被病原微生物受体蛋白；
(4)侧流层析检测方法：取步骤(2)制得的金-巯基苯硼酸-待测细菌结合物，滴加于试纸条的样品垫，样品液往硝酸纤维素膜迁移，待检测细菌能与硝酸纤维素膜上的检测线包被的病原微生物受体蛋白进行特异性抗原抗体识别，金-巯基苯硼酸纳米颗粒聚集于检测线，出现T线条带，进行定性判断；用Image J软件分析T线灰度值，与标准曲线对比，实现定量判断样品中的细菌浓度。
优选的，步骤(1)中，所述氯金酸溶液浓度为0.1％-10％，柠檬酸钠浓度为0.1％-10％，巯基苯硼酸0.1-1g/L。
优选的，步骤(2)中，所述细菌为革兰阳性菌或革兰阴性菌，所述细菌的浓度为0-108CFU/mL，所述混合时间为0.5-2h。
优选的，步骤(3)中，所述样品垫的制备，具体为，将聚酯膜浸入样品垫处理液处理10-24h,然后于烘箱25-40℃烘干2-10h，得到样品垫，所述样品垫处理液由0.1％-1％曲拉通-100，1％-5％氯化钠，Tris-HCl(pH 8.0-10.0)组成。
优选的，步骤(3)中，所述硝酸纤维素膜的制备，具体为，将待检测细菌抗体以0.5-2μL/cm速率分配到硝酸纤维素膜上。
优选的，步骤(4)中，所述软件分析各细菌浓度下的T线灰度值，拟合制定标准曲线；根据待检测样品在T线灰度值，根据标准曲线，实现定量判断样品中的细菌浓度。
发明原理：
发明人在研究中心发现，苯硼酸可与细菌表面的脂多糖及糖蛋白中含有的顺式邻二羟基结构可逆共价结合，经脱水形成环状酯，可作为微生物的识别分子；可将其应用于侧向流动免疫层析法实现细菌检测。
在侧向流动免疫层析法中一定要依靠抗体识别捕获特异性细菌，可以依靠细菌本身的结构特性实现结合，形成“纳米材料-细菌”复合物，在本发明中通过纳米材料表面的苯硼酸与细菌表面的顺式邻二羟基结构形成六元环状硼酸二醇酯，以共价键作用实现纳米材料对细菌的识别捕获。该侧流免疫层析方法使用的金-巯基苯硼酸纳米粒子不仅用于产生信号，而且可以利用苯硼酸与细菌表面的脂多糖及糖蛋白中含有的顺式邻二羟基结构进行共价结合来捕获细菌，只需要单一抗体即可获得比传统夹心形式更好的结果。
不同于现有技术所使用的静电引力、疏水相互作用和氢键等弱结合力，首次利用共价键等强结合力捕捉细菌，设计出一种新型的非捕获抗体依赖性侧流免疫层析法；新LFIA在病原体检测领域具有普遍适用性；金-巯基苯硼酸纳米粒子的合成以及侧流层析试纸条的制备工艺具有成本效益、快速、简单、省力的特点。将制备的金-巯基苯硼酸-细菌结合物滴加于试纸条的样品垫后，通过裸眼观察NC膜T线的颜色强度后进行比色定性判断细菌浓度或用Image J软件分析T线灰度值定量判断细菌浓度。实现广谱性细菌现场即时检测，大大节约了检测成本并且提高了检测限。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
本发明提供了一种快速，高灵敏度，高特异性的可现场检测的基于巯基苯硼酸功能化金纳米颗粒的侧流层析检测方法，可同时完成定性和定量测试；最低可检测到浓度为103cfu/ml的病原微生物，在10min内即可完成检测，仅凭肉眼即可观测检验结果，本发明对病原微生物特异性强、灵敏度高、检测过程方便快捷，检测结果安全可靠。
附图说明
图1为本发明的侧流层析试纸条的示意图；
图2为本发明的侧流层析试纸条的试验结果裸眼观测图；
图3为本发明的侧流层析试纸条的试验结果的Image J软件分析示意图；
图4为本发明的金纳米颗粒的透射电镜图；
图5为巯基苯硼酸修饰的金纳米颗粒的紫外可见吸收光谱图；
图6为巯基苯硼酸、金纳米颗粒、巯基苯硼酸修饰的金纳米颗粒的红外光谱图；
图7为金-巯基苯硼酸纳米颗粒与大肠杆菌O157：H7，金黄色葡萄球菌共孵育的扫描电镜图和红外光谱图；
图8为基于金-巯基苯硼酸的侧向流动免疫层析法的五个检测参数优化图；
图9该检测方法下，以大肠杆菌O157：H7为例，对照组、100、101、102、103、104、105、106、107、108cfu/ml大肠杆菌O157：H7对应的条带实验结果图。
图10为本侧流层析法检测四种食物基质中(饮用水、西瓜汁、牛奶和牛肉)的大肠杆菌O157：H7含量的结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
巯基苯硼酸功能化的金纳米颗粒的制备过程：取100ml超纯水于三角瓶中，加热沸腾后立即加入1ml 1％的氯金酸并不断搅拌，加入1％的柠檬酸钠4ml，待溶液颜色由无色逐渐变为酒红色，待颜色稳定后继续煮沸10min，冷却至室温，加纯水定容至100ml。取上述制备得到的金纳米颗粒5ml于茄形瓶中，加入1ml巯基苯硼酸，室温反应12h后，用乙醇洗涤多次，即得到了苯硼酸功能化的金纳米颗粒。
金-巯基苯硼酸-细菌结合物的制备：取单菌落入3ml LB液体培养基150rpm 37℃过夜培养，取60μl菌液于3ml LB液体培养基培养3h后得浓度为108cfu/ml的细菌，倍比稀释得不同浓度的细菌。取10μl金-巯基硼酸纳米颗粒于EP管中，加入10μl细菌，混合仪混合0.5h后，再加入10μl牛血清白蛋白(BSA)，于混合仪混合0.5h，即得到了金-巯基苯硼酸-细菌结合物。
试纸条制作：LFIA试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫三个部分。吸收垫不经进一步处理，样品垫经曲拉通-100、氯化钠、Tris-HCl(pH 8.0)处理，然后于25℃下烘干8h；硝酸纤维素膜的试线区由检测抗体(0.5mg/mL)以0.5μL/cm的速率分配。然后，将三部分依次粘贴到聚氯乙烯平板上彼此重叠1mm，组装成LFIA试条。最后，将条带切成3mm宽，4-8℃储存以备进一步使用。
实施例2
巯基苯硼酸功能化的金纳米颗粒的制备过程：取100ml超纯水于三角瓶中，加热沸腾后立即加入1ml 1％的氯金酸并不断搅拌，加入10％的柠檬酸钠4ml，溶液颜色由无色逐渐变为酒红色，待颜色稳定后继续煮沸10min，冷却至室温，加纯水定容至100ml。取上述制备得到的金纳米颗粒5ml于茄形瓶中，加入1ml巯基苯硼酸，室温反应12h后，用乙醇洗涤多次，即得到了苯硼酸功能化的金纳米颗粒。
金-巯基苯硼酸-细菌结合物的制备：取单菌落入3ml LB液体培养基150rpm37℃过夜培养，取60μl菌液于3ml LB液体培养基培养3h后得浓度为108cfu/ml的细菌，倍比稀释得不同浓度的细菌。取100μl金-巯基硼酸纳米颗粒于EP管中，加入100μl细菌，混合仪混合2h后，再加入50μl牛血清白蛋白(BSA)，于混合仪混合0.5h，即得到了金-巯基苯硼酸-细菌结合物。
试纸条制作：LFIA试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫三个部分。吸收垫不经进一步处理，样品垫经曲拉通-100、氯化钠、Tris-HCl(pH 10.0)处理，然后于37℃下烘干12h；硝酸纤维素膜的试线区由检测抗体(2mg/mL)以0.8μL/cm的速率分配。然后，将三部分依次粘贴到聚氯乙烯平板上彼此重叠1mm，组装成LFIA试条。最后，将条带切成3-5mm宽，4-8℃储存以备进一步使用。
实施例3
巯基苯硼酸功能化的金纳米颗粒的制备过程：取100ml超纯水于三角瓶中，加热沸腾后立即加入1ml 10％的氯金酸并不断搅拌，加入5％的柠檬酸钠4ml，几分钟后溶液颜色由无色逐渐变为酒红色，待颜色稳定后继续煮沸10min，冷却至室温，加纯水定容至100ml。取上述制备得到的金纳米颗粒5ml于茄形瓶中，加入1ml巯基苯硼酸，室温反应12h后，用乙醇洗涤多次，即得到了苯硼酸功能化的金纳米颗粒。
金-巯基苯硼酸-细菌结合物的制备：取单菌落入3ml LB液体培养基150rpm37℃过夜培养，取60μl菌液于3ml LB液体培养基培养3h后得浓度为108cfu/ml的细菌，倍比稀释得不同浓度的细菌。取100μl金-巯基硼酸纳米颗粒于EP管中，加入100μl细菌，混合仪混合1h后，再加入50μl牛血清白蛋白(BSA)，于混合仪混合0.5h，即得到了金-巯基苯硼酸-细菌结合物。
试纸条制作：LFIA试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫三个部分。吸收垫不经进一步处理，样品垫经曲拉通-100、氯化钠、Tris-HCl(pH 8.0)处理，然后于37℃下烘干12h；硝酸纤维素膜的试线区由检测抗体(2mg/mL)以1μL/cm的速率分配。然后，将三部分依次粘贴到聚氯乙烯平板上彼此重叠2mm，组装成LFIA试条。最后，将条带切成3-5mm宽，4-8℃储存以备进一步使用。
实施例4
巯基苯硼酸功能化的金纳米颗粒的制备过程：取100ml超纯水于三角瓶中，加热沸腾后立即加入1ml 3％的氯金酸并不断搅拌，5分钟后加入5％的柠檬酸钠4ml，2分钟后溶液颜色由无色逐渐变为酒红色，待颜色稳定后继续煮沸10min，冷却至室温，加纯水定容至100ml。取上述制备得到的金纳米颗粒5ml于茄形瓶中，加入1ml巯基苯硼酸，室温反应12h后，用乙醇洗涤多次，即得到了苯硼酸功能化的金纳米颗粒。
金-巯基苯硼酸-细菌结合物的制备：取单菌落入3ml LB液体培养基150rpm 37℃过夜培养，取60μl菌液于3ml LB液体培养基培养3h后得浓度为108cfu/ml的细菌，倍比稀释得不同浓度的细菌。取100μl金-巯基硼酸纳米颗粒于EP管中，加入100μl细菌，混合仪混合2h后，再加入50μl牛血清白蛋白(BSA)，于混合仪混合0.5h，即得到了金-巯基苯硼酸-细菌结合物。
试纸条制作：LFIA试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫三个部分。吸收垫不经进一步处理，样品垫经曲拉通-100、氯化钠、Tris-HCl(pH 10.0)处理，然后于37℃下烘干12h；硝酸纤维素膜的试线区由检测抗体(2mg/mL)以2μL/cm的速率分配。然后，将三部分依次粘贴到聚氯乙烯平板上彼此重叠1-2mm，组装成LFIA试条。最后，将条带切成3-5mm宽，4-8℃储存以备进一步使用。
对比例1
巯基苯硼酸功能化的金纳米颗粒的制备过程：取100ml超纯水于三角瓶中，加热沸腾后立即加入1ml 12％的氯金酸并不断搅拌，5分钟后加入12％的柠檬酸钠4ml，2分钟后溶液颜色由无色逐渐变为酒红色，待颜色稳定后继续煮沸20min，冷却至室温，加纯水定容至100ml。取上述制备得到的金纳米颗粒5ml于茄形瓶中，加入1ml巯基苯硼酸，室温反应12h后，用乙醇洗涤多次，即得到了苯硼酸功能化的金纳米颗粒。
金-巯基苯硼酸-细菌结合物的制备：取单菌落入3ml LB液体培养基150rpm 37℃过夜培养，取60μl菌液于3ml LB液体培养基培养3h后得浓度为108cfu/ml的细菌，倍比稀释得不同浓度的细菌。取5μl金-巯基硼酸纳米颗粒于EP管中，加入120μl细菌，混合仪混合0.4h后，再加入5μl牛血清白蛋白(BSA)，于混合仪混合0.1h，即得到了金-巯基苯硼酸-细菌结合物。
试纸条制作：LFIA试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫三个部分。吸收垫不经进一步处理，样品垫经曲拉通-100、氯化钠、Tris-HCl(pH 7.0)处理，然后于50℃下烘干1h；硝酸纤维素膜的试线区由检测抗体(0.2mg/mL)以0.2μL/cm的速率分配。然后，将三部分依次粘贴到聚氯乙烯平板上彼此重叠1-2mm，组装成LFIA试条。最后，将条带切成3-5mm宽，4-8℃储存以备进一步使用。
如图1所示，为制备的的侧流层析试纸条的示意图，1为聚氯乙烯平板、2为吸收垫、3为硝酸纤维素膜、4为吸收垫、5为检测线、6为检测线上的抗体。
如图2所示，为该LFIA用于大肠杆菌O157:H7检测的结果图，对于细菌浓度大于等于103cfu mL-1的样品，检测后试纸条T线显色明显，检测限为103cfu mL-1；对于细菌浓度小于103cfu mL-1的样品，检测后试纸条T线不显色。
如图3所示，为Image J软件分析阳性样品以及阴性样品的曲线图。
如图4所示，为金-巯基苯硼酸纳米颗粒的透射电镜图，表明合成出来的金苯硼酸纳米颗粒形貌均一，呈球形，粒径为20nm左右，表明金苯硼酸纳米颗粒的成功合成。
如图5所示，为金-巯基苯硼酸纳米颗粒的紫外可见吸收光谱图，显示金苯硼酸纳米颗粒的紫外可见光吸收光谱图在525nm处有吸收峰，相对于金纳米颗粒红移了5nm，表明金苯硼酸纳米颗粒的成功合成。
如图6所示，为苯硼酸，金纳米颗粒，金苯硼酸纳米颗粒的红外光谱图。金苯硼酸纳米颗粒3452cm-1处的强吸收峰表明硼酸的O-H振动，1647cm-1附近的峰值归因于苯环的C＝C振动。此外，苯硼酸在2565cm-1处的吸收峰为S-H振动，而在金苯硼酸纳米颗粒中，由于Au-S键的生成，2565cm-1峰消失，表明金苯硼酸纳米颗粒的成功合成。
如图7所示，对于金-巯基苯硼酸纳米颗粒与细菌结合能力研究：以革兰阴性菌大肠杆菌O157:H7和革兰阳性菌金黄色葡萄球菌为例，将金-巯基苯硼酸纳米颗粒分别与大肠杆菌O157:H7、金葡萄球菌共孵育，扫描电镜图的红色箭头表示结合在大肠杆菌O157:H7和金葡萄球菌表面的纳米颗粒，表明金-巯基苯硼酸纳米颗粒与革兰阴性细菌或革兰阳性细菌均有很强的结合作用。
如图8所示，以108cfu mL-1的大肠杆菌O157:H7作为标准溶液进行参数优化，以T线平均灰度值作为判断标准，T线最高平均灰度值所对应的参数值作为最佳实验参数。细菌与纳米颗粒孵育100min，100μg/ml巯基苯硼酸修饰量，pH7.0的体系环境，10min免疫反应时间，80μl 5mg/ml的探针量作为最佳实验参数用于整个检测过程。
如图9所示，为该LFIA平台检测大肠杆菌O157：H7的标准曲线图，表明该LFIA检测大肠杆菌O157：H7的检测限为103cfu·mL-1，线性范围为103～107cfu·mL-1，R2＝0.9989。
如图10所示，为该LFIA在人工污染的饮用水，西瓜汁，牛奶，牛肉四种食物样品中的大肠杆菌O157：H7检测结果，检测限分别为104cfu·mL-1,105cfu·mL-1.106cfu·mL-1,106cfu·mL-1。
试纸条检测参数优化：本专利探讨了检测条件(巯基苯硼酸的修饰量、细菌悬液的pH值、滴加到样品垫上的金-巯基苯硼酸的体积、金-巯基苯硼酸与细菌的孵育时间、免疫反应时间)对实验结果的影响，以获得快速、准确的结果。所有这些参数都是使用得浓度为108cfu mL-1的大肠杆菌O157:H7标准溶液进行优化，以试纸条上检测线的灰度值为判断标准。
检测程序：以大肠杆菌O157：H7为例，取30-40μL金-巯基苯硼酸-细菌结合物滴加于试纸条的样品垫，金-巯基苯硼酸-细菌结合物往NC膜迁移，10min内可肉眼观察到NC膜出现红色条带(T线)，进行定性判断；用Image J软件分析T线灰度值并进行线性拟合制作标准曲线，可用于样品中大肠杆菌O157：H7定量判断。
实际样品中的应用：选择四种食物样品(饮用水、西瓜汁、牛奶和牛肉)来证明本侧流层析法在快速检测领域的广泛适用性。具体来说，先将这四种食物基质进行预处理，然后加入一系列浓度(0-108cfu/mL)的大肠杆菌O157:H7得到待检测样品溶液，按照上述检测程序进行检测，当加标浓度降低时，T线上的灰度值逐渐变小，与标准曲线吻合。四种食物基质中细菌检测限分别为104cfu/mL、105cfu/mL、106cfu/mL和106cfu/mL-1。

Claims (9)

1.一种基于巯基苯硼酸功能化金纳米颗粒的侧流层析试纸，其特征在于，所述侧流层析试纸包括平板(1)、样品垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸收垫(4)，所述样品垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸收垫(4)依次粘贴在平板(1)的单侧表面，所述硝酸纤维素膜(4)的表面包被检测线(5)，所述检测线(5)上包被病原微生物受体蛋白(6)，金-巯基苯硼酸-待测细菌结合物通过与检测线(5)上包被病原微生物受体蛋白(6)结合，将金-巯基苯硼酸纳米颗粒聚集于检测线；
所述金-巯基苯硼酸-细菌结合物，通过将巯基苯硼酸加入金纳米颗粒，制得巯基苯硼酸功能化的金纳米颗粒；将巯基苯硼酸功能化的金纳米颗粒加入待测细菌，混合后加入牛血清白蛋白得到金-巯基苯硼酸-细菌结合物；待检测细菌能与硝酸纤维素膜上的检测线包被的病原微生物受体蛋白进行特异性抗原抗体识别，金-巯基苯硼酸纳米颗粒聚集于检测线，出现T线条带，进行定性判断；用Image J软件分析T线灰度值，与标准曲线对比，实现定量判断样品中的细菌浓度。
2.根据权利要求1所述的侧流层析试纸，其特征在于，所述样品垫(2)和硝酸纤维素膜(3)的交界重叠1-2mm，硝酸纤维素膜(3)和吸收垫(4)的交界重叠1-2mm。
3.一种基于巯基苯硼酸功能化金纳米颗粒的侧流层析检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)巯基苯硼酸功能化的金纳米颗粒的制备：制备氯金酸溶液，加入还原剂，冷却静置得到金纳米颗粒，取金纳米颗粒，加入巯基苯硼酸，反应后乙醇洗涤，得到巯基苯硼酸功能化的金纳米颗粒；
(2)金-巯基苯硼酸-细菌结合物的制备：取单菌落加入培养基培养，取菌液加入培养基培养后得到细菌，取巯基苯硼酸功能化的金纳米颗粒加入待测细菌，混合后加入牛血清白蛋白，混合后得到了金-巯基苯硼酸-待测细菌结合物；
(3)侧流层析试纸条制备：将样品垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘贴到平板上彼此重叠1-2mm，组装成侧流层析试纸，所述硝酸纤维素膜的表面包被检测线，所述检测线上包被病原微生物受体蛋白；
(4)侧流层析检测方法：取步骤(2)制得的金-巯基苯硼酸-待测细菌结合物，滴加于试纸条的样品垫，样品液往硝酸纤维素膜迁移，待检测细菌能与硝酸纤维素膜上的检测线包被的病原微生物受体蛋白进行特异性抗原抗体识别，金-巯基苯硼酸纳米颗粒聚集于检测线，出现T线条带，进行定性判断；用Image J软件分析T线灰度值，与标准曲线对比，实现定量判断样品中的细菌浓度。
4.根据权利要求3所述的侧流层析检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述还原剂为柠檬酸钠，所述氯金酸溶液浓度为0.1％-10％，柠檬酸钠浓度为0.1％-10％，巯基苯硼酸浓度为0.1-1g/L。
5.根据权利要求3所述的侧流层析检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述细菌为革兰阳性菌或革兰阴性菌，所述细菌的浓度为0-108CFU/mL。
6.根据权利要求3所述的侧流层析检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合时间为0.5-2h。
7.根据权利要求4所述的侧流层析检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述样品垫的制备，具体为，将聚酯膜浸入样品垫处理液处理10-24h，之后在25-40℃烘干2-10h，得到样品垫。
8.根据权利要求3所述的侧流层析检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述硝酸纤维素膜的制备，具体为，将待检测细菌抗体以0.5-2μL/cm速率分配到硝酸纤维素膜上。
9.根据权利要求3所述的侧流层析检测方法，其特征在于，步骤(4)中，所述软件分析各细菌浓度下的T线灰度值，拟合制定标准曲线；根据待检测样品在T线灰度值，根据标准曲线，实现定量判断样品中的细菌浓度。
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