CN103288952A - 一种去甲氯胺酮人工抗原的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种去甲氯胺酮人工抗原，尤其涉及一种苯胺绿人工抗原的制备方法。按以下步骤进行：制备人工半抗原---NKET半抗原的合成→制备去甲氯胺酮人工抗原---去甲氯胺酮-BSA的合成。一种去甲氯胺酮人工抗原的制备方法，合成工艺先进，特异性强，得到的去甲氯胺酮人工抗原用于免疫新西兰白兔，检测结果表明，去甲氯胺酮人工抗原的免疫血清的效价为1：72000，完全可用于免疫分析中，为去甲氯胺酮的检测提供更加方便快速准确的途径。

Description

一种去甲氯胺酮人工抗原的制备方法

  

技术领域

   本发明涉及一种去甲氯胺酮人工抗原，尤其涉及一种苯胺绿人工抗原的制备方法。 

背景技术

  氯胺酮属苯环己哌啶（Phencyclidine）衍生物，基本结构为环己胺。Domino等1965年引入临床，是非巴比妥类静脉麻醉药中具有确切镇痛作用的麻醉药。作为医药使用主要有针剂和片剂两种剂型。氯胺酮盐酸盐为白色结晶性粉末，无臭。易溶于水，可溶于热乙醇，不溶于乙醚。 

氯胺酮是一种通过静脉给药的短效麻醉剂，其进入血循环后大部分进入脑组织， 

然后再分布于全身组织中，肝、肺和脂肪内的药物浓度也较高。由于KET是毒品“K粉”的主要成分，近年来，其非法滥用现象严重。由于KET代谢的半衰期较短，摄人体内后，代谢生成去甲基氯胺酮(Norketamine，NKET)、去氢去甲基氯胺酮(Dehydronorketamine，DHNK) ，因此在生物检材(如血液、尿液、毛发等)中代谢物的含量比较高 ，作为检测指标，KET代谢物(主要是NKET)的检测比KET的检测更加重要，而且对嫌疑人是否吸食KET的确认更加有效。

  目前，对去甲氯胺酮的检测主要依靠高效液相色谱法（HPLC）,气相色谱（GC），薄层色谱（TLC），质朴（MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速，准确的要求。而免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法, 该方法的前提就是需要提供特异性的抗原和抗体。 

发明内容

    本发明主要是解决现有技术中存在的不足，提供一种去甲氯胺酮人工抗原的制备方法，所制备的去甲氯胺酮人工抗原可进行动物免疫，取得相应的去甲氯胺酮抗体，可用于各种去甲氯胺酮类免疫分析法的研究，为去甲氯胺酮的检测提供更加方便快速准确的途径。 

   本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的： 

  一种去甲氯胺酮人工抗原的制备方法，按以下步骤进行：

(1)、 制备人工半抗原--- NKET半抗原的合成:

 (a) 、将四氢呋喃和吡啶按照体积比为4：1相混合至完全溶解得到溶液A，放置在温度为4℃ 的冰箱内备用；

     (b)、 取50 mg 的NKET溶液、15mg的氰基硼氢化钠溶液和 200ul 15％ 的琥珀醛酸溶液，分别滴加溶液A 30ml、溶液A 5ml和溶液A 5ml，放置在温度为4℃ 的冰箱内备用； 

     (c)、 将准备好的琥珀醛酸溶液逐滴加入到NKET溶液中，在温度为4 ℃下进行磁力搅拌，反应时间为10min；再逐滴加入准备好的氰基硼氢化钠溶液，形成反应混合物，将反应混合物在温度为4℃下进行磁力搅拌，磁力搅拌的时间为4h，直至反应完全后，将反应混合物低温旋转蒸发至干，所得产物即为NKET半抗原；

(2) 、制备去甲氯胺酮人工抗原---去甲氯胺酮-BSA的合成:

(d) 、取上述NKET半抗原20mg，溶于2 mL的 N，N-二甲基甲酰胺溶液中，得到B液，常温放置备用；

    (e) 、将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的C液；

(f) 、在常温磁力搅拌条件下, 将100mg 的1一3一乙基碳二亚胺溶液滴加到B液，搅拌反应20min后，形成反应液，将该反应液滴加至10ml的C液中，再加入108mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺，在室温下进行搅拌过夜，形成人工抗原混合液；

1一3一乙基碳二亚胺溶液为1-(3一二甲氨基丙基)一3一乙基碳二亚胺溶液。

（g）、制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4； 

    (h) 、将人工抗原混合液在PBS缓冲液中进行透析，在温度为4℃下进行搅拌透析,每4小时换一次PBS缓冲液,透析时间为2天,形成透析液，紫外扫描透析液至无小分子吸收峰时,将产物离心后取上清,在无菌条件下通过0.2μm 的滤膜，即得到人工抗原：去甲氯胺酮-牛血清蛋白。

由于去甲氯胺酮的分子量较小，单独作用时不具有免疫原性或免疫原性较弱，因此必须将其与大分子载体比如牛血清蛋白连接形成去甲氯胺酮抗原后，才能刺激机体产生相应的去甲氯胺酮抗体。本发明在制备去甲氯胺酮人工抗原过程中，所选的位点和交联方法都没有明显改变其结构，保留了抗原决定簇。在去甲氯胺酮半抗原和牛血清蛋白之间引入桥结构，暴露抗原决定簇，所获得的去甲氯胺酮人工抗原保持了去甲氯胺酮的结构特异性，有利于相应去甲氯胺酮抗体的产生。 

本发明的技术方案分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：在低温条件下，去甲氯胺酮与琥珀醛酸反应，合成了半抗原羧基-去甲氯胺酮；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法将半抗原与载体牛血清白蛋白(BSA)偶联，制备去甲氯胺酮的人工抗原即去甲氯胺酮-牛血清蛋白形成相应全抗原。其反应方程式如下： 

本发明制备得到的去甲氯胺酮人工抗原可通过以下方法进行鉴定：

 偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法虽然很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。

摩尔吸收系数ε：配制去甲氯胺酮半抗原浓度为0, 5, 10, 20, 30, 40ug/ml的PBS溶液，通过紫外扫面图可知去甲氯胺酮半抗原的最大吸收波长为288nm，在288nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为ε=吸光值/摩尔浓度。本发明计算得ε=5228.61L/mol 

偶联物蛋白浓度的测定：配制浓度为0, 10, 20, 30, 40，60, 80, 100, 120ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例吸收，在655处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。本发明计算得去甲氯胺酮抗原的蛋白浓度为4.281mg/ml。

偶联比测定：配制100ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液，将偶联物用PBS稀释到100ug/ml，在276处测得吸光值，以PBS为空白，测得吸光值A1, A2,则偶联比率γ为：γ=[(A₁－A₂)/ε]/(100×10^-3/65000), 本发明计算得γ≈19。 

其中ε为摩尔吸光系数（L/mol),65000为牛血清蛋白的分子量，100×10^-3 为牛血清蛋白浓度（ug/ml）。 

因此，本发明的一种去甲氯胺酮人工抗原的制备方法，合成工艺先进，特异性强，得到的去甲氯胺酮人工抗原用于免疫新西兰白兔，检测结果表明，去甲氯胺酮人工抗原的免疫血清的效价为1：72000，完全可用于免疫分析中，为去甲氯胺酮的检测提供更加方便快速准确的途径。 

附图说明

图1是去甲氯胺酮人工半抗原的液相色谱图； 

图2是去甲氯胺酮人工半抗原的质谱图；

图3是去甲氯胺酮人工抗原制备前后的紫外扫描图。

图3中：a去甲氯胺酮半抗原，b去甲氯胺酮人工抗原，c牛血清蛋白 

具体实施方式

下面通过实施例，结合附图对本发明的技术方案作进一步具体的说明。 

  实施例1：一种去甲氯胺酮人工抗原的制备方法，按以下步骤进行： 

(1)、 制备人工半抗原--- NKET半抗原的合成:

 (a) 、将四氢呋喃和吡啶按照体积比为4：1相混合至完全溶解得到溶液A，放置在温度为4℃ 的冰箱内备用；

     (b)、 取50 mg 的NKET溶液、15mg的氰基硼氢化钠溶液和 200ul 15％ 的琥珀醛酸溶液，分别滴加溶液A 30ml、溶液A 5ml和溶液A 5ml，放置在温度为4℃ 的冰箱内备用； 

     (c)、 将准备好的琥珀醛酸溶液逐滴加入到NKET溶液中，在温度为4 ℃下进行磁力搅拌，反应时间为10min；再逐滴加入准备好的氰基硼氢化钠溶液，形成反应混合物，将反应混合物在温度为4℃下进行磁力搅拌，磁力搅拌的时间为4h，直至反应完全后，将反应混合物低温旋转蒸发至干，所得产物即为NKET半抗原；

(2) 、制备去甲氯胺酮人工抗原---去甲氯胺酮-BSA的合成:

(d) 、取上述NKET半抗原20mg，溶于2 mL的 N，N-二甲基甲酰胺溶液中，得到B液，常温放置备用；

    (e) 、将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的C液；

  (f) 、在常温磁力搅拌条件下, 将100mg 的1一3一乙基碳二亚胺溶液滴加到B液，搅拌反应20min后，形成反应液，将该反应液滴加至10ml的C液中，再加入108mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺，在室温下进行搅拌过夜，形成人工抗原混合液；

（g）、制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2；

    (h) 、将人工抗原混合液在PBS缓冲液中进行透析，在温度为4℃下进行搅拌透析,每4小时换一次PBS缓冲液,透析时间为2天,形成透析液，紫外扫描透析液至无小分子吸收峰时,将产物离心后取上清,在无菌条件下通过0.2μm 的滤膜，即得到人工抗原：去甲氯胺酮-牛血清蛋白。

  

  实施例2：一种去甲氯胺酮人工抗原的制备方法，按以下步骤进行：

(1)、 制备人工半抗原--- NKET半抗原的合成:

 (a) 、将四氢呋喃和吡啶按照体积比为4：1相混合至完全溶解得到溶液A，放置在温度为4℃ 的冰箱内备用；

     (b)、 取50 mg 的NKET溶液、15mg的氰基硼氢化钠溶液和 200ul 15％ 的琥珀醛酸溶液，分别滴加溶液A 30ml、溶液A 5ml和溶液A 5ml，放置在温度为4℃ 的冰箱内备用； 

     (c)、 将准备好的琥珀醛酸溶液逐滴加入到NKET溶液中，在温度为4 ℃下进行磁力搅拌，反应时间为10min；再逐滴加入准备好的氰基硼氢化钠溶液，形成反应混合物，将反应混合物在温度为4℃下进行磁力搅拌，磁力搅拌的时间为4h，直至反应完全后，将反应混合物低温旋转蒸发至干，所得产物即为NKET半抗原；

(2) 、制备去甲氯胺酮人工抗原---去甲氯胺酮-BSA的合成:

(d) 、取上述NKET半抗原20mg，溶于2 mL的 N，N-二甲基甲酰胺溶液中，得到B液，常温放置备用；

    (e) 、将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的C液；

  (f) 、在常温磁力搅拌条件下, 将100mg 的1一3一乙基碳二亚胺溶液滴加到B液，搅拌反应20min后，形成反应液，将该反应液滴加至10ml的C液中，再加入108mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺，在室温下进行搅拌过夜，形成人工抗原混合液；

（g）、制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.3；

    (h) 、将人工抗原混合液在PBS缓冲液中进行透析，在温度为4℃下进行搅拌透析,每4小时换一次PBS缓冲液,透析时间为2天,形成透析液，紫外扫描透析液至无小分子吸收峰时,将产物离心后取上清,在无菌条件下通过0.2μm 的滤膜，即得到人工抗原：去甲氯胺酮-牛血清蛋白。

  

  实施例3：一种去甲氯胺酮人工抗原的制备方法，按以下步骤进行：

(1)、 制备人工半抗原--- NKET半抗原的合成:

 (a) 、将四氢呋喃和吡啶按照体积比为4：1相混合至完全溶解得到溶液A，放置在温度为4℃ 的冰箱内备用；

     (b)、 取50 mg 的NKET溶液、15mg的氰基硼氢化钠溶液和 200ul 15％ 的琥珀醛酸溶液，分别滴加溶液A 30ml、溶液A 5ml和溶液A 5ml，放置在温度为4℃ 的冰箱内备用； 

     (c)、 将准备好的琥珀醛酸溶液逐滴加入到NKET溶液中，在温度为4 ℃下进行磁力搅拌，反应时间为10min；再逐滴加入准备好的氰基硼氢化钠溶液，形成反应混合物，将反应混合物在温度为4℃下进行磁力搅拌，磁力搅拌的时间为4h，直至反应完全后，将反应混合物低温旋转蒸发至干，所得产物即为NKET半抗原；

(2) 、制备去甲氯胺酮人工抗原---去甲氯胺酮-BSA的合成:

(d) 、取上述NKET半抗原20mg，溶于2 mL的 N，N-二甲基甲酰胺溶液中，得到B液，常温放置备用；

    (e) 、将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的C液；

  (f) 、在常温磁力搅拌条件下, 将100mg 的1一3一乙基碳二亚胺溶液滴加到B液，搅拌反应20min后，形成反应液，将该反应液滴加至10ml的C液中，再加入108mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺，在室温下进行搅拌过夜，形成人工抗原混合液；

（g）、制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4；

    (h) 、将人工抗原混合液在PBS缓冲液中进行透析，在温度为4℃下进行搅拌透析,每4小时换一次PBS缓冲液,透析时间为2天,形成透析液，紫外扫描透析液至无小分子吸收峰时,将产物离心后取上清,在无菌条件下通过0.2μm 的滤膜，即得到人工抗原：去甲氯胺酮-牛血清蛋白。

  

Claims (1)

1.一种去甲氯胺酮人工抗原的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：

(1)、 制备人工半抗原--- NKET半抗原的合成:

 (a) 、将四氢呋喃和吡啶按照体积比为4：1相混合至完全溶解得到溶液A，放置在温度为4℃ 的冰箱内备用；

     (b)、 取50 mg 的NKET溶液、15mg的氰基硼氢化钠溶液和 200ul 15％ 的琥珀醛酸溶液，分别滴加溶液A 30ml、溶液A 5ml和溶液A 5ml，放置在温度为4℃ 的冰箱内备用； 

     (c)、 将准备好的琥珀醛酸溶液逐滴加入到NKET溶液中，在温度为4 ℃下进行磁力搅拌，反应时间为10min；再逐滴加入准备好的氰基硼氢化钠溶液，形成反应混合物，将反应混合物在温度为4℃下进行磁力搅拌，磁力搅拌的时间为4h，直至反应完全后，将反应混合物低温旋转蒸发至干，所得产物即为NKET半抗原；

(2) 、制备去甲氯胺酮人工抗原---去甲氯胺酮-BSA的合成:

(d) 、取上述NKET半抗原20mg，溶于2 mL的 N，N-二甲基甲酰胺溶液中，得到B液，常温放置备用；

    (e) 、将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的C液；

  (f) 、在常温磁力搅拌条件下, 将100mg 的1一3一乙基碳二亚胺溶液滴加到B液，搅拌反应20min后，形成反应液，将该反应液滴加至10ml的C液中，再加入108mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺，在室温下进行搅拌过夜，形成人工抗原混合液；

（g）、制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4；

    (h) 、将人工抗原混合液在PBS缓冲液中进行透析，在温度为4℃下进行搅拌透析,每4小时换一次PBS缓冲液,透析时间为2天,形成透析液，紫外扫描透析液至无小分子吸收峰时,将产物离心后取上清,在无菌条件下通过0.2μm 的滤膜，即得到人工抗原：去甲氯胺酮-牛血清蛋白。

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