CN103360488B - 一种茶碱人工抗原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种茶碱人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测：用5,6-二氨基-1,3-二甲基脲嘧啶(1)和戊二酸酐反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备茶碱的人工抗原即茶碱-牛血清蛋白。所制备的茶碱人工抗原可进行动物免疫，取得相应的茶碱抗体，可用于各种茶碱类免疫分析法的研究，为茶碱的检测提供更加方便快速准确的途径。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种茶碱人工抗原的制备方法。
背景技术
茶碱（Theophylline） 别名为：二氧二甲基嘌呤；水合茶叶碱；茶叶碱；茶碱是甲基嘌呤类药物。具有强心、利尿、扩张冠状动脉、松弛支气管平滑肌和兴奋中枢经系统等作用。主要用于治疗支气管哮喘、肺气肿、支气管炎、心脏性呼吸困难。其结构式为：
茶碱属中枢兴奋剂 ,可增强大脑皮层的兴奋过程 ，亦有兴奋心肌的作用，茶碱在临床上主要用来治疗障碍性呼吸紊乱和早产儿的窒息 。如过量使用将会导致心肌过度兴奋,心悖惊厥，血压剧降, 最终导致的呼吸血管运动瘫痪，虚脱而死。注射速度太快或过量将引起中毒，如剂量不够则不能达到应有的药效。因此 ,观察和快速监测临床上茶碱的用药情况是非常必要的。
目前，对茶碱的检测主要依靠高效液相色谱法（HPLC）,气相色谱（GC），薄层色谱（TLC），质朴（MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速，准确的要求。而免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法, 该方法的前提就是需要提供特异性的抗原和抗体。因此有必要提供一种有效的茶碱人工抗原的制备方法,制备的茶碱人工抗原可用于免疫制备具有特异性的茶碱抗体,进一步用于检测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种茶碱人工抗原的制备方法，所制备的茶碱人工抗原可进行动物免疫，取得相应的茶碱抗体，可用于各种茶碱类免疫分析法的研究，为茶碱的检测提供更加方便快速准确的途径。
一种茶碱人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 制备人工半抗原：
(a) 将5,6-二氨基-1,3-二甲基脲嘧啶和戊二酸酐以摩尔比为1︰2加入圆底烧瓶中，室温下搅拌反应17小时；反应结束后反应液用油泵转干得到黄色固体产物；薄层层析检测：层析液体积比：无水乙醇︰浓氨水︰CHCL2︰1,4二氧六环=8︰1︰10︰1，产物Rf =0.2；
(b) 向上一步产物中加入2N 的NaOH溶液75℃回流反应1.5 小时，经热水重结晶得到固体产物，即茶碱半抗原；薄层层析检测：层析液体积比：无水乙醇︰浓氨水︰CHCL2︰1,4二氧六环=8︰1︰10︰1，产物Rf =0.3；
(2) 制备茶碱人工抗原：
(c) 将茶碱半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺以摩尔比为1︰1.5︰1.5溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心取上清液记为A液；
(d) 将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3︰4.2︰1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4；
(e) 将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；
(f) 将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1︰5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；
(g) 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：茶碱-牛血清蛋白。
由于茶碱的分子量较小，单独作用时不具有免疫原性或免疫原性较弱，因此必须将其与大分子载体比如牛血清蛋白连接形成茶碱抗原后，才能刺激机体产生相应的茶碱抗体。本发明在制备茶碱人工抗原过程中，所选的位点和交联方法都没有明显改变其结构，保留了抗原决定簇。在茶碱半抗原和牛血清蛋白之间引入桥结构，暴露抗原决定簇，所获得的茶碱人工抗原保持了茶碱的结构特异性，有利于相应茶碱抗体的产生。
本发明的技术方案分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：以5,6-二氨基-1,3-二甲基脲嘧啶(1)和戊二酸酐反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备茶碱的人工抗原即茶碱-牛血清蛋白。其反应方程式如下：
本发明制备得到的茶碱人工抗原可通过以下方法进行鉴定：
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法虽然很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制茶碱半抗原浓度为0, 5, 10, 20, 30, 40ug/ml的PBS溶液，通过紫外扫面图可知茶碱半抗原的最大吸收波长为274nm，在274nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为ε=吸光值/摩尔浓度。本发明计算得ε=4595.29L/mol
偶联物蛋白浓度的测定：配制浓度为0, 10, 20, 30, 40，60, 80, 100, 120ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例吸收，在655处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。本发明计算得茶碱抗原的蛋白浓度为2.151mg/ml。
偶联比测定：配制100ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液，将偶联物用PBS稀释到100ug/ml，在275处测得吸光值，以PBS为空白，测得吸光值A1, A2, 则偶联比率γ为：γ=[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/65000), 本发明计算得γ≈22。
其中ε为摩尔吸光系数（L/mol),65000为牛血清蛋白的分子量，100×10-3 为牛血清蛋白浓度（ug/ml）。
本发明的有益效果：本发明合成了茶碱的人工抗原，合成工艺先进，特异性强，得到的茶碱人工抗原用于免疫新西兰白兔，检测结果表明，茶碱人工抗原的免疫血清的效价为1：86000，完全可用于免疫分析中，为茶碱的检测提供更加方便快速准确的途径。
附图说明
图1是茶碱人工半抗原的液相色谱图。
图2是茶碱人工半抗原的质谱图。
图3是茶碱人工抗原制备前后的紫外扫描图。
具体实施方式
茶碱人工抗原制备分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：以5,6-二氨基-1,3-二甲基脲嘧啶（1）和戊二酸酐反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备茶碱的人工抗原即茶碱-牛血清蛋白。
实施例1
(1) 制备人工半抗原：
(a) 将500mg的5,6-二氨基-1,3-二甲基脲嘧啶(1)加入圆底烧瓶中，加入10ml的DMF溶液，再加入500mg的戊二酸酐，室温下搅拌反应17小时；反应结束后，反应液用油泵转干得到942mg黄色固体产物(2)；TLC检测：层析液为（无水乙醇︰浓氨水︰CHCL2 ︰1,4二氧六环=8︰1︰10︰1，v/v)产物Rf =0.2。
(b) 向上一步产物中加入15ml的2N 的NaOH溶液，75℃油浴中回流反应1.5 小时，反应结束后，冷却，用6N盐酸调PH=3.,出现大量沉淀，过滤回收固体。然后经热水重结晶得到240mg固体产物（3）；TLC检测：层析液为（无水乙醇︰浓氨水︰CHCL2 ︰1,4二氧六环=8︰1︰10︰1，v/v)产物Rf =0.3；
(2) 制备茶碱人工抗原：
(c)称取240mg茶碱半抗原(3)于50 ml圆底烧瓶中，加入12 ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入240 mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和346mg环己基碳酰二亚胺(DCC) ，室温搅拌反应18小时，反应结束离心取上清液记为A液。
(d) 称取14.5g十二水磷酸氢二钠，43.875g氯化钠，1.495g二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到PBS缓冲液，pH为7.4。
(e) 称取0.3g牛血清蛋白溶于50mlPBS缓冲液中，得到的溶液记为B液。
(f) 在快速搅拌下，将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1︰5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
(g) 将人工抗原混合液移入透析袋中，用上述PBS缓冲液透析9次，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：茶碱-牛血清蛋白。图3是茶碱人工抗原制备前后的紫外扫描图。
(3)茶碱人工抗原的鉴定：
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法虽然很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制茶碱半抗原浓度为0, 5, 10, 20, 30, 40ug/ml的PBS溶液，通过紫外扫面图可知茶碱半抗原的最大吸收波长为274nm，在274nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为ε=吸光值/摩尔浓度。本发明计算得ε=4595.29L/mol
偶联物蛋白浓度的测定：配制浓度为0, 10, 20, 30, 40，60, 80, 100, 120ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例吸收，在655处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。本发明计算得茶碱抗原的蛋白浓度为2.151mg/ml。
偶联比测定：配制100ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液，将偶联物用PBS稀释到100ug/ml，在275处测得吸光值，以PBS为空白，测得吸光值A1, A2,则偶联比率γ为：γ=[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/65000), 本发明计算得γ≈22。
其中ε为摩尔吸光系数（L/mol),65000为牛血清蛋白的分子量，100×10-3 为牛血清蛋白浓度（ug/ml）。
Claims (1)
1.一种茶碱人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 制备人工半抗原：
(a) 将5,6-二氨基-1,3-二甲基脲嘧啶和戊二酸酐以摩尔比为1︰2加入圆底烧瓶中，室温下搅拌反应17小时；反应结束后反应液用油泵转干得到黄色固体产物；薄层层析检测：层析液体积比：无水乙醇︰浓氨水︰CHCL2︰1,4二氧六环=8︰1︰10︰1，产物Rf =0.2；
(b) 向上一步产物中加入2N 的NaOH溶液75℃回流反应1.5 小时，经热水重结晶得到固体产物，即茶碱半抗原；薄层层析检测：层析液体积比：无水乙醇︰浓氨水︰CHCL2︰1,4二氧六环=8︰1︰10︰1，产物Rf =0.3；
(2) 制备茶碱人工抗原：
(c) 将茶碱半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺以摩尔比为1︰1.5︰1.5溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心取上清液记为A液；
(d) 将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3︰4.2︰1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4；
(e) 将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；
(f) 将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1︰5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；
(g) 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：茶碱-牛血清蛋白。
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