CN102617730B - 一种美沙酮人工抗原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种美沙酮人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测：以2-氯-N,N-二甲基丙胺与二苯乙腈为原料通过缩合，氧化，酯化，还原在1位上引入羟基，和丁二酸酐反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备美沙酮的人工抗原即美沙酮-牛血清蛋白。所制备的美沙酮人工抗原可进行动物免疫，取得相应的美沙酮抗体，可用于各种美沙酮类免疫分析法的研究，为美沙酮的检测提供更加方便快速准确的途径。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种美沙酮人工抗原的制备方法。
背景技术
美沙酮（MTD）又称美散痛，非那痛，阿米酮，属于麻醉镇痛药，为μ阿片受体激动剂，药效与吗啡类似，具有镇痛作用，并可产生呼吸抑制、缩瞳、镇静等作用。与吗啡比较，具有作用时间较长、药物依赖性低的特点，是二战期间德国合成的替代吗啡的麻醉性镇痛药。其结构式为：
美沙酮具有生理依赖性，心里依赖性和耐受性。因此美沙酮要合理利用，滥用可能导致海洛因一样的后果。美沙酮也是吸毒者追逐的对象，因此必须严格管理，目前已被国家和国际禁毒公约列入麻醉药品的规范中进行严格管制。
目前，对美沙酮的检测主要依靠高效液相色谱法（HPLC）,气相色谱（GC），薄层色谱（TLC），质朴（MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速，准确的要求。而免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法, 该方法的前提就是需要提供特异性的抗原和抗体。因此有必要提供一种有效的美沙酮人工抗原的制备方法,制备的美沙酮人工抗原可用于免疫制备具有特异性的美沙酮抗体,进一步用于检测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种美沙酮人工抗原的制备方法，所制备的美沙酮人工抗原可进行动物免疫，取得相应的美沙酮抗体，可用于各种美沙酮类免疫分析法的研究，为美沙酮的检测提供更加方便快速准确的途径。
一种美沙酮人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 制备人工半抗原：
(a) 将二苯乙腈与2-氯-N,N-二甲基丙胺盐酸盐以摩尔比为1:1.6加入圆底烧瓶中，100℃下搅拌反应6小时；反应结束后反应液用乙醚提取，转干，经重结晶得到白色固体产物Ⅰ；TLC：层析液为乙酸乙酯，产物Rf =0.5~0.7；
(b) 将70%的硫酸与产物Ⅰ以摩尔比为3.6:1加入圆底烧瓶中，130℃下搅拌反应2小时；反应结束后，将溶剂转干，用乙醚提取得产物Ⅱ；TLC：层析液为乙酸乙酯，产物Rf =0.3~0.5；
(c) 将产物Ⅱ与98%的硫酸以摩尔比为1:8溶于无水甲醇中，68℃回流反应18 小时，反应结束后加入碳酸氢钠固体中和，过滤，将滤液转干，加入四氢呋喃提取，得到黄色油状物Ⅲ；TLC：层析液为95%乙醇，产物Rf =0.9；
(d) 将黄色油状物Ⅲ与氢化铝锂以摩尔比为1:1.5溶于无水四氢呋喃中，氮气保护，68℃回流反应18 小时；反应结束后，用氢氧化钠溶液调至碱性，过滤转干得到白色油状物Ⅳ；TLC：层析液为95%乙醇，产物Rf =0.7；
（e）将白色油状物Ⅳ与丁二酸酐以摩尔比为1:2溶于无水吡啶中，100℃反应20小时； 反应结束后减压蒸馏，薄层层析法纯化得到美沙酮半抗原Ⅴ；TLC：层析液为95%乙醇，产物Rf =0.4~0.5；
(2) 制备美沙酮人工抗原：
(f) 将美沙酮半抗原Ⅴ与N-羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺以摩尔比为1:1.5:1.5溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心取上清液记为A液；
(g) 将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2~7.4；
(h) 将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；
(i) 将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；
(j) 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：美沙酮-牛血清蛋白。
由于美沙酮的分子量较小，单独作用时不具有免疫原性或免疫原性较弱，因此必须将其与大分子载体比如牛血清蛋白连接形成美沙酮抗原后，才能刺激机体产生相应的美沙酮抗体。本发明在制备美沙酮人工抗原过程中，所选的位点和交联方法都没有明显改变其结构，保留了抗原决定簇。在美沙酮半抗原和牛血清蛋白之间引入桥结构，暴露抗原决定簇，所获得的美沙酮人工抗原保持了美沙酮的结构特异性，有利于相应美沙酮抗体的产生。
本发明的技术方案分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：以2-氯-N,N-二甲基丙胺与二苯乙腈为原料通过缩合，氧化，酯化，还原在1位上引入羟基，和丁二酸酐反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备美沙酮的人工抗原即美沙酮-牛血清蛋白。其反应方程式如下：
本发明制备得到的美沙酮人工抗原可通过以下方法进行鉴定：
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法虽然很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制美沙酮半抗原浓度为0, 5, 10, 20, 30, 40ug/ml的PBS溶液，通过紫外扫面图可知美沙酮半抗原的最大吸收波长为288nm，在288nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为ε=吸光值/摩尔浓度。本发明计算得ε=5514.35L/mol
偶联物蛋白浓度的测定：配制浓度为0, 10, 20, 30, 40，60, 80, 100, 120ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例吸收，在655处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。本发明计算得美沙酮抗原的蛋白浓度为3.221mg/ml。
偶联比测定：配制100ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液，将偶联物用PBS稀释到100ug/ml，在276处测得吸光值，以PBS为空白，测得吸光值A1, A2,则偶联比率γ为：γ=[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/65000), 本发明计算得γ≈18。
其中ε为摩尔吸光系数（L/mol),65000为牛血清蛋白的分子量，100×10-3 为牛血清蛋白浓度（ug/ml）。
本发明的有益效果：本发明合成了美沙酮的人工抗原，合成工艺先进，特异性强，得到的美沙酮人工抗原用于免疫新西兰白兔，检测结果表明，美沙酮人工抗原的免疫血清的效价为1：72000，完全可用于免疫分析中，为美沙酮的检测提供更加方便快速准确的途径。
附图说明
图1是美沙酮人工半抗原的液相色谱图。
图2是美沙酮人工半抗原的质谱图。
图3是美沙酮人工抗原制备前后的紫外扫描图。
具体实施方式
美沙酮人工抗原制备分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：以2-氯-N,N-二甲基丙胺与二苯乙腈为原料通过缩合，氧化，酯化，还原在1位上引入羟基，和丁二酸酐反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备美沙酮的人工抗原即美沙酮-牛血清蛋白。
实施例1
(1) 人工半抗原的制备：
(a) 称取二苯乙腈（103.5mmol）, 2-氯-N,N-二甲基丙胺盐酸盐（165.6mmol）于150ml单口圆底烧瓶中，加入搅拌子，升温至100℃下搅拌反应6小时；反应结束后反应液用3×50ml乙醚提取，乙醚相用3×40ml的5%盐酸溶液提取，得到的盐酸相用25%的氢氧化钠调至碱性，再用3×50ml乙醚提取，无水碳酸钾干燥，过滤转干，用10ml乙醚重结晶得到白色固体产物Ⅰ10.58g。以乙酸乙酯为层析液进行薄层色谱，检测产物ⅠRf =0.5~0.7。
(b) 在50ml单口圆底烧瓶中，加入1.958ml 70%的硫酸溶液，加热至100℃，加入上一步产物Ⅰ2g，升温至130℃，继续反应2小时；停止反应，冷却至室温，加入10ml双蒸水，用30%氢氧化钠溶液调pH=10~11，再用20%盐酸溶液调pH=3~4，将溶剂转干，用25ml无水乙醚提取得到2.499g产物Ⅱ。TLC：层析液乙酸乙酯，产物ⅡRf=0.3~0.5。
(c) 将1.008g产物Ⅱ溶于31ml无水甲醇中，加入1.5ml 98%的硫酸溶液，68℃回流反应18小时。反应结束后自然冷却，加入4.637g碳酸氢钠固体，充分搅拌后过滤，将滤液转干，加入30ml 四氢呋喃（THF）提取，得到1.364g黄色油状物Ⅲ。TLC：层析液为95%乙醇，产物ⅢRf =0.9。
(d) 在100ml单口圆底烧瓶中，加入1g的氢化铝锂和28ml的无水THF, 氮气保护下，加入溶解在40ml无水THF的1.364g黄色油状物Ⅲ，68℃回流反应18 hrs; 停止反应，冷却后加入6.8ml 38%的氢氧化钠溶液，调pH=8，过滤转干得到714mg白色油状物Ⅳ；TLC：层析液为95%乙醇，产物ⅣRf =0.7。
（e）称取200mg (0.707mmol) 白色油状物Ⅳ于50ml圆底烧瓶中，加入5ml无水吡啶，再加入141mg (1.414mmol) 丁二酸酐搅拌溶解，反应温度逐渐提高至100℃反应20小时。反应结束后自然冷却，进行减压蒸馏得到粗产物，薄层层析法纯化得到178mg (0.465mmol) 美沙酮半抗原Ⅴ。TLC：层析液为二氯甲烷：95%乙醇：浓氨水：1,4-二氧六环=10:8:1:1，产物ⅤRf=0.4~0.5。图1是美沙酮人工半抗原的液相色谱图，图2是美沙酮人工半抗原的质谱图。
(2) 美沙酮人工抗原的制备：
(f) 称取178mg(0.372mmol) 美沙酮半抗原Ⅴ于50ml圆底烧瓶中，加入8.95ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入64mg(0.558mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和114mg(0.558mmol)环己基碳酰二亚胺(DCC) ，室温搅拌反应过夜，反应结束离心取上清液记为A液。
(g) 称取14.5g十二水磷酸氢二钠，43.875g氯化钠，1.495g二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到PBS缓冲液，pH为7.2~7.4。
(h) 称取0.25g牛血清蛋白溶于50mlPBS缓冲液中，得到的溶液记为B液。
(i) 在快速搅拌下，将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
(j) 将人工抗原混合液移入透析袋中，用上述PBS缓冲液透析9次，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：美沙酮-牛血清蛋白。图3是美沙酮人工抗原制备前后的紫外扫描图。
(3)美沙酮人工抗原的鉴定：
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法虽然很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制美沙酮半抗原浓度为0, 5, 10, 20, 30, 40ug/ml的PBS溶液，通过紫外扫面图可知美沙酮半抗原的最大吸收波长为288nm，在288nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为ε=吸光值/摩尔浓度。计算得ε=5514.35L/mol
偶联物蛋白浓度的测定：配制浓度为0, 10, 20, 30, 40, 60, 80,100, 120ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例吸收，在655处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。计算得美沙酮抗原的蛋白浓度为3.221mg/ml。
偶联比测定：配制100ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液，将偶联物用PBS稀释到100ug/ml，在276处测得吸光值，以PBS为空白，测得吸光值A1, A2,则偶联比率γ为：γ=[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/65000)，计算得γ≈18。
其中ε为摩尔吸光系数（L/mol),65000为牛血清蛋白的分子量，100×10-3 为牛血清蛋白浓度（ug/ml）。
Claims (1)
1.一种美沙酮人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 制备人工半抗原：
(a) 将二苯乙腈与2-氯-N,N-二甲基丙胺盐酸盐以摩尔比为1:1.6加入圆底烧瓶中，100℃下搅拌反应6小时；反应结束后反应液用乙醚提取，转干，经重结晶得到白色固体产物Ⅰ；TLC：层析液为乙酸乙酯，产物Rf =0.5~0.7；
(b) 将70%的硫酸与产物Ⅰ以摩尔比为3.6:1加入圆底烧瓶中，130℃下搅拌反应2小时；反应结束后，将溶剂转干，用乙醚提取得产物Ⅱ；TLC：层析液为乙酸乙酯，产物Rf =0.3~0.5；
(c) 将产物Ⅱ与98%的硫酸以摩尔比为1:8溶于无水甲醇中，68℃回流反应18 小时，反应结束后加入碳酸氢钠固体中和，过滤，将滤液转干，加入四氢呋喃提取，得到黄色油状物Ⅲ；TLC：层析液为95%乙醇，产物Rf =0.9；
(d) 将黄色油状物Ⅲ与氢化铝锂以摩尔比为1:1.5溶于无水四氢呋喃中，氮气保护，68℃回流反应18 小时；反应结束后，用氢氧化钠溶液调至碱性，过滤转干得到白色油状物Ⅳ；TLC：层析液为95%乙醇，产物Rf =0.7；
（e）将白色油状物Ⅳ与丁二酸酐以摩尔比为1:2溶于无水吡啶中，100℃反应20小时； 反应结束后减压蒸馏，薄层层析法纯化得到美沙酮半抗原Ⅴ；TLC：层析液为95%乙醇，产物Rf =0.4~0.5；
(2) 制备美沙酮人工抗原：
(f) 将美沙酮半抗原Ⅴ与N-羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺以摩尔比为1:1.5:1.5溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心取上清液记为A液；
(g) 将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2~7.4；
(h) 将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；
(i) 将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；
(j) 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：美沙酮-牛血清蛋白。
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