CN110981949A - 一种氯胺酮抗原的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氯胺酮抗原的制备方法，它包括以下步骤：S1，以盐酸氯胺酮为原料，将氨基用2‑三甲基甲硅烷基乙氧基羰酰氯（TeocCl）进行保护；S2，将氨基保护后的氯胺酮用硼氢化钠还原环已烷上的羰基成醇；S3，将步骤b)得到的醇与丁二酸酐反应引出含羧基的偶联臂；S4，将步骤c)得到的产物与大分子蛋白偶联，脱去氨基保护后得到氯胺酮抗原。本发明具有以下有益效果：本发明合成的抗原保留了氯胺酮分子中的仲胺活性基团，从分子结构中的环已烷引出偶联臂，最大程度保留了氯胺酮分子结构，所得抗原有较强的特异性和较高的灵敏度。

Description

一种氯胺酮抗原的制备方法

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及一种氯胺酮抗原的制备方法。

背景技术

氯胺酮(Ketamine，KET)是苯环已哌啶衍生物，属于第二类精神管制药品。其 结构式如下式：

氯胺酮是一种静脉给药的短效麻醉剂，在亚麻醉剂量时就能产生深度镇痛的 作用，且没有抑制心脏、呼吸功能的副作用，已经在临床上使用多年。同时氯胺 酮具有中枢兴奋、致幻等作用。近年来，在美国、欧洲和亚洲流行于舞厅等娱乐 场所，被青少年吸食，追求幻觉、做梦感、漂浮感和精神极度兴奋的感觉，其滥 用现象非常严重。氯胺酮所致的不良反应包括:抽搐、惊厥、呼吸抑制、支气管 痉挛、恶心、呕吐、胃出血、休克，暂时性失眠等。

氯胺酮及其代谢物的常用检测分析方法主要有:气相色谱法(GC)、气-质联 用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液-质联用法(LC-MS)、高效毛细管电泳 法(HPCE)、酶联免疫吸附法(ELISA)等。

仪器分析方法具有极高的灵敏度和精密度，但需要昂贵的仪器、设备和经过 专门培训的技术人员，不适于批量样品的筛选检测和现场即时检测。

近年发展起来的免疫检测法具有操作简便、高效、灵敏、适合大规模检测等 优点，已被广泛应用于各类毒品的检测。要建立氯胺酮的免疫检测方法，必须获 得具有抗原活性的氯胺酮全抗原。

发明内容

一种氯胺酮抗原的制备方法，将氯胺酮小分子通过化学方法连接到生物大分 子上形成具有抗原活性的氯胺酮全抗原，它包括以下步骤：

S1，以盐酸氯胺酮为原料，将氨基用2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰酰氯(TeocCl) 进行保护；

S2，将氨基保护后的氯胺酮用硼氢化钠还原环已烷上的羰基成醇；

S3，将步骤b)得到的醇与丁二酸酐反应引出含羧基的偶联臂；

S4，将步骤c)得到的产物与大分子蛋白偶联，脱去氨基保护后得到氯胺酮抗 原。

在采用以上技术方案的基础上，本发明还可以采用以下进一步方案：

在步骤S1中，具体步骤为：

S101，先将100mg盐酸氯胺酮溶于10mL水，用1N氢氧化钠溶液将pH值 调成8－9；

S102，加入50mL乙酸乙酯萃取，萃取后，将有机层用10ml水洗一次，并 用无水硫酸钠干燥，减压浓缩溶剂，得到82mg氯胺酮Ⅰ；

S103，将82mg氯胺酮Ⅰ溶于4mL乙腈或二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺， 加入90mg咪唑或三乙胺，降至0℃，加入108mg 2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰 酰氯(TeocCl)，0-30℃反应2-24h；

S104，停止反应后，加入50mL饱和碳酸氢钠溶液，室温搅拌10min，用250mL 乙酸乙酯萃取，有机层用50mL水洗两次，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓 缩得139mg粗品Ⅱ。

进一步的，在该步骤S103中，将82mg氯胺酮Ⅰ溶于4mL乙腈或二氯甲烷 或N,N-二甲基甲酰胺，加入90mg咪唑或三乙胺，降至0℃，加入108mg 2-三 甲基甲硅烷基乙氧基羰酰氯(TeocCl)，20-30℃反应15h。

在步骤S2中，具体步骤为：

S201，将139mg粗品Ⅱ溶于20mL甲醇或乙醇或异丙醇，降温至10℃，加 入32mg硼氢化钠，10-40℃反应2-24h；

S202，停止反应，加入20mL饱和氯化铵溶液，室温搅拌10min，减压浓缩 除去溶剂；

S203，在溶剂中加入200mL乙酸乙酯进行萃取，有机层用50mL水洗两次， 将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得121mg油状物，爬板得48mg化合物Ⅲ。

进一步的，在步骤S201中，将139mg粗品Ⅱ溶于20mL甲醇或乙醇或异丙 醇，降温至10℃，加入32mg硼氢化钠，20-30℃反应8h；

在步骤S3中，具体步骤为：

S301，将48mg化合物Ⅲ溶于5mL吡啶，加入90mg丁二酸酐，加热回流， 反应温度在20-100℃，反应2-24h；

S302，停止反应，减压浓缩除去溶剂；

S303，加入100mL乙酸乙酯萃取，有机层用10mL水洗两次，将有机层用 无水硫酸钠干燥，减压浓缩得油状物，爬板得16mg化合物Ⅳ。

进一步的，在步骤S301中，将48mg化合物Ⅲ溶于5mL吡啶，加入90mg 丁二酸酐，加热回流，反应温度在20-100℃，反应15h；

在步骤S4中，具体步骤为：

S401，取16mg化合物Ⅳ，溶于0.8mL DMF，加入5mg NHS和9mg DCC，室 温下反应15h；

S402，将反应液离心取清液，加入到3mL浓度为12mg/mL的BSA的PBS溶 液中，4-10℃反应时间15h；

S403，再加入100mg四丁基氟化铵或四乙基氟化铵或四甲基氟化铵，10-20℃ 反应12h；

S404，将反应液透析，离心取清液得氯胺酮抗原Ⅴ。

进一步的，半抗原与大分子蛋白偶联的方法为二环己基碳二亚胺(DCC)/N-羟 基琥珀酰亚胺(NHS)法。

进一步的，在步骤S402中，所述大分子蛋白为BSA或KLH或OVA或BGG。

由于采用了本发明的技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明合成的抗原保留了氯胺酮分子中的仲胺活性基团，从分子结构中的环 已烷引出偶联臂，最大程度保留了氯胺酮分子结构，所得抗原有较强的特异性和 较高的灵敏度。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝不是对本发明的任 何限制。

实施例1：

氯胺酮抗原的结构式为：

实施例2：

制备氯胺酮抗原的反应式如下式：

1.氯胺酮的氨基保护：

取100mg盐酸氯胺酮溶于10mL水，用1N氢氧化钠溶液调pH为8－9，用 50mL乙酸乙酯萃取，有机层10mL水洗一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得82mg 氯胺酮I。

取82mg氯胺酮I溶于4mL DMF，加入90mg咪唑，降至0℃，加入108mg 2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰酰氯(TeocCl)，20-30℃反应15h。停止反应，加入 50mL饱和碳酸氢钠溶液，室温搅拌10min，用250mL乙酸乙酯萃取，有机层依 次用2×50mL水洗，有机层无水硫酸钠干燥，减压浓缩得139mg粗品Ⅱ。

2.将氨基的保护后的氯胺酮分子中的羰基还原为醇：

取139mg粗品Ⅱ溶于20mL甲醇，降温至10℃，加入32mg硼氢化钠，20-30℃ 反应8h。停止反应，加入20mL饱和氯化铵溶液，室温搅拌10min，减压浓缩除 去溶剂。加入200mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×50mL水洗，有机层无水 硫酸钠干燥，减压浓缩得121mg油状物，爬板得48mg化合物III。

3.将上述步骤得到的醇与丁二酸酐反应引出含羧基的偶联臂：

取48mg化合物III溶于5mL吡啶，加入90mg丁二酸酐，加热回流，反应15h，停止反应，减压浓缩除去溶剂。加入100mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用 2×10mL水洗，有机层无水硫酸钠干燥，减压浓缩得油状物，爬板得16mg化合 物IV。

4.氯胺酮抗原V的制备：

取16mg化合物IV，溶于0.8mL DMF，加入5mg NHS和9mg DCC，室温下 反应15h，将反应液离心取清液，加入到3mL浓度为12mg/mL的BSA的PBS溶 液中，4-10℃反应时间15h。再加入100mg四丁基氟化铵，10-20℃反应时间12h。 将反应液透析，离心取清液得氯胺酮抗原V。

实施例3：

氯胺酮抗原V的活性测试：利用胶体金免疫层析法对氯胺酮抗原V进行检测。 用喷膜机以1.0μg/cm的喷量，将氯胺酮抗原V以3.0mm的宽度喷在NC膜上， 以氯胺酮抗体标记胶体金，结合玻璃纤维纸及吸水纸，组装成试纸条，对试纸条 进行检测。检测结果如下表：

从表可知：阴性检测T线显色强度达到G8，证明合成的氯胺酮抗原V活性较高， 能被抗体所识别并发生高效结合。阳性检测证明氯胺酮的PBS溶液对合成的氯胺 酮抗原V有竞争性抑制且有较高灵敏度和梯度。

Claims (10)

1.一种氯胺酮抗原的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

S1，以盐酸氯胺酮为原料，将氨基用2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰酰氯（TeocCl）进行保护；

S2，将氨基保护后的氯胺酮用硼氢化钠还原环已烷上的羰基成醇；

S3，将步骤S2得到的醇与丁二酸酐反应引出含羧基的偶联臂；

S4，将步骤S3得到的产物与大分子蛋白偶联，脱去氨基保护后得到氯胺酮抗原。

2.根据权利要求1所述的一种氯胺酮抗原的制备方法，其特征在于在步骤S1中，具体步骤为：

S101，先将100mg盐酸氯胺酮溶于10mL 水，用1N氢氧化钠溶液将pH值调成8－9；

S102，加入50mL乙酸乙酯萃取，萃取后，将有机层用10ml水洗一次，并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩溶剂，得到82mg 氯胺酮Ⅰ；

S103 ，将82mg 氯胺酮Ⅰ溶于4mL乙腈或二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺，加入90mg咪唑或三乙胺，降至0℃，加入108mg 2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰酰氯，0-30℃ 反应2-24h；

S104，停止反应后，加入50mL 饱和碳酸氢钠溶液，室温搅拌10min，用250mL 乙酸乙酯萃取，有机层用50mL水洗两次，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得139mg 粗品Ⅱ。

3.根据权利要求1所述的一种氯胺酮抗原的制备方法，其特征在于步骤S103中，将82mg氯胺酮Ⅰ溶于4mL乙腈或二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺，加入90mg咪唑或三乙胺，降至0℃，加入108mg 2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰酰氯，20-30℃反应15h。

4.根据权利要求1所述的一种氯胺酮抗原的制备方法，其特征在于在步骤S2中，具体步骤为：

S201，将139mg 粗品Ⅱ溶于20mL 甲醇或乙醇或异丙醇，降温至10℃，加入32mg 硼氢化钠，10-40℃反应2-24h；

S202，停止反应，加入20mL 饱和氯化铵溶液，室温搅拌10min，减压浓缩除去溶剂；

S203，在溶剂中加入200mL乙酸乙酯进行萃取，有机层用50mL 水洗两次，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得121mg油状物，爬板得48mg化合物Ⅲ。

5.根据权利要求4所述的一种氯胺酮抗原的制备方法，其特征在于在步骤S201中，将139mg 粗品Ⅱ溶于20mL 甲醇或乙醇或异丙醇，降温至10℃，加入32mg 硼氢化钠，20-30℃反应8h。

6.根据权利要求1所述的一种氯胺酮抗原的制备方法，其特征在于在步骤S3中，具体步骤为：

S301，将48mg化合物Ⅲ溶于5mL吡啶，加入90mg丁二酸酐，加热回流，反应温度在20-100℃，反应2-24h；

S302，停止反应，减压浓缩除去溶剂；

S303，加入100mL 乙酸乙酯萃取，有机层用10mL水洗两次，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得油状物，爬板得16mg 化合物Ⅳ。

7.根据权利要求1所述的一种氯胺酮抗原的制备方法，其特征在于在步骤S301中，将48mg化合物Ⅲ溶于5mL吡啶，加入90mg丁二酸酐，加热回流，反应温度在20-100℃，反应15h。

8.根据权利要求1所述的一种氯胺酮抗原的制备方法，其特征在于在步骤S4中，具体步骤为：

S401，取16mg 化合物Ⅳ，溶于0.8mL DMF，加入5mg NHS和9mg DCC，室温下反应15h；

S402，将反应液离心取清液，加入到3mL浓度为12mg/mL的BSA的PBS溶液中，4-10℃反应时间15h；

S403，再加入100mg 四丁基氟化铵或四乙基氟化铵或四甲基氟化铵，10-20℃反应12h；

S404，将反应液透析，离心取清液得氯胺酮抗原Ⅴ。

9.根据权利要求8所述的一种氯胺酮抗原的制备方法，其特征在于在步骤S4中，半抗原与大分子蛋白偶联的方法为二环己基碳二亚胺（DCC）/ N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）法。

10.根据权利要求8所述的一种氯胺酮抗原的制备方法，其特征在于在步骤S402中，所述大分子蛋白为BSA或KLH或OVA或BGG。