CN103360487B - 一种丙氧酚人工抗原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种丙氧酚人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测：以chirald为原料，通过与戊二酸酐的缩合反应，在氮位上引入羧基得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备丙氧酚的人工抗原即丙氧酚-牛血清蛋白。所制备的丙氧酚人工抗原可进行动物免疫，取得相应的丙氧酚抗体，可用于各种丙氧酚类免疫分析法的研究，为丙氧酚的检测提供更加方便快速准确的途径。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种丙氧酚人工抗原的制备方法。
背景技术
丙氧酚（propoxyphene）又叫右丙氧酚，是常用的阿片类止痛药之一，用于治疗轻度至中度疼痛，与其他镇痛药相比，右丙氧酚有起效快的特点。其结构式为：
大剂量服用丙氧酚可发生吞咽困难、幻视及中毒性精神病，可能引起呼吸抑制。急性过量可产生多系统症状，如痉挛、幻觉、精神错乱，甚至昏迷、呼吸抑制、呼吸停止、心动过速、血压高或血压低、心脏传导障碍，甚至心脏停搏。FDA有报告显示，222例的死亡率为8%，并提出30岁以下患者以呼吸抑制为多见，而老年人多见有心脏毒性作用。据专家介绍，右丙氧酚属于二类精神药物，已经被列入麻醉药品管理目录了。
目前，对丙氧酚的检测主要依靠高效液相色谱法（HPLC）,气相色谱（GC），薄层色谱（TLC），质朴（MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速，准确的要求。而免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法, 该方法的前提就是需要提供特异性的抗原和抗体。因此有必要提供一种有效的丙氧酚人工抗原的制备方法,制备的丙氧酚人工抗原可用于免疫制备具有特异性的丙氧酚抗体,进一步用于检测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种丙氧酚人工抗原的制备方法，所制备的丙氧酚人工抗原可进行动物免疫，取得相应的丙氧酚抗体，可用于各种丙氧酚类免疫分析法的研究，为丙氧酚的检测提供更加方便快速准确的途径。
一种丙氧酚人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 制备人工半抗原：
(a) 将(2S,3R)-(+)-4-二甲氨基-1,2-二苯基-3-甲基-2-丁醇和戊二酸酐以摩尔比为1：10加入圆底烧瓶中，100℃下搅拌反应72小时后，减压蒸干溶剂，残渣用氢氧钠水溶液逐步溶解，再用饱和氢氧化钠水溶液调pH=9，经乙酸乙酯洗涤后水相用盐酸溶液调pH=1，二氯甲烷萃取，合并有机相，经干燥，过滤，减压蒸馏得到棕褐色固体，薄层层析法纯化得到丙氧酚半抗原；薄层层析：层析液体积比：95%乙醇︰1,4-二氧六环︰二氯甲烷︰氨水=8︰1︰10︰1；产物Rf =0.3；
(2) 制备丙氧酚人工抗原：
(b）将丙氧酚半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺以摩尔比为1︰1.5︰1.5溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心取上清液记为A液；
(c) 将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3︰4.2︰1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4；
(d) 将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为10mg/ml的B液；
(e) 将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1︰10，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；
(f) 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：丙氧酚-牛血清蛋白。
由于丙氧酚的分子量较小，单独作用时不具有免疫原性或免疫原性较弱，因此必须将其与大分子载体比如牛血清蛋白连接形成丙氧酚抗原后，才能刺激机体产生相应的丙氧酚抗体。本发明在制备丙氧酚人工抗原过程中，所选的位点和交联方法都没有明显改变其结构，保留了抗原决定簇。在丙氧酚半抗原和牛血清蛋白之间引入桥结构，暴露抗原决定簇，所获得的丙氧酚人工抗原保持了丙氧酚的结构特异性，有利于相应丙氧酚抗体的产生。
本发明的技术方案分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：以chirald（(2S,3R)-(+)-4-二甲氨基-1,2-二苯基-3-甲基-2-丁醇）为原料，通过与戊二酸酐的缩合反应，在氮位上引入羧基得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备丙氧酚的人工抗原即丙氧酚-牛血清蛋白。其反应方程式如下：
本发明制备得到的丙氧酚人工抗原可通过以下方法进行鉴定：
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法虽然很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制丙氧酚半抗原浓度为0, 5, 10, 20, 30, 40ug/ml的PBS溶液，通过紫外扫面图可知丙氧酚半抗原的最大吸收波长为284nm，在284nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为ε=吸光值/摩尔浓度。本发明计算得ε=5836.17L/mol
偶联物蛋白浓度的测定：配制浓度为0, 10, 20, 30, 40，60, 80, 100, 120ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例吸收，在655处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。本发明计算得丙氧酚抗原的蛋白浓度为5.16mg/ml。
偶联比测定：配制100ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液，将偶联物用PBS稀释到100ug/ml，在276处测得吸光值，以PBS为空白，测得吸光值A1, A2,则偶联比率γ为：γ=[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/65000), 本发明计算得γ≈16。
其中ε为摩尔吸光系数（L/mol),65000为牛血清蛋白的分子量，100×10-3 为牛血清蛋白浓度（ug/ml）。
本发明的有益效果：本发明合成了丙氧酚的人工抗原，合成工艺先进，特异性强，得到的丙氧酚人工抗原用于免疫新西兰白兔，检测结果表明，丙氧酚人工抗原的免疫血清的效价为1：70000，完全可用于免疫分析中，为丙氧酚的检测提供更加方便快速准确的途径。
附图说明
图1是丙氧酚人工半抗原的液相色谱图。
图2是丙氧酚工半抗原的质谱图。
图3是丙氧酚人工抗原制备前后的紫外扫描图。
具体实施方式
丙氧酚人工抗原制备分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：以chirald为原料，通过与戊二酸酐的缩合反应，在氮位上引入羧基得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备丙氧酚的人工抗原即丙氧酚-牛血清蛋白。
实施例1
(1) 人工半抗原的制备：
(a) 称取1.13g的chirald（4mmol）于50ml的圆底烧瓶中,加入30ml 3A分子筛干燥过的吡啶溶解，随后加入4.56g的戊二酸酐（40mmol），油浴升温至100℃搅拌反应72小时；反应结束后减压蒸干溶剂，得到的残渣用150ml pH=11的氢氧化钠水溶液逐步溶解，转入250ml的分液漏斗中，用饱和氢氧化钠水溶液调节pH=9，水相用约150ml的乙酸乙酯洗涤3次，然后用6N的盐酸调pH=1，此时产生棕褐色不溶物，加入200ml二氯甲烷萃取4次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂得到棕褐色的粘状固体，将粘状固体溶于5ml无水乙醇中，用薄层层析法纯化得到丙氧酚半抗原184mg (0.463mol)。薄层层析：层析液为95%乙醇：1,4-二氧六环：二氯甲烷：氨水=8︰1︰10︰1（v/v)；产物Rf=0.3。图1是丙氧酚半抗原的液相色谱图，图2是丙氧酚人工半抗原的质谱图。
(2) 丙氧酚人工抗原的制备：
(b) 称取184mg (0.463mol) 丙氧酚半抗原于50ml圆底烧瓶中，加入7.36ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入80mg(0.695mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和142mg(0.695mmol)环己基碳酰二亚胺(DCC) ，室温搅拌反应过夜，反应结束离心取上清液记为A液。
(c) 称取14.5g十二水磷酸氢二钠，43.875g氯化钠，1.495g二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到PBS缓冲液，pH为7.4。
(d) 称取0.8g牛血清蛋白溶于80mlPBS缓冲液中，得到的溶液记为B液。
(e) 在快速搅拌下，将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1︰10，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
(f) 将人工抗原混合液移入透析袋中，用上述PBS缓冲液透析7次，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：丙氧酚-牛血清蛋白。图3是丙氧酚人工抗原制备前后的紫外扫描图。
(3)丙氧酚人工抗原的鉴定：
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法虽然很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制丙氧酚半抗原浓度为0, 5, 10, 20, 30, 40ug/ml的PBS溶液，通过紫外扫面图可知丙氧酚半抗原的最大吸收波长为284nm，在284nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为ε=吸光值/摩尔浓度。本发明计算得ε=5836.17L/mol
偶联物蛋白浓度的测定：配制浓度为0, 10, 20, 30, 40，60, 80, 100, 120ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例吸收，在655处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。本发明计算得丙氧酚抗原的蛋白浓度为5.16mg/ml。
偶联比测定：配制100ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液，将偶联物用PBS稀释到100ug/ml，在276处测得吸光值，以PBS为空白，测得吸光值A1, A2,则偶联比率γ为：γ=[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/65000), 本发明计算得γ≈16。
其中ε为摩尔吸光系数（L/mol),65000为牛血清蛋白的分子量，100×10-3 为牛血清蛋白浓度（ug/ml）。
Claims (1)
1.一种丙氧酚人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 制备人工半抗原：
(a) 将(2S,3R)-(+)-4-二甲氨基-1,2-二苯基-3-甲基-2-丁醇和戊二酸酐以摩尔比为1：10加入圆底烧瓶中，100℃下搅拌反应72小时后，减压蒸干溶剂，残渣用氢氧化钠水溶液逐步溶解，再用饱和氢氧化钠水溶液调pH=9，经乙酸乙酯洗涤后水相用盐酸溶液调pH=1，二氯甲烷萃取，合并有机相，经干燥，过滤，减压蒸馏得到棕褐色固体，薄层层析法纯化得到丙氧酚半抗原；薄层层析：层析液体积比：95%乙醇︰1,4-二氧六环︰二氯甲烷︰氨水=8︰1︰10︰1；产物Rf=0.3；
(2) 制备丙氧酚人工抗原：
(b） 将丙氧酚半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺以摩尔比为1︰1.5︰1.5溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心取上清液记为A液；
(c) 将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3︰4.2︰1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4；
(d) 将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为10mg/ml的B液；
(e) 将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1︰10，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；
(f) 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：丙氧酚-牛血清蛋白。
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