CN101215330B - 一种1-氨基乙内酰脲人工抗原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种1-氨基乙内酰脲人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。本发明以1-氨基乙内酰脲为原料，在搅拌下与对醛基苯甲酸反应，合成半抗原1-氨基乙内酰脲缩对醛基苯甲酸(CPAHD)，再采用碳二亚胺法将半抗原上的羧基与牛血清蛋白(BSA)上的氨基进行偶联，制备人工抗原。本发明合成了1-氨基乙内酰脲的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
Description
技术领域
一种1-氨基乙内酰脲人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
1-氨基乙内酰脲，英文名称：1-aminohydantoin hydrochloride(AHD)，CAS#2827567，结构式为NH2NCH2CONHCO，是硝基呋喃类药物呋喃妥因在动物体内的代谢产物。硝基呋喃类药物可用于防治水生动物疾病和水生动物养殖环境的消毒，也可用于防治畜禽肠道感染，应用比较广泛。硝基呋喃类药物进入动物体内后，由于稳定性较差很快分解，以代谢物的形式与动物组织蛋白结合形成稳定的化合物。由于硝基呋喃类药物的强毒性和致癌的副作用，已引起了世界各国的高度重视并禁止使用。由于这种违禁药品的违规使用，造成在动物体内残留，但目前国内的检测技术多停留于原药的检测，关于代谢物的检测研究很少，有的也只限于仪器检测。随着国际标准的提高，我国贸易的国际化，这种检测技术已经不能满足要求，有必要研究更有效快捷的检测方法——酶联免疫技术(ELISA)。到目前为止，国内尚没有针对呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲的酶联免疫检测的人工抗原报道，为了弥补这一空白，有必要提供一种有效的1-氨基乙内酰脲的人工抗原的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲人工抗原的制备方法，所制备的产品可用于呋喃妥因免疫分析方法的研究，为今后人们的研究提供了方便的途径。
本发明的技术方案：第一步为半抗原的制备及检测，以1-氨基乙内酰脲为原料，在搅拌下与对醛基苯甲酸反应，合成半抗原1-氨基乙内酰脲缩对醛基苯甲酸(CPAHD)；第二步为人工抗原的制备及检测，采用碳二亚胺法将半抗原1-氨基乙内酰脲缩对醛基苯甲酸上的羧基与牛血清蛋白(BSA)上的氨基进行偶联，制备人工抗原1-氨基乙内酰脲-牛血清蛋白。其反应方程式为：
工艺步骤为：
(1)人工半抗原的制备：在安装有磁力搅拌器装置的烧杯中加入蒸馏水10mL，1mol/L HCl 5mL和对醛基苯甲酸0.01-0.015mol，缓慢滴加N，N-二甲基甲酰胺至对醛基苯甲酸完全溶解，搅拌中加入1-氨基乙内酰脲0.02-0.03mol，1-氨基乙内酰脲的摩尔用量为对醛基苯甲酸摩尔用量的两倍，整个反应温度控制在20-30℃，控制反应2小时；
提纯：将反应液过滤得到白色固体，用10mL蒸馏水洗涤然后过滤，重复2-3次，放入真空干燥箱内30℃干燥，得到人工半抗原1-氨基乙内酰脲缩对醛基苯甲酸(CPAHD)。
反应终点监测：硅胶薄层板的制作，称取硅胶12g，溶解在40ml 0.5％质量浓度的羟甲基纤维素钠溶液中，用玻璃棒充分搅拌成糊状，超声波振荡1分钟，均匀涂布在玻璃板上，置于阴凉处自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，最后放入干燥箱中备用。
硅胶薄层层析法(TLC)检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1ul点于划线处，点样结束，吹干，将薄板放入层析液缸中，层析液是甲醇/氯仿，体积比1∶19，展开层析至5-6cm处，取板，吹干溶剂。将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察。在RF＝0.3-0.32可观察到对应的点。
(2)人工抗原的制备：
制备A液：称取0.1mmol半抗原于25ml烧杯中，加入2ml二甲基甲酰胺，搅拌中加入二环己基碳二亚胺(DCC)0.15mmol，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.15mmol，4℃下搅拌反应过夜，4000rpm离心15min，上清液为A液。
硼酸盐缓冲液：0.2mol/L硼酸：硼酸12.37g加水至1000ml，0.05mol/L硼砂：硼砂19.07g加水至1000ml，将上述两溶液以体积比2∶8的比例混合即为ph9.0的硼酸盐缓冲液。
制备B液：称取162.5mg的牛血清蛋白溶于10ml的ph9.0硼酸盐缓冲液，低温保存。此液为B液。
在低温搅拌下，将A液缓慢逐滴加入B液，4℃条件下搅拌反应4h，即得到人工抗原混合液。
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min， 保存在4℃去离子水中备用。
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.05M的碳酸氢钠溶液和2×2L的去离子水透析4-6天。透析完成后4000rpm离心15min，最后使用冻干法将上清液制成粉末，即得到人工抗原：1-氨基乙内酰脲-牛血清蛋白。
(3)1-氨基乙内酰脲人工抗原的鉴定
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的.分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制半抗原1-氨基乙内酰脲缩对醛基苯甲酸(CPAHD)浓度为0，10，20，30μg·ml-1的20％N，N-二甲基甲酰胺溶液，通过紫外扫描可知半抗原的最大吸收波长为298nm，在298nm处测吸光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为：ε＝吸光值/摩尔浓度。本实验计算得ε＝18706.27L·mol-1
偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg·ml-1的牛血清蛋白溶液1.5ml，加入5ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样。在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得抗原溶液的蛋白浓度为7.8mg·ml-1，抗原溶液最大吸收波长为299nm。
偶联比测定：配制150μg·ml-1牛血清蛋白的20％乙醇溶液，将偶联产物用20％乙醇稀释到150μg·ml-1，在299nm处测吸光值，以20％乙醇为空白，测出的吸光值为A1，A2，则偶联比率r为：γ＝[(A1-A2)/ε]/(150×10-3/65000)，本实验计算得r≈20
其中ε为摩尔吸光系数(L·mol-1)，65000为牛血清蛋白的分子量，150×10-3为牛血清蛋白浓度(μg·ml-1)。
本发明的有益效果：本发明合成了1-氨基乙内酰脲的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
附图说明
图11-氨基乙内酰脲人工半抗原的液相色谱图
图21-氨基乙内酰脲人工半抗原的质谱图
图31-氨基乙内酰脲人工半抗原的紫外图
图41-氨基乙内酰脲人工抗原制备前后的紫外扫描图
具体实施方式
实施例1
(1)人工半抗原的制备：
称取3g(0.026mol)的1-氨基乙内酰脲，在安装有磁力搅拌器装置的烧杯中加入蒸馏水10mL，1mol/L HCl5mL和对醛基苯甲酸2g(0.013mol)，缓慢滴加N，N-二甲基甲酰胺(DMF)至对醛基苯甲酸完全溶解，搅拌中加入1-氨基乙内酰脲3g(0.026mol)，整个反应温度控制在20-30℃，控制反应2小时。
提纯：将反应液过滤得到白色固体，用10mL蒸馏水洗涤然后过滤，重复2-3次，放入真空干燥箱内30℃干燥，得到人工半抗原1-氨基乙内酰脲缩对醛基苯甲酸(CPAHD)。
反应终点监测：硅胶薄层板的制作，称取硅胶12g，溶解在40ml0.5％质量浓度的羟甲基纤维素钠溶液中，用玻璃棒充分搅拌成糊状，超声波振荡1分钟，均匀涂布在玻璃板上，置于阴凉处自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，最后放入干燥箱中备用。
硅胶薄层层析法(TLC)检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1ul点于划线处，点样结束，吹干，将薄板放入层析液缸中，层析液是甲醇/氯仿，体积比1∶19，展开层析至5-6cm处，取板，吹干溶剂。将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察。在RF＝0.3-0.32可观察到对应的点。
(2)人工抗原的制备：
制备A液：称取0.1mmol半抗原于25ml烧杯中，加入2ml二甲基甲酰胺，搅拌中加入二环己基碳二亚胺(DCC)0.15mmol，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.15mmol，4℃下搅拌反应过夜，4000rpm离心15min，上清液为A液。
硼酸盐缓冲液：0.2mol/L硼酸：硼酸12.37g加水至1000ml，0.05mol/L硼砂：硼砂19.07g加水至1000ml，将上述两溶液以体积比2∶8的比例混合即为ph9.0的硼酸盐缓冲液。
制备B液：称取162.5mg的牛血清蛋白溶于10ml的ph9.0硼酸盐缓冲液，低温保存。此液为B液。
在低温搅拌下，将A液缓慢逐滴加入B液，4℃条件下搅拌反应4h，即得到人工抗原混合液。
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.05M的碳酸氢钠溶液和2×2L的去离子水透析4-6天。透析完成后4000rpm离心15min，最后使用冻干法将上清液制成粉末，即得到人工抗原：1-氨基乙内酰脲-牛血清蛋白。
(3)1-氨基乙内酰脲人工抗原的鉴定
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的.分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制半抗原1-氨基乙内酰脲缩对醛基苯甲酸(CPAHD)浓度为0，10，20，30μg·mL-1的20％N，N-二甲基甲酰胺溶液，通过紫外扫描可知半抗原的最大吸收波长为298nm，在298nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为：ε＝吸光值/摩尔浓度。本实验计算得ε＝18706.27L·mol-1
偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg·mL-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得抗原溶液的蛋白浓度为7.8mg·mL-1，抗原溶液最大吸收波长为299nm。
偶联比测定：配制150μg·mL-1牛血清蛋白的20％乙醇溶液，将偶联产物用20％乙醇稀释到150μg·mL-1，在299nm处测吸光值，以20％乙醇为空白，测出的吸光值为A1，A2，则偶联比率r为：
γ＝[(A1-A2)/ε]/(150×10-3/65000)，
本实验计算得γ≈20
其中ε为摩尔吸光系数(L·mol-1)，65000为牛血清蛋白的分子量，150×10-3为牛血清蛋白浓度(μg·mL-1)。
Claims (1)
1.一种呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲人工抗原的制备方法，其特征是以1-氨基乙内酰脲为原料，在搅拌下与对醛基苯甲酸反应，制备人工半抗原1-氨基乙内酰脲缩对醛基苯甲酸；利用碳二亚胺法将1-氨基乙内酰脲缩对醛基苯甲酸半抗原上的羧基与牛血清蛋白上的氨基进行偶联，制备1-氨基乙内酰脲人工抗原，即1-氨基乙内酰脲-牛血清蛋白；步骤为：
1)人工半抗原的制备：在安装有磁力搅拌器装置的烧杯中加入蒸馏水10mL，1mol/L HCl 5mL和对醛基苯甲酸0.01-0.015mol，缓慢滴加N，N-二甲基甲酰胺至对醛基苯甲酸完全溶解，搅拌中加入1-氨基乙内酰脲0.02-0.03mol，1-氨基乙内酰脲的摩尔用量为对醛基苯甲酸摩尔用量的两倍，整个反应温度控制在20-30℃，控制反应2小时；
提纯：将反应液过滤得到白色固体，用10mL蒸馏水洗涤然后过滤，重复2-3次，放入真空干燥箱内30℃干燥，得到人工半抗原1-氨基乙内酰脲缩对醛基苯甲酸；
反应终点监测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于划线处，点样结束，吹干，将薄板放入层析液缸中，层析液是甲醇/氯仿，体积比1∶19，展开层析至5-6cm处，取板，吹干溶剂，将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在RF＝0.3-0.32可观察到对应的点；
2)人工抗原的制备：
制备A液：称取0.1mmol半抗原1-氨基乙内酰脲缩对醛基苯甲酸于25mL烧杯中，加入2mL二甲基甲酰胺，搅拌中加入二环己基碳二亚胺0.15mmol，N-羟基琥珀酰亚胺0.15mmol，4℃下搅拌反应过夜，4000rpm离心15min，上清液为A液；
制备B液：称取162.5mg的牛血清蛋白溶于10mL的pH9.0硼酸盐缓冲液中，低温保存，此液为B液；
在低温搅拌下，将A液缓慢逐滴加入B液中，4℃条件下搅拌反应4h，即得到人工抗原混合液；
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.05M的碳酸氢钠溶液和2×2L的去离子水透析4-6天，透析完成后4000rpm离心15min，最后使用冻干法将上清液制成粉末，即得到人工抗原1-氨基乙内酰脲-牛血清蛋白。
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