CN105315363A - 一种普瑞巴林人工抗原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种普瑞巴林人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测：以普瑞巴林为原料，将其与三氟乙酸酐进行酰化反应，使普瑞巴林结构上的氨基得以保护，得到含有羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过活泼酯法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备普瑞巴林的人工抗原即普瑞巴林-牛血清蛋白。所制备的普瑞巴林人工抗原可进行动物免疫，取得相应的普瑞巴林抗体，可用于各种普瑞巴林类免疫分析法的研究，为普瑞巴林的检测提供更加方便快速准确的途径。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域。具体涉及一种普瑞巴林人工抗原的制备方法。
背景技术
普瑞巴林(Pregabalin，以下简称PRB)为一种治疗癫痫的药物、除了癫痫治疗外、此药同时可以用来治疗糖尿病或疱疹病毒引起的神经痛以及纤维肌病变或脊髓伤害所引起的慢性疼痛。化学名为(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸，其结构式为：
PRB的止痛作用，是由于它能降低受损的神经细胞将疼痛讯号传送到另一细胞而达到止痛的目的。为了避免药物滥用的可能、此药在美国归类为五类管制药品。欧盟国家最近核准此药用与抗焦虑症。PRB是一种解离性药物，导致定向障碍、激越和谵妄构成的急性综合征。虽然PRB的初步对神经的作用只持续几个小时，但完全从体内血浆排除会延长，经常会延续数周。PRB对神经系统有潜在的作用，会改变感知功能(幻觉，错觉，谵妄或精神混乱)、运动功能(步态蹒跚，无协调性，眼球运动混乱或眼球震颤)和植物神经系统调节(心率过快，温度调节改变)。目前已被国家和国际禁毒公约列入麻醉药品的规范中进行严格管制。
目前，对普瑞巴林的检测主要依靠高效液相色谱法(HPLC),气相色谱(GC)，薄层色谱(TLC)，质谱(MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速，准确的要求。而免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法,该方法的前提就是需要提供特异性的抗原和抗体。因此有必要提供一种有效的普瑞巴林人工抗原的制备方法,制备的普瑞巴林人工抗原可用于免疫制备具有特异性的普瑞巴林抗体，进一步用于检测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种普瑞巴林人工抗原的制备方法，所制备的普瑞巴林人工抗原可进行动物免疫，取得相应的普瑞巴林抗体，可用于各种普瑞巴林类免疫分析法的研究，为普瑞巴林的检测提供更加方便快速准确的途径。
一种普瑞巴林人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备人工半抗原：
(a)将普瑞巴林与三氟乙酸酐以摩尔比为1:1.5加入圆底烧瓶中，用苯做溶剂，加入搅拌子，用冰浴冷却到0℃，搅拌至固体完全溶解；然后撤去冰浴，室温搅拌反应1小时；将反应液转入78℃油浴中回流反应3小时；
(b)反应结束，将反应液冷却至室温，用旋转蒸发仪减压蒸干溶剂，得到淡黄色油状物即普瑞巴林人工半抗原；
(2)制备普瑞巴林人工抗原：
(c)将普瑞巴林半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺以摩尔比为1:1.5:1.5溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心取上清液记为A液；
(d)将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4；
(e)将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；
(f)将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；
(g)配置0.5％的Na2CO3水溶液5L，并用2N的NaOH水溶液调PH＝12，作为碱性透析液；将步骤(f)所得人工抗原混合液装入透析袋，搅拌条件下，在碱性透析液中透析；
(h)将碱性透析过的人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：普瑞巴林-牛血清蛋白。
由于普瑞巴林的分子量较小，单独作用时不具有免疫原性或免疫原性较弱，因此必须将其与大分子载体比如牛血清蛋白连接形成普瑞巴林抗原后，才能刺激机体产生相应的普瑞巴林抗体。本发明在制备普瑞巴林人工抗原过程中，所选的位点和交联方法都没有明显改变其结构，保留了抗原决定簇。在普瑞巴林半抗原和牛血清蛋白之间引入桥结构，暴露抗原决定簇，所获得的普瑞巴林人工抗原保持了普瑞巴林的结构特异性，有利于相应普瑞巴林抗体的产生。
本发明的技术方案分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：以普瑞巴林为原料，将其与三氟乙酸酐进行酰化反应，使普瑞巴林结构上的氨基得以保护，得到含有羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过活泼酯法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备普瑞巴林的人工抗原即普瑞巴林-牛血清蛋白。其反应方程式如下：
本发明制备得到的普瑞巴林人工抗原可通过以下方法进行鉴定：
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法虽然很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制普瑞巴林半抗原浓度为0，5，10，20，30，40μg/ml的PBS溶液，通过紫外扫面图可知普瑞巴林半抗原的最大吸收波长为284nm，在284nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为ε＝吸光值/摩尔浓度。本发明计算得ε＝6412.24L/mol。
偶联物蛋白浓度的测定：配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg/ml的牛血清蛋白PBS溶液1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例吸收，在655nm处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。本发明计算得普瑞巴林抗原的蛋白浓度为2.43mg/ml。
偶联比测定：配制100μg/ml的牛血清蛋白PBS溶液，将偶联物用PBS稀释到100μg/ml，在277nm处测得吸光值，以PBS为空白，测得吸光值A1,A2,则偶联比率γ为：γ＝[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/65000)，本发明计算得γ≈15。
其中ε为摩尔吸光系数(L/mol),65000为牛血清蛋白的分子量，100×10-3为牛血清蛋白浓度(μg/ml)。
本发明的有益效果：本发明合成了普瑞巴林的人工抗原，合成工艺先进，特异性强，得到的普瑞巴林人工抗原用于免疫新西兰白兔，检测结果表明，普瑞巴林人工抗原的免疫血清的效价为1：76000，完全可用于免疫分析中，为普瑞巴林的检测提供更加方便快速准确的途径。
附图说明
图1是普瑞巴林人工半抗原的液相色谱图。
图2是普瑞巴林人工半抗原的质谱图。
图3是普瑞巴林人工抗原制备前后的紫外扫描图。
具体实施方式
普瑞巴林人工抗原的制备分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：以普瑞巴林为原料，将其与三氟乙酸酐进行酰化反应，使普瑞巴林结构上的氨基得以保护，得到含有羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过活泼酯法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备普瑞巴林的人工抗原即普瑞巴林-牛血清蛋白。
实施例1
(1)普瑞巴林人工半抗原的制备：
(a)称取普瑞巴林100mg(0.628mmol)于50ml圆底烧瓶中，加入2ml3A分子筛干燥过的苯，加入搅拌子，用冰浴冷却到0℃，并良好搅拌至固体完全溶解；将三氟乙酸酐0.133ml(0.942mmol)缓慢滴加到上述反应液中；然后撤去冰浴，室温搅拌反应1hrs；之后将反应液转入78℃油浴中回流反应3hrs。
(b)反应结束，将反应液冷却至室温，搅拌子用2ml苯洗涤，用旋转蒸发仪减压蒸干溶剂，得到133mg淡黄色油状物即普瑞巴林人工半抗原。TLC检测，原料点和产物点都不显色。图1是普瑞巴林人工半抗原的液相色谱图，图2是普瑞巴林人工半抗原的质谱图。
(2)普瑞巴林人工抗原的制备：
(c)称取普瑞巴林人工半抗原133mg(0.522mmol)于50ml圆底烧瓶中，加入6.65mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)90mg(0.782mmol)和环己基碳酰二亚胺(DCC)161mg(0.782mmol)，室温搅拌反应过夜，反应结束离心取上清液记为A液。
(d)称取14.5g十二水磷酸氢二钠，43.875g氯化钠，1.495g二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到PBS缓冲液，pH为7.2～7.4。
(e)称取0.35g牛血清蛋白溶于70mlPBS缓冲液中，得到的溶液记为B液。
(f)在快速搅拌下，将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
(g)配置0.5％的Na2CO3水溶液5L，用2N的NaOH水溶液调PH＝12，作为碱性透析液。将人工抗原混合液装入透析袋，搅拌条件下，在碱性透析液中透析两次，两天每次。
(h)将碱性透析过的人工抗原混合液在PBS缓冲液中透析7次，每次3小时，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：普瑞巴林-牛血清蛋白。图3是普瑞巴林人工抗原制备前后的紫外扫描图。
(3)普瑞巴林人工抗原的鉴定：
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法虽然很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制普瑞巴林半抗原浓度为0,5,10,20,30,40μg/ml的PBS溶液，通过紫外扫面图可知普瑞巴林半抗原的最大吸收波长为284nm，在284nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为ε＝吸光值/摩尔浓度。本发明计算得ε＝6412.24L/mol。
偶联物蛋白浓度的测定：配制浓度为0,40,60,80,100,120,160,200μg/ml的牛血清蛋白PBS溶液1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例吸收，在655nm处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。本发明计算得普瑞巴林抗原的蛋白浓度为2.43mg/ml。
偶联比测定：配制100μg/ml的牛血清蛋白PBS溶液，将偶联物用PBS稀释到100μg/ml，在277nm处测得吸光值，以PBS为空白，测得吸光值A1,A2,则偶联比率γ为：γ＝[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/65000)，本发明计算得γ≈15。
其中ε为摩尔吸光系数(L/mol)，65000为牛血清蛋白的分子量，100×10-3为牛血清蛋白浓度(g/L)。
Claims (1)
1.一种普瑞巴林人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备人工半抗原：
(a)将普瑞巴林与三氟乙酸酐以摩尔比为1:1.5加入单口圆底烧瓶中，用苯做溶剂，加入搅拌子，用冰浴冷却到0℃，搅拌至固体完全溶解；然后撤去冰浴，室温搅拌反应1小时；将反应液转入78℃油浴中回流反应3小时；
(b)反应结束，将反应液冷却至室温，用旋转蒸发仪减压蒸干溶剂，得到淡黄色油状物即普瑞巴林人工半抗原；
(2)制备普瑞巴林人工抗原：
(c)将普瑞巴林半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺以摩尔比为1:1.5:1.5溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心取上清液记为A液；
(d)将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2~7.4；
(e)将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；
(f)将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；
(g)配置0.5%的Na2CO3水溶液5L，并用2N的NaOH水溶液调PH=12，作为碱性透析液；将步骤（f）所得人工抗原混合液装入透析袋，搅拌条件下，在碱性透析液中透析；
(h)将碱性透析过的人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：普瑞巴林-牛血清蛋白。
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