CN110981949B - 一种氯胺酮抗原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氯胺酮抗原的制备方法,它包括以下步骤:S1,以盐酸氯胺酮为原料,将氨基用2‑三甲基甲硅烷基乙氧基羰酰氯(TeocCl)进行保护;S2,将氨基保护后的氯胺酮用硼氢化钠还原环已烷上的羰基成醇;S3,将步骤b)得到的醇与丁二酸酐反应引出含羧基的偶联臂;S4,将步骤c)得到的产物与大分子蛋白偶联,脱去氨基保护后得到氯胺酮抗原。本发明具有以下有益效果:本发明合成的抗原保留了氯胺酮分子中的仲胺活性基团,从分子结构中的环已烷引出偶联臂,最大程度保留了氯胺酮分子结构,所得抗原有较强的特异性和较高的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域,尤其涉及一种氯胺酮抗原的制备方法。
背景技术
氯胺酮(Ketamine,KET)是苯环已哌啶衍生物,属于第二类精神管制药品。其结构式如下式:
氯胺酮是一种静脉给药的短效麻醉剂,在亚麻醉剂量时就能产生深度镇痛的作用,且没有抑制心脏、呼吸功能的副作用,已经在临床上使用多年。同时氯胺酮具有中枢兴奋、致幻等作用。近年来,在美国、欧洲和亚洲流行于舞厅等娱乐场所,被青少年吸食,追求幻觉、做梦感、漂浮感和精神极度兴奋的感觉,其滥用现象非常严重。氯胺酮所致的不良反应包括:抽搐、惊厥、呼吸抑制、支气管痉挛、恶心、呕吐、胃出血、休克,暂时性失眠等。
氯胺酮及其代谢物的常用检测分析方法主要有:气相色谱法(GC)、气-质联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液-质联用法(LC-MS)、高效毛细管电泳法(HPCE)、酶联免疫吸附法(ELISA)等。
仪器分析方法具有极高的灵敏度和精密度,但需要昂贵的仪器、设备和经过专门培训的技术人员,不适于批量样品的筛选检测和现场即时检测。
近年发展起来的免疫检测法具有操作简便、高效、灵敏、适合大规模检测等优点,已被广泛应用于各类毒品的检测。要建立氯胺酮的免疫检测方法,必须获得具有抗原活性的氯胺酮全抗原。
发明内容
一种氯胺酮抗原的制备方法,将氯胺酮小分子通过化学方法连接到生物大分子上形成具有抗原活性的氯胺酮全抗原,它包括以下步骤:
S1,以盐酸氯胺酮为原料,将氨基用2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰酰氯(TeocCl)进行保护;
S2,将氨基保护后的氯胺酮用硼氢化钠还原环已烷上的羰基成醇;
S3,将步骤b)得到的醇与丁二酸酐反应引出含羧基的偶联臂;
S4,将步骤c)得到的产物与大分子蛋白偶联,脱去氨基保护后得到氯胺酮抗原。
在采用以上技术方案的基础上,本发明还可以采用以下进一步方案:
在步骤S1中,具体步骤为:
S101,先将100mg盐酸氯胺酮溶于10mL水,用1N氢氧化钠溶液将pH值调成8-9;
S102,加入50mL乙酸乙酯萃取,萃取后,将有机层用10ml水洗一次,并用无水硫酸钠干燥,减压浓缩溶剂,得到82mg氯胺酮Ⅰ;
S103,将82mg氯胺酮Ⅰ溶于4mL乙腈或二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺,加入90mg咪唑或三乙胺,降至0℃,加入108mg 2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰酰氯(TeocCl),0-30℃反应2-24h;
S104,停止反应后,加入50mL饱和碳酸氢钠溶液,室温搅拌10min,用250mL乙酸乙酯萃取,有机层用50mL水洗两次,将有机层用无水硫酸钠干燥,减压浓缩得139mg粗品Ⅱ。
进一步的,在该步骤S103中,将82mg氯胺酮Ⅰ溶于4mL乙腈或二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺,加入90mg咪唑或三乙胺,降至0℃,加入108mg 2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰酰氯(TeocCl),20-30℃反应15h。
在步骤S2中,具体步骤为:
S201,将139mg粗品Ⅱ溶于20mL甲醇或乙醇或异丙醇,降温至10℃,加入32mg硼氢化钠,10-40℃反应2-24h;
S202,停止反应,加入20mL饱和氯化铵溶液,室温搅拌10min,减压浓缩除去溶剂;
S203,在溶剂中加入200mL乙酸乙酯进行萃取,有机层用50mL水洗两次,将有机层用无水硫酸钠干燥,减压浓缩得121mg油状物,爬板得48mg化合物Ⅲ。
进一步的,在步骤S201中,将139mg粗品Ⅱ溶于20mL甲醇或乙醇或异丙醇,降温至10℃,加入32mg硼氢化钠,20-30℃反应8h;
在步骤S3中,具体步骤为:
S301,将48mg化合物Ⅲ溶于5mL吡啶,加入90mg丁二酸酐,加热回流,反应温度在20-100℃,反应2-24h;
S302,停止反应,减压浓缩除去溶剂;
S303,加入100mL乙酸乙酯萃取,有机层用10mL水洗两次,将有机层用无水硫酸钠干燥,减压浓缩得油状物,爬板得16mg化合物Ⅳ。
进一步的,在步骤S301中,将48mg化合物Ⅲ溶于5mL吡啶,加入90mg丁二酸酐,加热回流,反应温度在20-100℃,反应15h;
在步骤S4中,具体步骤为:
S401,取16mg化合物Ⅳ,溶于0.8mL DMF,加入5mg NHS和9mg DCC,室温下反应15h;
S402,将反应液离心取清液,加入到3mL浓度为12mg/mL的BSA的PBS溶液中,4-10℃反应时间15h;
S403,再加入100mg四丁基氟化铵或四乙基氟化铵或四甲基氟化铵,10-20℃反应12h;
S404,将反应液透析,离心取清液得氯胺酮抗原Ⅴ。
进一步的,半抗原与大分子蛋白偶联的方法为二环己基碳二亚胺(DCC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)法。
进一步的,在步骤S402中,所述大分子蛋白为BSA或KLH或OVA或BGG。
由于采用了本发明的技术方案,本发明具有以下有益效果:
本发明合成的抗原保留了氯胺酮分子中的仲胺活性基团,从分子结构中的环已烷引出偶联臂,最大程度保留了氯胺酮分子结构,所得抗原有较强的特异性和较高的灵敏度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步阐述,但这些实施例绝不是对本发明的任何限制。
实施例1:
氯胺酮抗原的结构式为:
实施例2:
制备氯胺酮抗原的反应式如下式:
1.氯胺酮的氨基保护:
取100mg盐酸氯胺酮溶于10mL水,用1N氢氧化钠溶液调pH为8-9,用50mL乙酸乙酯萃取,有机层10mL水洗一次,无水硫酸钠干燥,减压浓缩得82mg氯胺酮I。
取82mg氯胺酮I溶于4mL DMF,加入90mg咪唑,降至0℃,加入108mg2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰酰氯(TeocCl),20-30℃反应15h。停止反应,加入50mL饱和碳酸氢钠溶液,室温搅拌10min,用250mL乙酸乙酯萃取,有机层依次用2×50mL水洗,有机层无水硫酸钠干燥,减压浓缩得139mg粗品Ⅱ。
2.将氨基的保护后的氯胺酮分子中的羰基还原为醇:
取139mg粗品Ⅱ溶于20mL甲醇,降温至10℃,加入32mg硼氢化钠,20-30℃反应8h。停止反应,加入20mL饱和氯化铵溶液,室温搅拌10min,减压浓缩除去溶剂。加入200mL乙酸乙酯萃取,有机层依次用2×50mL水洗,有机层无水硫酸钠干燥,减压浓缩得121mg油状物,爬板得48mg化合物III。
3.将上述步骤得到的醇与丁二酸酐反应引出含羧基的偶联臂:
取48mg化合物III溶于5mL吡啶,加入90mg丁二酸酐,加热回流,反应15h,停止反应,减压浓缩除去溶剂。加入100mL乙酸乙酯萃取,有机层依次用2×10mL水洗,有机层无水硫酸钠干燥,减压浓缩得油状物,爬板得16mg化合物IV。
4.氯胺酮抗原V的制备:
取16mg化合物IV,溶于0.8mL DMF,加入5mg NHS和9mg DCC,室温下反应15h,将反应液离心取清液,加入到3mL浓度为12mg/mL的BSA的PBS溶液中,4-10℃反应时间15h。再加入100mg四丁基氟化铵,10-20℃反应时间12h。将反应液透析,离心取清液得氯胺酮抗原V。
实施例3:
氯胺酮抗原V的活性测试:利用胶体金免疫层析法对氯胺酮抗原V进行检测。用喷膜机以1.0μg/cm的喷量,将氯胺酮抗原V以3.0mm的宽度喷在NC膜上,以氯胺酮抗体标记胶体金,结合玻璃纤维纸及吸水纸,组装成试纸条,对试纸条进行检测。检测结果如下表:
从表可知:阴性检测T线显色强度达到G8,证明合成的氯胺酮抗原V活性较高,能被抗体所识别并发生高效结合。阳性检测证明氯胺酮的PBS溶液对合成的氯胺酮抗原V有竞争性抑制且有较高灵敏度和梯度。
Claims (5)
1.一种氯胺酮抗原的制备方法,其特征在于,它包括以下步骤:
S1,以盐酸氯胺酮为原料,将其氨基用2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰酰氯(TeocCl)进行保护,得到化合物Ⅱ;
S2,用硼氢化钠还原化合物Ⅱ上的环已烷上的羰基,得到化合物Ⅲ;
S3,将步骤S2得到的化合物Ⅲ与丁二酸酐反应引出含羧基的偶联臂,得到化合物Ⅳ;
S4,将步骤S3得到的化合物Ⅳ与大分子蛋白偶联,脱去氨基保护后得到氯胺酮抗原。
2.根据权利要求1所述的一种氯胺酮抗原的制备方法,其特征在于在步骤S1中,具体步骤为:
S101,先将100mg盐酸氯胺酮溶于10mL 水,用氢氧化钠溶液将pH值调至8-9;
S102,加入50mL乙酸乙酯萃取,萃取后,将有机层用10ml水洗一次,并用无水硫酸钠干燥,减压浓缩除去乙酸乙酯,得到82mg化合物Ⅰ;
S103,将82mg 化合物Ⅰ溶于4mL乙腈或二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺,加入90mg咪唑或三乙胺,降至0℃,加入108mg 2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰酰氯,0-30℃ 反应2-24h;
S104,停止反应后,加入50mL 饱和碳酸氢钠溶液,室温搅拌10min,用250mL 乙酸乙酯萃取,有机层用50mL水洗两次,将有机层用无水硫酸钠干燥,减压浓缩得139mg化合物Ⅱ。
3.根据权利要求2所述的一种氯胺酮抗原的制备方法,其特征在于步骤S103中,将82mg化合物Ⅰ溶于4mL乙腈或二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺,加入90mg咪唑或三乙胺,降至0℃,加入108mg 2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰酰氯,20-30℃反应15h。
4.根据权利要求1所述的一种氯胺酮抗原的制备方法,其特征在于在步骤S2中,具体步骤为:
S201,将139mg化合物Ⅱ溶于20mL 甲醇或乙醇或异丙醇,降温至10℃,加入32mg 硼氢化钠,10-40℃反应2-24h;
S202,停止反应,加入20mL 饱和氯化铵溶液,室温搅拌10min,减压浓缩除去溶剂;
S203,在S202步骤最终得到的浓缩溶液中加入200mL乙酸乙酯进行萃取,有机层用50mL水洗两次,将有机层用无水硫酸钠干燥,减压浓缩得121mg油状物,薄层层析得48mg化合物Ⅲ。
5.根据权利要求4所述的一种氯胺酮抗原的制备方法,其特征在于在步骤S201中,将139mg化合物Ⅱ溶于20mL 甲醇或乙醇或异丙醇,降温至10℃,加入32mg 硼氢化钠,20-30℃反应8h。
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