CN104897652B - 一步均相化学发光法进行小分子检测的方法及所用微粒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于兽药小分子检测的微粒，包括受体微粒和供体微粒，首先，用兽药分子标记载体蛋白；其次将标记好兽药分子的载体蛋白偶联在均相化学发光受体球珠上去；然后，制备偶联有兽药分子抗体的均相化学发光供体球珠。本发明还公开了利用上述微粒采取的一步均相化学发光法进行小分子检测的方法。本发明提供的一步法均相化学发光技术，用于均相、快速、高灵敏度的兽药残留检测，以及用于饲料中常见的兽药成分含量测试，如克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等。

Description

一步均相化学发光法进行小分子检测的方法及所用微粒

技术领域

本发明涉及一种用于小分子检测的一步法均相化学发光方法及所用微粒(包括受体微粒和供体微粒)。

背景技术

现代牧业的规模化和集成化生产日趋成熟，为保证畜禽快速健康地生长，越来越多的兽药用于实际养殖中，但不合理的兽药使用往往造成严重的兽药残留，对现代人的生活品质带来深远的社会问题。根据WHO组织的规定，兽药残留指动物产品的任何可食用部分所包含的原兽药及其代谢物和伴生的杂质。据报道，目前兽药残留已超过120类之多，而beta-兴奋剂(beta-肾上腺素能受体阻断剂)就是其中的一大类。

Beta-兴奋剂是一类苯乙醇胺类衍生物，临床上用来治疗哮喘、支气管痉挛等呼吸系统疾病，20世纪80年代发现，此类药物可减少脂肪积累，提高胴体肉脂比，促进骨骼肌生长，故被国内外很多养殖场用作食品添加剂，但人类食用含该类兽药超标的肉品后，易出现食物中毒、心血管疾病、新生儿畸形、提升肿瘤爆发率等病症，目前常被滥用的有克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林这几种。

克伦特罗(CBL)，CAS:129138-58-5，是一种平喘药，俗称“瘦肉精”，是最早被发现并滥用的beta类兴奋剂，CBL脂溶性好，吸收快，但在动物体内半衰期长，易残留，人食用含CBL的肉品危害甚大，现已禁止CBL用在动物养殖中。取而代之的是莱克多巴胺和沙丁胺醇等，它们在动物体内毒副作用小，清除时间短，而且增加瘦肉的效率非常高，一吨饲料中加入莱克多巴胺不到二十克，就可以让最后长肉阶段的猪增加24％的瘦肉，减少34％的脂肪。FDA规定莱克多巴胺在猪肉中允许值是50ppb(50微克/公斤)，牛肉中不得超过30ppb。沙丁胺醇、特布他林等却对人体健康危害过大，目前已在全球禁用。以下是这几种化合物的分子结构。

目前针对该类药物的检测方法主要有色谱技术、免疫吸附试验等。色谱技术包括HPLC、LC/MS、GC/MS、GC/FTIR等，可从动物的组织、毛发中检测出残留量，非常高效、敏感、准确，但设备费用昂贵，样品处理繁琐，一次处理的样本少，无法现场检测；免疫检测技术，如酶联免疫ELISA技术，利用待检测的样品与酶标物结合，产生OD值的变化，定量药品的残留值，一次可以检测多份样品。但该技术对于操作步骤多，对专业程度要求高，操作易出现假阳性结果，造成漏检误检；胶体金免疫层析试纸条是也被用于兽药残留检测，但是由于方法学的原因，检测灵敏度不高，稳定性差，容易出现假阳性。应国家食品检验部门和实际应用要求，研制灵敏，快速，准确的兽药检测方法，检测畜禽的可食用组织及饲料中兽药残留，特别是克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等几种，有着重要意义。

AlphaScreen(Amplified Luminscent Proximity Homogeneous Assay Screen)技术是一种基于微粒与微粒之间靠近的效应用于分析物的均相检测方法，是由1994年发明的LOCI(Luminescent Oxygen Channeling Assay)这种技术的基础上演化而来。供体含包裹有酞菁分子，受特殊波长680nm光激发，每秒可产生6万个以上单线态氧分子，放大信号，但单线态氧半衰期仅为4us，在有水介质中衰减快，最远可传输200nm距离，如果受体能通过一定方式，如抗体免疫吸附、亲和素-链霉素识别等，接近供体，则受体中的荧光基团可迅速吸收单线态氧，以上转换方式产生520-620nm光信号，为检测器探测到。

而Alphalisa则是在AlphaScreen技术的基础上，与经典的ELISA技术有相似之处的均相检测方法，我们称之为均相化学发光技术。因为这种方法不用洗涤，反应在均相跟中进行，其过程其实是个化学发光的过程。已广泛用于药物筛选，其检测原理如图1所示。

AlphaLISA方法的核心是供体(感光微粒)和受体(发光微粒)这两种直径约为200nm的微粒。在两种微粒表面与生物分子(抗体或抗原蛋白)相偶联，每个微粒表面可以覆盖成百上千个生物分子,可捕获待测分子。当微粒受到680nm的激光照射后,供体表面的光敏剂就会将溶液(AlphaLISA反应液)中的氧气转化为单线态氧。单线态氧在溶液中的传播距离约为200nm,如果供体和受体之间的距离小于200nm,单线态氧就能扩散至受体微粒,受体中的光敏化合物就能和单线态氧发生化学反应，其中Eu³⁺配合物就产生高能级的发光。相反,如果发光微粒和感光微粒的距离大于200nm,单体氧无法扩散至发光微粒,就不会有光信号的产生。AlphaLISA均相反应就是基于以上原理,如果包被在两种微粒表面的生物分子存在相互作用时,就拉近了两种微粒之间的距离,产生光信号。通过对光信号的强度检测,来判断实际检测样品中有无待测目标物。基于AlphaLISA技术的原理,分子复合物小于200nm的范围内都可被检测到。而其他均相技术,例如时间分辨荧光(TR-FRET)、荧光偏振(FP),供体和受体之间的距离只能在为10nm内,仅限于小分子的检测。AlphaLISA可以应用于酶活性、受体配体反应、DNA、RNA、蛋白、多肽、碳水化合物等检测。

均相化学发光检测生物分子，可以不用洗涤，这是它的一大优点。但是，这种方法也有其不足之处：①灵敏度在检测生物样本时往往较低(灵敏度一般仅为1ng/ml)。检测血液、尿液时，由于样本的基质效益及样本中的物质对发光微粒所发出的光有吸收作用，检测灵敏度没有在PBS等反应液中的高；②受体微粒中的物质为噻吩和Eu³⁺配合物，这些物质都要包裹在200nm的聚苯乙烯微球中，还要有合适的比例，制备困难；③微粒中的物质多，Eu³⁺配合物包裹量就少，这影响微粒的发光强度和量子产率，影响了灵敏度；④检测仪器昂贵，影响了该方法的推广。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新的一步法均相化学发光技术，用于均相、快速、高灵敏度的兽药残留检测，以及用于饲料中常见的兽药成分含量测试，如克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于兽药小分子检测的微粒，包括受体微粒和供体微粒：

一、受体微粒的制备方法为包括如下步骤：

①、将兽药小分子和载体蛋白偶联，经PBS透析，得到标记有兽药小分子的载体蛋白；所述兽药小分子与载体蛋白的摩尔比为10～50:1；

②、按照每0.05mmol的ATTA-Eu³⁺配用0.9～1.1g(较佳为1g)聚苯乙烯微球的用量比，在ATTA-Eu³⁺中加入聚苯乙烯微球溶液，超声包裹；得到含均相化学发光受体微粒的溶液；

③、在均相化学发光受体微粒表面包被标记有兽药小分子的载体蛋白：

将步骤②所得的含均相化学发光受体微粒的溶液进行清洗，得清洗后均相化学发光受体微粒；

取清洗后均相化学发光受体微粒0.2ml，加入0.09～0.11mg(较佳为0.1mg)标记有兽药小分子的载体蛋白，再加入9～11uL浓度为350～450mM的(较佳为10uL 400mM)氰基硼氢化钠溶液，室温旋转(转速为30～50rpm，例如为35rpm)反应18～24hrs后终止反应；所得的反应液经后处理(包括分散、洗涤离心等)，得标记有兽药小分子-载体蛋白的均相化学发光受体微粒(AlphaLISA Acceptor Beads)；

二、供体微粒的制备方法为：将醛基化AlphaLISA供体微球与上述兽药小分子相对应的抗体相偶联；包括如下步骤：

含有1mg醛基化AlphaLISA供体微球的溶液经离心和分散沉淀的处理后，加入0.09～0.11mg(较佳为0.1mg)与上述兽药小分子相对应的抗体和9～11uL浓度为350～450mM的(较佳为10uL 400mM)氰基硼氢化钠溶液，室温旋转(转速为30～50rpm，例如为35rpm)反应18～24hrs后终止反应；所得的反应液经后处理(包括分散、洗涤离心等)，得带有兽药小分子抗体的均相化学发光供体微粒(AlphaLISA Donor Beads)。

作为本发明的用于兽药小分子检测的微粒的改进：

所述步骤一的受体微粒的制备方法中：

所述步骤②中：

所述聚苯乙烯微球的粒径为175nm；所述超声包裹为200w超声5s，停顿5s；如此重复60次；

所述步骤③中：

含均相化学发光方法受体微粒的溶液进行清洗的方法为：将10ml含均相化学发光受体微粒的溶液离心，弃上清液后加入7～9ml(较佳为8ml)重悬液Ⅰ重悬浮；重复上述离心和重悬浮2～3次后再离心，得清洗后均相化学发光受体微粒；

所述重悬液Ⅰ为8ml 100mM Hepes(pH 7.4)，1.25uL 10％Tween-20；

即，重悬液Ⅰ的制备方法为：在8ml 100mM Hepes(pH 7.4)溶液(去离子水为溶剂)中，加入1.25uL 10％(体积浓度)Tween-20溶液(去离子水为溶剂)。

所述后处理为：将所得的反应液离心，离心所得沉淀用重悬液Ⅱ重悬后超声分散(用20～100w功率超声，10次，1s/次，2次之间的间隔时间为2s)，再离心，得标记有兽药小分子-载体蛋白的均相化学发光受体微粒；所述重悬液Ⅱ为100mM Tris-HCL pH8.0。

作为本发明的用于兽药小分子检测的微粒的进一步改进：

所述步骤二的供体微粒的制备方法中：

所述离心和分散沉淀的处理为：

取50uL浓度为20mg/mL的醛基化AlphaLISA供体球珠，加PBS缓冲液(pH＝7.4)稀释，离心，吸走上清，加200uL 100mM Hepes(pH 7.4)，1.25uL 10％Tween-20，分散沉淀；

上述“200uL 100mM Hepes(pH 7.4)，1.25uL 10％Tween-20”的制备方法为：在200uL100mM Hepes(pH 7.4)溶液(去离子水为溶剂)中，加入1.25uL 10％(体积浓度)Tween-20溶液(去离子水为溶剂)。

所述后处理为：反应液离心，所得沉淀用重悬液Ⅱ重悬后超声分散(用20～100w功率超声，10次，1s/次，2次之间的间隔时间为2s)，再离心，得带有兽药小分子抗体的均相化学发光供体微粒。

作为本发明的用于兽药小分子检测的微粒的进一步改进：

所述兽药小分子为盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林；

载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)；

供体微粒偶联的是兽药分子的抗体，兽药分子的抗体为鼠抗、兔抗、羊抗。

作为本发明的用于兽药小分子检测的微粒的进一步改进：

标记有兽药小分子-载体蛋白的均相化学发光受体微粒用保存液保存，得标记有兽药小分子-载体蛋白的均相化学发光受体微粒溶液；

带有兽药小分子抗体的均相化学发光供体微粒用保存液保存；得带有兽药小分子抗体的均相化学发光供体微粒溶液；

上述保存液均为PBS缓冲液(pH＝7.4)+0.05％Proclin-300。

保存液(PBS缓冲液(pH＝7.4)+0.05％Proclin-300)的制备方法为：PBS缓冲液(pH＝7.4)与Proclin-300按照100:0.05的体积比混合而得。

本发明还同时提供利用上述微粒采取的一步均相化学发光法进行小分子检测的方法：选用标记有兽药小分子-载体蛋白的均相化学发光受体微粒、带有兽药小分子抗体的均相化学发光供体微粒，包括如下步骤：

1)、动物组织样品预处理：

将待测动物组织利用液-液萃取法处理，得待测液；

将兽药小分子用PBS缓冲液(PH＝7.4)稀释至梯度浓度，作为定标品；

2)、将标记有兽药小分子-载体蛋白的均相化学发光受体微粒用分析缓冲液稀释至标记有兽药小分子-载体蛋白的均相化学发光受体微粒的浓度为0.04mg/mL；

将带有兽药小分子抗体的均相化学发光供体微粒用分析缓冲液稀释至带有兽药小分子抗体的均相化学发光供体微粒的浓度为0.04mg/mL；

将上述2种稀释液等体积混合，得混合液；

3)、采用竞争法进行加样检测：

将混合液与待测液/定标品等体积混合后，于37±0.2℃孵育14～16min(较佳为15min)，然后进行光激化学发光检测(可利用Lica HT型光激化学发光检测仪)；从而分别获得定标品浓度与荧光强度对应关系的标准曲线，以及获得待测液的荧光强度，将待测液的荧光强度代入上述标准曲线中，从而获得待测液的兽药小分子浓度值；最终获得待测动物组织兽药小分子浓度值。

作为本发明的一步均相化学发光法进行小分子检测的方法的改进：

分析缓冲液为：在25mM pH7.4的HEPES中，加入2mg/mL Dextran-500、50mmol/LNaCl、0.5％(w/v)BSA、0.02％(w/v)牛gama蛋白、0.1％(v/v)吐温20、0.01％(v/v)Proclin-300，充分溶解，过滤后4℃保存；

即，上述分析缓冲液的制备方法为：在每100ml的25mM pH7.4的HEPES中，加入200mg的Dextran-500、5mmol的NaCl、0.5g的BSA、0.02g的牛gama蛋白、0.1ml的吐温20、0.01ml的Proclin-300，充分溶解，过滤后4℃保存。

作为本发明的一步均相化学发光法进行小分子检测的方法的进一步改进：所述兽药小分子的梯度浓度为：10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL。

本发明的受体微粒和供体微粒的制备方法中：离心均是在10000～18000rpm、3～5℃离心，离心时间为10～60分钟。

本发明中的室温是指10～25℃。

在本发明中，分子量小于5000的属于小分子；克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的分子量分别为277.19，337.84，239.31。

在发明过程中，为了提高检测的灵敏度，并且使得均相化学发光的方法更加实用和易于推广，我们对受体微粒进行了改造。本发明采用Eu³⁺配合物单线态氧荧光探针4'-(9-蒽基)-2,2':6',2”-联三吡啶-6,6”-二甲胺四乙酸一Eu³⁺(ATTA-Eu³⁺)。该探针几乎不发荧光，与单线态氧特异性反应生成内氧化物后其荧光量子产率增加17倍，变为强荧光性物质。我们将该探针包裹进入聚苯乙烯微球后，新制备的受体微粒具有稳定性高、pH值使用范围宽、单线态氧选择性和灵敏度高及反应速率快等优点。比现有的受体微粒具有更高的灵敏度。

Eu³⁺配合物单线态氧荧光探针4'-(9-蒽基)-2,2':6',2”-联三吡啶-6,6”-二甲胺四乙酸一Eu³⁺(ATTA-Eu³⁺)的制备法在已公开发表的论文《新型稀土荧光探针及单线态氧的时间分辨荧光分析》中有明确告知。

本发明的小分子一步法均相化学发光检测步骤为：

1、两个微粒，一个连上抗体，一个连上抗原；

2、调试好比例后，冷冻干燥保存；

3、用前用水溶解；

4、检测时，加入样品，再加入微粒，放入仪器中温浴，读板；

本发明的优点：

1、抗原抗体先连到微粒上，省却了通常方法用的二抗和链霉亲和素，节省成本；

2、微粒冷冻干燥保存，增加了保存时间，可达1年，用前溶解，溶解后可使用6个月；而液体保存的产品(即，现有技术)，其保质期一般也只有6个月；

3、常规的均相化学发光技术，对于小分子用竞争法检测，通常是先加样品，再加抗体偶联的受体(或者是二抗偶联的受体微粒和一抗)，再加上小分子-BSA-biotin偶联抗原，温浴反应后，再加入链霉亲和素偶联的供体微粒。这种模式加样步骤多，反应时间长，检测结果误差大。本发明的一步法检测模式是：微孔板上加上样品，再预先混合好的“小分子-BSA-受体”和“抗体-供体”微粒，放入检测仪中温浴，到时间后仪器自动检测，电脑上显示结果。因此，本发明的一步法检测模式加样品和检测微粒都是连续加入，不需温浴后再加入另外一种。这种方法大大降低了检测人员的劳动强度，节约了时间。

4、本发明的一步法检测模式，反应的时间可以缩短到10分钟内。常规的均相化学发光模式，两步温浴的时间要在45分钟左右。一般的观念认为两种微粒同时加入，由于微粒体积比抗体及蛋白分子大，运动较慢，会影响反应速度。但发明人发现，对于小分子的检测不是这样的。小分子由于体积小，可以在液相环境下很快运动，微粒对它的位阻效应小。两种微粒预先反应，互相结合后同时加入反应体系，不会减少样品中自由的小分子和抗体碰撞的机会。因此不会影响检测时的反应时间。因此，本发明突破了常规的思维。

基于原有AlphaLISA技术基础，该发明的改进之处：受体微粒偶联的是标有兽药分子的载体蛋白，该类兽药分子可以是克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等，载体蛋白可以是牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等；供体微粒偶联的是兽药分子的抗体，兽药分子的抗体可以是鼠抗、兔抗、羊抗等。

该发明优点和改进之处：

通常的AlphaLISA技术用到的试剂都有三种以上，本方法只用了两种试剂(即为标记有小分子的载体蛋白-受体和抗体-供体)，由此带来的好处有：

1.两种试剂可提前预混合，缩短了反应三分之二的时间，显著提高检测效率；

2.同时也减少了许多操作中不可控因素，提升检测数据的可靠性。

3.显而易见的是，成本减少。

4.由于加样的简单化，可适用于不同层次人员的操作，如个体户养殖、畜产品加工、质量检测、海关检验检疫、专业化验等，易于应用和推广，市场前景更大。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为Alphalisa的检测原理图。

图2是一步法均相化学发光技术检测小分子原理图。

图3是一步法均相化学发光技术检测克伦特罗标准曲线，其中克伦特罗分别梯度稀释在PBS和尿液中。

图4是应用PE微粒检测克伦特罗标准曲线，其中克伦特罗分别梯度稀释在PBS和尿液中。

图5是一步法均相化学发光技术的试剂冷冻干燥后，每个月取出一份检测克伦特罗，连续取12个月，得到检测标准曲线。从而证明产品的稳定性。

图6是一步法均相化学发光技术检测莱克多巴胺标准曲线。

图7是一步法均相化学发光技术检测沙丁胺醇标准曲线。

具体实施方式

要实现该方法，需要经过以下几个步骤：

首先，用兽药分子标记载体蛋白；其次将标记好兽药分子的载体蛋白偶联在均相化学发光受体球珠上去；然后，制备偶联有兽药分子抗体的均相化学发光供体球珠。最后，在一定的分析缓冲液中加样检测。

实施例1-1、制备克伦特罗-BSA标记的均相化学发光受体微粒，以及鼠抗克伦特罗的均相化学发光供体微粒，用于一步法均相化学发光检测；依次进行以下步骤：

一、制备克伦特罗-BSA标记的均相化学发光受体微粒

①、将克伦特罗小分子标记BSA载体蛋白：

首先采用重氮法，将兽药小分子克伦特罗、载体蛋白-牛血清蛋白(BSA)，以一定摩尔比偶联，PBS透析，得到标记有小分子的载体蛋白。具体为：

将5mg(18.04umol)盐酸克伦特罗溶解于3-8℃预冷的稀盐酸(pH＝3.0)1ml中，加入10mg亚硝酸盐---亚硝酸钠(即，亚硝酸盐：克伦特罗的质量比为2:1)，室温反应6小时，待溶液颜色变黄；将载体蛋白-牛血清蛋白(BSA)先溶于PBS缓冲液(pH＝7.4)，然后按摩尔比25:1(n_兽药分子/n_载体蛋白)加入上述溶液中，室温搅拌过夜(12小时)，反应液用PBS透析(透析具体为：将反应溶液加入截留分子量为7000的透析袋中，放于PBS缓冲液(pH＝7.4)中4℃透析2-3天，每天更换3次PBS缓冲液)，即可得到连接克伦特罗的BSA载体蛋白。

备注说明：PBS缓冲液的用量只需保证载体蛋白-牛血清蛋白(BSA)能全部溶解即可。

②、制备偶联克伦特罗-BSA载体蛋白的均相化学发光受体微粒

将Eu³⁺配合物单线态氧荧光探针4'-(9-蒽基)-2,2':6',2”-联三吡啶-6,6”-二甲胺四乙酸-Eu³⁺(ATTA-Eu³⁺)包裹进入聚苯乙烯微球后，制备成了新的均相化学发光受体微粒，然后在新制备的受体微球(即，新的均相化学发光受体微粒)表面包被偶联克伦特罗-BSA载体蛋白。具体方法如下：

将36mg ATTA(0.05mmol)和18mg EuCl₃·6H₂O(0.05mmol)溶于10ml pH值10.5的碳酸盐缓冲液(NaHCO₃-NaOH缓冲液)中，室温下搅拌2小时后，得ATTA-Eu³⁺。

在上述0.05mmol的ATTA-Eu³⁺中加入10ml浓度为10％(w/v)的聚苯乙烯微球(购自于上海辉质科技有限公司，微球的粒径：diameter 175nm)溶液，超声包裹(200w超声5s，停顿5s；如此重复60次)；制备得到新的均相化学发光受体微粒。

备注说明：上述浓度为10％(w/v)的聚苯乙烯微球溶液，即，每1ml溶液中含有0.1g聚苯乙烯微球。

取10ml上述制备的新的均相化学发光受体微粒(粒径为175nm，内部为ATTA-Eu³⁺)离心清洗，转速为15000rpm，4℃离心1小时。离心后弃上清液，以8ml的重悬液Ⅰ重悬浮。重复上述离心清洗、重悬浮三次，最后再离心清洗(15000rpm，4℃离心1小时)。取清洗后的受体微粒0.2ml加入0.1mg上述克伦特罗-BSA，最后加10uL 400mM氰基硼氢化钠溶液，室温旋转(转速为35rpm)反应22hrs。用10uL CMO终止液[65mg/mL羧甲氧基羟氨半盐酸盐(CMO，即，羧甲基羟胺半盐酸盐)溶于800mM氢氧化钠溶液]继续反应1小时，消耗剩余活性基团(即，氰基)，从而终止反应。反应液以16000rpm 4℃离心15min，沉淀用200uL重悬液Ⅱ(100mMTris-HCL pH8.0)重悬，简短超声分散(用20～100w功率超声，10次，1s/次，2次之间的间隔时间为2s)，重复上述“离心--重悬--超声分散”2次后，再离心，经过上述洗涤离心后的微粒干燥(50℃干燥5分钟)后称量重量为1mg，最后用200uL保存液(PBS缓冲液(pH＝7.4)+0.05％Proclin-300)保存，得标记有克伦特罗-BSA的均相化学发光受体微粒溶液(5mg/mL)。

该标记有克伦特罗-BSA的均相化学发光受体微粒溶液(5mg/mL)能于4℃保存6个月。

备注说明：悬液Ⅰ为8ml 100mM Hepes(pH 7.4)，1.25uL 10％Tween-20；其制备方法为：在8ml 100mM Hepes(pH 7.4)溶液(去离子水为溶剂)中，加入1.25uL 10％(体积浓度)Tween-20溶液(水为溶剂)。

保存液(PBS缓冲液(pH＝7.4)+0.05％Proclin-300)的制备方法为：PBS缓冲液(pH＝7.4)与Proclin-300按照100:0.05的体积比混合而得。

二、制备偶联抗克伦特罗鼠抗的均相化学发光供体微粒

从PE公司购得粒径为175nm醛基化AlphaLISA供体微球，与抗克伦特罗的鼠单抗(购买于杭州百迈生物技术有限公司)相偶联。

具体如下：

取50uL浓度为20mg/mL的醛基化AlphaLISA供体球珠，加PBS缓冲液(pH＝7.4)稀释，16000rpm、4℃离心15min，吸走上清，加200uL 100mM Hepes(pH 7.4)，1.25uL 10％Tween-20，分散沉淀，加0.1mg克伦特罗的鼠抗，最后加10uL 400mM氰基硼氢化钠溶液，室温旋转(35rpm)反应22hrs。用10uL CMO终止液[65mg/mL羧甲氧基羟氨半盐酸盐(CMO)溶于800mM氢氧化钠]继续反应1小时，消耗剩余活性基团(即，氰基)，终止反应。反应液以16000rpm 4℃离心15min，沉淀用200uL 100mM Tris-HCL pH8.0重悬，简短超声分散微球(用20～100w功率超声，10次，1s/次，2次之间的间隔时间为2s)，重复上述“离心--重悬--超声分散”2次后，再离心，经过上述洗涤离心后的微粒干燥(50℃干燥5分钟)后称量重量为1mg，最后用200uL保存液(PBS缓冲液(pH＝7.4)+0.05％Proclin-300)保存，得带有克伦特罗抗体的AlphaLISA Donor Beads溶液(5mg/mL)。

该带有克伦特罗抗体的AlphaLISA Donor Beads溶液(5mg/mL)能于4℃保存6个月。

上述“200uL 100mM Hepes(pH 7.4)，1.25uL 10％Tween-20”的制备方法为：在200uL100mM Hepes(pH 7.4)溶液(去离子水为溶剂)中，加入1.25uL 10％(体积浓度)Tween-20溶液(水为溶剂)。

实施例1-2、检测

准备分析缓冲液：在25mM pH7.4的HEPES中，加入2mg/mL Dextran-500、50mmol/LNaCl、0.5％(w/v)BSA、0.02％(w/v)牛gama蛋白、0.1％(v/v)吐温20、0.01％(v/v)Proclin-300，充分溶解，过滤后4℃保存。

即，上述分析缓冲液的制备方法为：在每100ml的25mM pH7.4的HEPES中，加入200mg的Dextran-500、5mmol的NaCl、0.5g的BSA、0.02g的牛gama蛋白、0.1ml的吐温20、0.01ml的Proclin-300，充分溶解，过滤后4℃保存。

动物组织样品预处理：

动物组织处理得到克伦特罗：可利用液-液萃取法处理样品，先将组织pH值调到克伦特罗的pKa 8.0以上，使之呈单分子游离出来，用有机溶剂萃取即可，此方法可回收80％以上的克伦特罗样品。

备注说明：上述液-液萃取法处理从而获得“克伦特罗样品”可依照已经公开发表于《高效液相色谱-电化学检测法测定猪组织中的克伦特罗》的有机溶剂萃取法进行。

取克伦特罗标准品用PBS缓冲液(PH＝7.4)稀释至不同浓度值10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL，4℃保存，作为定标品。另取克伦特罗标准品用正常健康猪尿液(购买于杭州安旭生物技术有限公司)稀释至10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL。

加样检测：采用竞争法，用分析缓冲液将5mg/mL上述制备的均相化学发光供体和受体分别稀释125倍，检测时按1:1(V/V)提前混合，取混合液50uL加入96孔白色不透明荧光酶标板(购于上海博阳医疗仪器有限公司)，另加待测样品50uL，将96孔板放于Lica HT型光激化学发光检测仪(购于上海博阳医疗仪器有限公司)37℃孵育15min，启动检测即可。

所用检测仪器为：Lica HT型光激化学发光检测仪(购于上海博阳医疗仪器有限公司)；

检测条件为：37℃孵育15min，启动检测即可。

检测结果：

如图3，将(ATTA-Eu³⁺)包裹的微粒用于一步法均相化学发光技术，PBS梯度稀释的克伦特罗最低检测限为0.01ng/ml，与在尿液中检测的灵敏度基本相同。

实施例1-3、保存期的验证试验：

如图5，将(ATTA-Eu³⁺)包裹的微粒和供体微粒，都标记上克伦特罗相应的抗体或抗原(即，为上述制备而得得克伦特罗-BSA标记的均相化学发光受体微粒、偶联抗克伦特罗鼠抗的均相化学发光供体微粒)，加上微粒保护剂(具体为20％(w/v)葡萄糖20ul，10％(w/v)甘露醇20ul，0.5％(w/v)BSA 20ul，0.01％(v/v)Proclin-30020ul)直至浓度为5mg/mL，一起冷冻干燥后，每一个月取出一份用于检测PBS缓冲液(PH＝7.4)梯度稀释的克伦特罗标准品，连续取12个月(取平均值)，检测结果如图5所示，其检测灵敏度没有多大变化。

上述微粒保护剂的制备方法为：将浓度为20g/100ml的葡萄糖溶液20ul、浓度为10g/100ml的甘露醇溶液20ul，浓度为0.5g/100ml的BSA溶液20ul、体积浓度为0.01％的Proclin-300溶液20ul均匀混合后而得。

对比例1－1、将实施例1-1中的“ATTA-Eu³⁺受体微粒”改成“从PE公司购得的粒径为175nm的醛基化AlphaLISA供体微球”，其余同实施例1。

即，将实施例1-2中的“标记有克伦特罗-BSA的均相化学发光受体微粒(5mg/mL)”改成由如下方法制备而得：

从PE公司购得醛基AlphaLISA受体微球(粒径175nm)，偶联已标记克伦特罗的BSA蛋白。取50uL浓度为20mg/mL的醛基化AlphaLISA受体球珠，加PBS缓冲液(ph＝7.4)1ml稀释，16000rpm、4℃离心15min，吸走上清，加200uL 100mM Hepes(pH 7.4)，1.25uL 10％Tween-20，分散沉淀，加0.1mg上述克伦特罗-BSA，最后加10uL 400mM氰基硼氢化钠溶液，室温旋转反应18-24hrs。用10uL CMO终止液(65mg/mL羧甲氧基羟氨半盐酸盐(CMO)溶于800mM氢氧化钠)，继续反应1小时，消耗剩余活性基团(即，氰基)，终止反应。反应液以16000rpm 4℃离心15min，沉淀用200uL 100mM Tris-HCL pH8.0重悬，简短超声分散微球(用20～100w功率超声，10次，1s/次)，重复离心两次，经过洗涤离心后的微粒干燥后称量重量为1mg，最后用200uL保存液(200uL PBS+0.05％Proclin-300)保存，得标记有克伦特罗-BSA的均相化学发光受体微粒5mg/mL。

其余内容等同于实施例1-2。

应用PE公司的微粒，检测PBS和尿液中的克伦特罗，检测结果如图4所示，其最低检测限为0.1ng/ml，灵敏度降低10倍。并且在尿液中检测时，尿液对PE公司微粒影响较大，对检测实验结果有较大干扰。

对比例1-2、将实施例1-3中的微粒保护剂有“20％(w/v)葡萄糖20ul，10％(w/v)甘露醇20ul，0.5％(w/v)BSA 20ul，0.01％(v/v)Proclin-30020ul)”改成“10％(w/v)蔗糖、30％(w/v)甘露醇、50％(v/v)甘油)，其余同实施例1-3。

最终所得的检测效果为：检测结果不稳定，与图3所述的标准曲线标准差很大，灵敏度不高(仅为0.6ng/ml)。

对比例2-1、将实施例1-1中的“ATTA-Eu³⁺”改成“BSPDA-Eu³⁺”，其余等同于实施例1-1。然后如同实施例1-2进行检测，最终所得的检测效果为：检测灵敏度不高(仅为1ng/ml)，实验结果不稳定，发光强度弱(克伦特罗浓度为0ng/ml时对应的发光强度仅为10000)。

对比例2-2、将实施例1-1中的“PE公司购得的粒径为175nm醛基化AlphaLISA供体微球”改成“酞菁蓝聚苯乙烯微球”，其余等同于实施例1-1。然后如同实施例1-2进行检测，最终所得的检测效果为：检测灵敏度不高(仅为1ng/ml)，背景信号值高(为3000)，发光强度弱(克伦特罗浓度为0ng/ml时对应的发光强度仅为9000)。

实施例2-1、制备莱克多巴胺-BSA标记的AlphaLISA Acceptor Beads，以及鼠抗莱克多巴胺的AlphaLISA Donor Beads，用于AlphaLISA检测：

一、制备莱克多巴胺-BSA标记的均相化学发光受体微粒：

①、用莱克多巴胺标记BSA载体蛋白：

通过混合酸酐法将莱克多巴胺偶联于牛血清蛋白上。具体如下：称量60.8umol的莱克多巴胺，加入到用4mL吡啶溶解的24mg戊二酸酐溶液中，室温搅拌反应22小时，反应完毕后，用氮气吹干吡啶，得到莱克多巴胺-戊二酸酐半醛固体。向此固体中加入8mL混合溶剂(V_DMF/V_二恶烷＝1:1，即二甲基甲酰胺与二恶烷等体积混合而得)，52.4uL三丁胺，冰水浴10min，加入氯甲酸异丁酯28.8uL，室温反应1小时，使得莱克多巴胺活化，后逐滴加入到10mL pH8.5的BSA(100mg，1.52umol)硼酸钠中，1小时内滴加完成，室温搅拌过夜(即，作为兽药小分子的莱克多巴胺与载体蛋白的摩尔比为40:1)。反应液10000rpm、4℃离心10min，取上清，加入到截留分子量为7000的透析袋中，4℃用pH7.4PBS缓冲液透析三天，每天更换3次透析液，透析完成后，可用PEG包裹透析袋吸走部分水分，浓缩至需要的体积；得偶联莱克多巴胺-BSA载体蛋白。如有必要，可用层析法进一步提纯偶联物，以紫外吸收法测定莱克多巴胺-BSA浓度。

②、制备偶联莱克多巴胺-BSA载体蛋白的均相化学发光受体微粒：

取清洗后的ATTA-Eu³⁺受体微粒(实施例1-1所得)0.2ml加入0.1mg上述莱克多巴胺-BSA，最后加10uL 400mM氰基硼氢化钠溶液，室温旋转反应22hrs。用10uL CMO终止液(65mg/mL羧甲氧基羟氨半盐酸盐(CMO)溶于800mM氢氧化钠溶液)，继续反应1小时，消耗剩余活性基团(即，氰基)，终止反应。

反应液的后处理同实施例1-1，最终得标记有莱克多巴胺-BSA的均相化学发光受体微粒(5mg/mL)。

二、制备偶联抗克伦特罗鼠抗的均相化学发光供体微粒

将实施例1-1中的“克伦特罗的鼠单抗”改成“莱克多巴胺的鼠单抗”，其余同实施例1-1的步骤二，最终得带有莱克多巴胺抗体的均相化学发光供体微粒(5mg/mL)。

实施例2-2、

将实施例2-1所得的“标记有莱克多巴胺-BSA的均相化学发光受体微粒(5mg/mL)、带有莱克多巴胺抗体的均相化学发光供体微粒(5mg/mL)”分别对应替代实施例1-1所得的“标记有克伦特罗-BSA的均相化学发光受体微粒(5mg/mL)、带有克伦特罗抗体的均相化学发光供体微粒(5mg/mL)”；将标准品由“克伦特罗”改成“莱克多巴胺”；其余等同于实施例1-2。

检测结果如图6所述。根据图6，我们得知：将(ATTA-Eu³⁺)包裹的微粒用于一步法均相化学发光技术，PBS梯度稀释的莱克多巴胺最低检测限为0.015ng/ml。

实施例3-1、制备沙丁胺醇-BSA标记的均相化学发光受体微粒，以及鼠抗沙丁胺醇的均相化学发光供体微粒，用于AlphaLISA检测：

一、制备沙丁胺醇-BSA标记的均相化学发光受体微粒：

①、用沙丁胺醇标记BSA载体蛋白：

一般通过混合酸酐法将沙丁胺醇偶联于牛血清蛋白上。具体如下：称量1g硫酸沙丁胺醇，加5mL水完全溶解，半小时内逐滴加入浓度为1g/100ml的氢氧化钠溶液共5ml，溶液颜色由无色变淡黄色，旋干，加入适量(4ml)无水乙醇，去除白色沉降物，取滤液旋干，得到淡黄色的沙丁胺醇游离碱。称取100mg上述沙丁胺醇游离碱，加入5mL无水乙醇，完全溶解后，加入50.2mg丁二酸酐，室温反应3小时，旋干反应液，得到的白色固体用无水乙醇洗3次(每次无水乙醇的用量为2ml)，以去除未反应的原料，然后烘干白色固体，得到沙丁胺醇丁二酸酐衍生物。称取50mg上述衍生物，溶于3.5mL混合溶剂中(V_二氧六环/V_水/V_三乙胺＝25:2:0.3)，加入氯甲酸异丁酯3.8uL，继续反应2小时。取70uL反应液(含8.36umol的硫酸沙丁胺醇)，加入到含15mg(0.23umol)BSA的3mL 130mM pH8.1碳酸氢钠溶液中，室温搅拌过夜。然后，加入到截留分子量为7000的透析袋中，于4℃PBS缓冲液(PH＝7.4)中透析三天，每天更换3次透析液。透析完成后，保存于含0.01％叠氮钠的PBS缓冲液中，得到用沙丁胺醇标记的BSA载体蛋白。

②、制备偶联沙丁胺醇-BSA载体蛋白的均相化学发光受体微粒

取上述清洗后的ATTA-Eu³⁺受体微粒(实施例1-1所得)0.2ml加入0.1mg上述沙丁胺醇-BSA,最后加10uL 400mM氰基硼氢化钠溶液，室温旋转反应22hrs。用10uL CMO终止液(65mg/mL羧甲氧基羟氨半盐酸盐(CMO)溶于800mM氢氧化钠溶液)，继续反应1小时，消耗剩余活性基团(即，氰基)，终止反应。

反应液的后处理同实施例1-1，最终得标记有沙丁胺醇-BSA的均相化学发光受体微粒(5mg/mL)。

二、制备偶联抗沙丁胺醇鼠抗的均相化学发光供体微粒

将实施例1-1中的“克伦特罗的鼠单抗”改成“沙丁胺醇的鼠单抗”，其余同实施例1-1的步骤二，最终得带有沙丁胺醇抗体的均相化学发光供体微粒(5mg/mL)。

实施例3-2、

将实施例3-1所得的“标记有沙丁胺醇-BSA的均相化学发光受体微粒(5mg/mL)、带有沙丁胺醇抗体的均相化学发光供体微粒(5mg/mL)”分别对应替代实施例1-1所得的“标记有克伦特罗-BSA的均相化学发光受体微粒(5mg/mL)、带有克伦特罗抗体的均相化学发光供体微粒(5mg/mL)”；将标准品由“克伦特罗”改成“莱克多巴胺”；其余等同于实施例1-2。

检测结果如图7所述。根据图7，我们得知：将(ATTA-Eu³⁺)包裹的微粒用于一步法均相化学发光技术，PBS梯度稀释的沙丁胺醇最低检测限为0.01ng/ml。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (8)

1.用于兽药小分子检测的微粒，包括受体微粒和供体微粒，其特征是：

一、受体微粒的制备方法为包括如下步骤：

①、将兽药小分子和载体蛋白偶联，经PBS透析，得到标记有兽药小分子的载体蛋白；所述兽药小分子与载体蛋白的摩尔比为10～50:1；

②、按照每0.05mmol的ATTA-Eu³⁺配用0.9～1.1g聚苯乙烯微球的用量比，在ATTA-Eu³⁺中加入聚苯乙烯微球溶液，超声包裹；得到含均相化学发光受体微粒的溶液；

所述ATTA-Eu³⁺为Eu³⁺配合物单线态氧荧光探针4'-(9-蒽基)-2,2':6',2”-联三吡啶-6,6”-二甲胺四乙酸一Eu³⁺；

所述聚苯乙烯微球的粒径为175nm；

③、在均相化学发光受体微粒表面包被标记有兽药小分子的载体蛋白：

将步骤②所得的含均相化学发光受体微粒的溶液进行清洗，得清洗后均相化学发光受体微粒；

取清洗后均相化学发光受体微粒0.2ml，加入0.09～0.11mg标记有兽药小分子的载体蛋白，再加入9～11uL浓度为350～450mM的氰基硼氢化钠溶液，室温旋转反应18～24hrs后终止反应；所得的反应液经后处理，得标记有兽药小分子-载体蛋白的均相化学发光受体微粒；

二、供体微粒的制备方法为：将醛基化AlphaLISA供体微球与上述兽药小分子相对应的抗体相偶联，所述醛基化AlphaLISA供体微球的粒径为175nm；包括如下步骤：

含有1mg醛基化AlphaLISA供体微球的溶液经离心和分散沉淀的处理后，加入0.09～0.11mg与上述兽药小分子相对应的抗体和9～11uL浓度为350～450mM的氰基硼氢化钠溶液，室温旋转反应18～24hrs后终止反应；所得的反应液经后处理，得带有兽药小分子抗体的均相化学发光供体微粒。

2.根据权利要求1所述的用于兽药小分子检测的微粒，其特征是：

所述步骤一的受体微粒的制备方法中：

所述步骤②中：

所述超声包裹为200w超声5s，停顿5s；如此重复60次；

所述步骤③中：

含均相化学发光受体微粒的溶液进行清洗的方法为：将10ml含均相化学发光受体微粒的溶液离心，弃上清液后加入7～9ml重悬液Ⅰ重悬浮；重复上述离心和重悬浮2～3次后再离心，得清洗后均相化学发光受体微粒；

所述重悬液Ⅰ为8ml pH 7.4的100mM Hepes，1.25uL 10％Tween-20；

所述后处理为：将所得的反应液离心，离心所得沉淀用重悬液Ⅱ重悬后超声分散，再离心，得标记有兽药小分子-载体蛋白的均相化学发光受体微粒；所述重悬液Ⅱ为100mMTris-HCLpH8.0。

3.根据权利要求2所述的用于兽药小分子检测的微粒，其特征是：

所述步骤二的供体微粒的制备方法中：

所述离心和分散沉淀的处理为：

取50uL浓度为20mg/mL的醛基化AlphaLISA供体微球，加pH7.4的PBS缓冲液稀释，离心，吸走上清，加200uL pH 7.4的100mM Hepes，1.25uL 10％Tween-20，分散沉淀；

所述后处理为：反应液离心，所得沉淀用重悬液Ⅱ重悬后超声分散，再离心，得带有兽药小分子抗体的均相化学发光供体微粒。

4.根据权利要求3所述的用于兽药小分子检测的微粒，其特征是：

所述兽药小分子为盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林；

载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、人血清白蛋白及人工合成的多聚赖氨酸；

供体微粒偶联的是兽药分子的抗体，兽药分子的抗体为鼠抗、兔抗、羊抗。

5.根据权利要求1～4任一所述的用于兽药小分子检测的微粒，其特征是：

标记有兽药小分子-载体蛋白的均相化学发光受体微粒用保存液保存，得标记有兽药小分子-载体蛋白的均相化学发光受体微粒溶液；

带有兽药小分子抗体的均相化学发光供体微粒用保存液保存，得带有兽药小分子抗体的均相化学发光供体微粒溶液；

上述保存液均为pH7.4的PBS缓冲液+0.05％Proclin-300。

6.利用权利要求1～5任一所述的微粒采取的一步均相化学发光法进行小分子检测的方法，其特征是：选用标记有兽药小分子-载体蛋白的均相化学发光受体微粒、带有兽药小分子抗体的均相化学发光供体微粒，包括如下步骤：

1)、动物组织样品预处理：

将待测动物组织利用液-液萃取法处理，得待测液；

将兽药小分子用pH7.4的PBS缓冲液稀释至梯度浓度，作为定标品；

2)、将标记有兽药小分子-载体蛋白的均相化学发光受体微粒用分析缓冲液稀释至标记有兽药小分子-载体蛋白的均相化学发光受体微粒的浓度为0.04mg/mL；

将带有兽药小分子抗体的均相化学发光供体微粒用分析缓冲液稀释至带有兽药小分子抗体的均相化学发光供体微粒的浓度为0.04mg/mL；

将上述2种稀释液等体积混合，得混合液；

3)、采用竞争法进行加样检测：

将混合液与待测液/定标品等体积混合后，于37±0.2℃孵育14～16min，然后进行光激化学发光检测；从而分别获得定标品浓度与荧光强度对应关系的标准曲线，以及获得待测液的荧光强度，将待测液的荧光强度代入上述标准曲线中，从而获得待测液的兽药小分子浓度值；最终获得待测动物组织兽药小分子浓度值。

7.根据权利要求6所述的一步均相化学发光法进行小分子检测的方法，其特征是：

分析缓冲液为：在25mM pH7.4的HEPES中，加入2mg/mL Dextran-500、50mmol/L NaCl、0.5％(w/v)BSA、0.02％(w/v)牛gama蛋白、0.1％(v/v)吐温20、0.01％(v/v)Proclin-300，充分溶解，过滤后4℃保存。

8.根据权利要求7所述的一步均相化学发光法进行小分子检测的方法，其特征是：所述兽药小分子的梯度浓度为：10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL。