CN109254106A - 一种匹伐他汀钙侧链的质量控制方法 - Google Patents

一种匹伐他汀钙侧链的质量控制方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种匹伐他汀钙侧链的质量控制方法，属于原料药质量控制技术领域。本发明的技术方案是：一种匹伐他汀钙侧链的质量控制方法，包括以下步骤：首先使用硝基苯肼类衍生化试剂对匹伐他汀钙侧链（醛）及其手性杂质（醛）进行衍生化，在催化剂存在下，生成有较强紫外吸收的产物；然后使用液相色谱法（紫外检测器），测定上述侧链及其手性杂质的衍生物，从而实现对该侧链及其手性杂质的定性或定量检测。本发明所述匹伐他汀钙侧链的质量控制方法，具有操作简单、灵敏度高、分离度好、回收率高等优点。

Description

一种匹伐他汀钙侧链的质量控制方法
技术领域
本发明涉及一种匹伐他汀钙侧链的质量控制方法，属于原料药质量控制技术领域。
背景技术
匹伐他汀钙，化学名为双{(3R,5S,6E)–7–[2–环丙基–4–(氟代苯基)喹啉–3–苯基]–3,5–二羟基–6–庚烯酸}钙盐，是一种选择性羟甲基戊二酰辅酶A（HMG–CoA）还原酶抑制剂，其降低胆固醇的作用优于已上市的其它他汀类药物。匹伐他汀钙于2003年7月在日本上市，用于治疗高胆固醇血症和家族性高胆固醇血症，最早由日本日产化学株式会社研制开发，由日产化学工业株式会社、兴和株式会社和三共株式会社共同申请的专利。
匹伐他汀钙侧链（式1A,以下简称侧链），化学名为2–[(4R,6S)–6–甲酰基–2,2–二甲基–1,3–二氧六环–4–基]乙酸叔丁酯，是合成匹伐他汀钙的重要片段之一。该化合物也是合成瑞舒伐他汀钙和氟伐他汀钠等他汀类药物的重要片段之一。结构如下：
该化合物含两个手性中心，包含一个对映异构体（1B）和两个非对映异构体（1C和1D）。结构如下：
。
手性杂质（1B、1C和1D）与侧链（1A）具有相同的活性官能团（醛基），容易参与反应，生成相应的手性杂质，进而在中间体及成品中转化成相应的手性杂质。该类手性杂质与目标中间体及成品的结构类似，清除难度很大，因此在侧链（1A）中严格控制手性杂质（1B、1C和1D）的含量至关重要。
侧链（1A）及其手性杂质（1B、1C和1D）无可检测波段的紫外吸收，无法用液相色谱法（紫外检测器）直接进行检测，而使用其它方法检测的灵敏度一般较低，很难达到要求。开发一种衍生化的方法，实现该侧链及其手性杂质在紫外检测器中有效识别，以控制该侧链中手性杂质的含量，对后续控制匹伐他汀钙原料药和制剂的产品质量意义重大。
由于匹伐他汀钙侧链及其手性杂质具有特殊的结构，室温放置即可转化变质，且酸性条件下丙酮叉保护基不稳定、极易脱去保护成羟基，碱性条件下酯键易水解，致使衍生化条件苛刻，转化率较低，很难得到纯品。因此，使用衍生化的方法检测及控制该侧链手性杂质的方法，至今没有文献报道。本发明人曾尝试使用苯肼与该侧链反应生成腙的方法引入显色基团，但转化率较低，且衍生物为油状物，很难分离纯化。因此，开发合适的衍生化方法及质量研究方法，对有效控制匹伐他汀钙原料及其制剂质量有迫切需求。
发明内容
本发明旨在提供一种匹伐他汀钙侧链的质量控制方法。
本发明的技术方案是：一种匹伐他汀钙侧链的质量控制方法，包括以下步骤：
第一步 使用硝基苯肼类衍生化试剂对匹伐他汀钙侧链（醛）及其手性杂质（醛）进行衍生化，在催化剂存在下，生成有较强紫外吸收的产物，反应式如下：
，
式1所述的醛基化合物包括匹伐他汀钙侧链1A及其手性杂质1B、1C和1D。
即以相应的醛基化合物式1（1A、1B、1C、1D）为原料，在催化剂存在下，与硝基苯肼类衍生化试剂反应，制备为式2所述的腙2-1（2A1、2B1、2C1、2D1），以及腙2-2（2A2、2B2、2C2、2D2），所述催化剂选自催化剂选自盐酸、硫酸、磷酸、对甲苯磺酸、樟脑磺酸、对甲苯磺酸吡啶（PPTS），反应溶剂选自甲醇、乙醇、N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈、二氯甲烷，反应温度40–80℃，反应时间为5–30分钟；
第二步 使用液相色谱法（紫外检测器），测定上述侧链及其手性杂质的衍生物，从而实现对该侧链及其手性杂质的定性或定量检测。
测试用样品溶液稳定性考察发现，确定该系列衍生物的顺反异构体在溶液中不稳定，容易消旋化，最终达到体系内顺反异构体的平衡，因此质量研究时需采用顺反异构体的两个峰加合的方法计算主峰及杂质的含量。
优选的，第一步所述硝基苯肼类衍生化试剂优选自2–硝基苯肼、3–硝基苯肼、4–硝基苯肼、2,3–二硝基苯肼、2,4–二硝基苯肼、3,4–二硝基苯肼中的任意一种，优选2,4–二硝基苯肼。
优选的，第一步反应溶剂选自乙腈。
优选的，第一步反应温度60–70 ℃。
优选的，第一步催化剂选自PPTS。
优选的，第一步反应时间选自5–10分钟。
优选的，第一步硝基苯肼与总醛的摩尔比选自 1:1–2:1，更优选1：1。
第一步式2所述的腙为侧链衍生物2A（包含2A1和2A2，互为顺反异构体），及其手性杂质衍生物2B（包含2B1和2B2，互为顺反异构体）、2C（包含2C1和2C2，互为顺反异构体）和2D（包含2D1和2D2，互为顺反异构体）。结构如下：
本发明所述匹伐他汀钙醛基侧链为匹伐他汀钙侧链（1A），该侧链可能包含其手性杂质1B、1C和1D其中的一种或几种、或不包含。硝基苯肼类衍生化试剂优选2,4–二硝基苯肼；催化剂优选对甲苯磺酸吡啶（PPTS）；溶剂优选乙腈或甲醇，最优选乙腈；反应温度优选50-80℃，最优选60-70℃；反应时间优选5-30分钟，最优选10分钟；2,4–二硝基苯肼与总醛的摩尔比优选1:1–2:1，最优选1:1。
优选的，所述柱前衍生化的方法如下：
取匹伐他汀钙侧链（1A），精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成每1ml约含15mg的溶液，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加4–甲基苯磺酸吡啶的乙腈溶液（取4–甲基苯磺酸吡啶适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml约含0.3mg的溶液）2ml与2,4–二硝基苯肼乙腈溶液（取2,4–二硝基苯肼适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml约含2,4–二硝基苯肼11.5mg的溶液）2ml，摇匀，在60℃水浴中反应10min后取出，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（a），精密量取2ml，置10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（b）。
优选的，所述的液相色谱法如下：
a、匹伐他汀钙侧链（1A）的含量测定方法
用五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂(Curosil PFP，4.6mm×250mm，5µm)；以1%醋酸溶液–甲醇为流动相（体积比20:80，所述1%醋酸溶液为用稀醋酸钠调整至pH值为3.8的溶液），检测波长为245nm，柱温为30℃，流速为每分钟1.0ml。精密量取供试品溶液（b）10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰Ⅰ保留时间的3.5倍，按峰面积归一化法计算保留时间分别约为15min（峰Ⅰ）和23min（峰Ⅱ）的两主峰含量之和。
b、非对映异构体（1C和1D）的含量测定方法
用五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂(Curosil PFP，4.6mm×250mm，5µm)；以1%醋酸溶液–甲醇为流动相（体积比20:80，所述1%醋酸溶液为用稀醋酸钠调整至pH值为3.8的溶液），检测波长为245nm，柱温为30℃，流速为每分钟1.0ml。精密量取供试品溶液（b）10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰Ⅰ保留时间的3.5倍，按峰面积归一化法计算相对保留时间（以主峰Ⅰ相对保留时间为1.0计）分别约为1.1和1.7的两峰含量之和（该色谱条件下，1C的顺式异构体与1D的顺式异构体的保留时间相同，1C的反式异构体和1D的反式异构体的保留时间相同）。
c、对映异构体（1B）的含量测定方法
精密量取含量测定项下供试品溶液（a）2ml，置10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。用五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂(Curosil PFP，4.6mm×250mm，5µm)；以正己烷–无水乙醇（体积比70:30）为流动相，检测波长为245nm，柱温为30℃，流速为每分钟1.0ml。精密量取供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰Ⅰ保留时间的4.5倍，按峰面积归一化法计算相对保留时间[以主峰Ⅰ（保留时间约为7 min）计]分别约为1.3和2.6的两峰含量之和。
有益效果：本发明所述匹伐他汀钙侧链的质量控制方法，具有操作简单、灵敏度高、分离度好、回收率高等优点。
本发明所述衍生化方法，具有条件温和、方法简单、转化率高等优点。通过分析方法的优化可以实现各衍生物的有效分离，分离度符合现行版药典要求，进而可以实现对该侧链手性杂质的有效控制，以实现对匹伐他汀钙侧链的手性杂质的有效控制，对有效控制匹伐他汀钙原料药和制剂的产品质量具有积极的进步意义。
因为匹伐他汀钙侧链也是合成瑞舒伐他汀钙和氟伐他汀钠等他汀类药物的重要片段之一，本发明保护的质量研究方法，也适用于瑞舒伐他汀钙和氟伐他汀钠等他汀类药物。
本发明同时保护所提及的侧链及其杂质的衍生物、及衍生化的方法，并将以分案的形式进行详细论述。
具体实施方式
以下的实施例在于详细说明本发明，但是不应该构成对本发明的限制。
实施例1：使用优化后的条件，制备匹伐他汀钙侧链及其手性杂质的衍生物，检测产品收率和质量，验证该衍生化方法的可行性。
于50 mL单口瓶中，依次加入乙腈（10 mL）、化合物1（1.0 g，3.88 mmol）、2,4–二硝基苯肼（0.76 g，3.88 mmol）、对甲苯磺酸吡啶（10 mg），加毕，于预热至60 – 70 ℃的油浴锅中保温反应10分钟。TLC检测（石油醚:乙酸乙酯 = 3:1）反应完全。将反应溶液加入到15mL饱和碳酸氢钠水溶液中淬灭反应，用二氯甲烷（10 mL × 2）萃取，浓缩得粗品。粗品经硅胶柱层析（乙酸乙酯:石油醚 = 10:1）纯化得化合物2（顺反异构体的混合物）。
a、参考实施例1的方法，以2–[(4R,6S)–6–甲酰基–2,2二甲基–1,3–二氧六环–4–基]乙酸叔丁酯（1A）为原料，制得2–((4R,6S)–6–((2–(2,4–二硝基苯基)腙基)甲基)–2,2–二甲基–1,3–二氧六环–4–烷基)乙酸叔丁酯（2A）黄色固体，收率97.2%，纯度为98.9%（2A1和2A2二峰纯度之和）。
b、参考实施例1的方法，以2–[(4S,6R)–6–甲酰基–2,2二甲基–1,3–二氧六环–4–基]乙酸叔丁酯（1B）为原料，制得2–((4S,6R)–6–((2–(2,4–二硝基苯基)腙基)甲基)–2,2–二甲基–1,3–二氧六环–4–烷基)乙酸叔丁酯（2B），收率96.5%，纯度为98.3%（2B1和2B2二峰纯度之和）。
c、参考实施例1的方法，以2–[(4S,6S)–6–甲酰基–2,2二甲基–1,3–二氧六环–4–基]乙酸叔丁酯（1C）为原料，制备2–((4S,6S)–6–((2–(2,4–二硝基苯基)腙基)甲基)–2,2–二甲基–1,3–二氧六环–4–烷基)乙酸叔丁酯（2C），收率95.7%，纯度为97.2%（2C1和2C2二峰纯度之和）。
d、参考实施例1的方法，以2–[(4R,6R)–6–甲酰基–2,2二甲基–1,3–二氧六环–4–基]乙酸叔丁酯（1D）为原料合成2–((4R,6R)–6–((2–(2,4–二硝基苯基)腙基)甲基)–2,2–二甲基–1,3–二氧六环–4–烷基)乙酸叔丁酯（2D），收率95.4%，纯度为96.4%（2D1和2D2二峰纯度之和）。
实施例2：使用优化后的条件，测定匹伐他汀钙侧链及其手性杂质与2,4–二硝基苯肼反应的转化率，验证该柱前衍生化条件的可行性。
于50 mL单口瓶中，依次加入乙腈（10 mL）、化合物1（1.0 g，3.88 mmol）、2,4–二硝基苯肼（0.76 g，3.88 mmol）、对甲苯磺酸吡啶（10 mg），加毕，于预热至60 – 70 ℃的油浴锅中保温反应10分钟。TLC检测（石油醚:乙酸乙酯 = 3:1）反应完全。HPLC检测反应液中2–1和2–2二峰纯度之和。
a、参考实施例2的方法，以2–[(4R,6S)–6–甲酰基–2,2二甲基–1,3–二氧六环–4–基]乙酸叔丁酯（1A）为原料，制得2–((4R,6S)–6–((2–(2,4–二硝基苯基)腙基)甲基)–2,2–二甲基–1,3–二氧六环–4–烷基)乙酸叔丁酯（2A，混合物），HPLC检测母液中2A1和2A2二峰纯度之和为96.7%。
b、参考实施例2的方法，以2–[(4S,6R)–6–甲酰基–2,2二甲基–1,3–二氧六环–4–基]乙酸叔丁酯（1B）为原料，制得2–((4S,6R)–6–((2–(2,4–二硝基苯基)腙基)甲基)–2,2–二甲基–1,3–二氧六环–4–烷基)乙酸叔丁酯（2B，混合物），HPLC检测母液中2B1和2B2二峰纯度之和为96.3%。
c、参考实施例2的方法，以2–[(4S,6S)–6–甲酰基–2,2二甲基–1,3–二氧六环–4–基]乙酸叔丁酯（1C）为原料，制得2–((4S,6S)–6–((2–(2,4–二硝基苯基)腙基)甲基)–2,2–二甲基–1,3–二氧六环–4–烷基)乙酸叔丁酯（2C，混合物），HPLC检测母液中2C1和2C2二峰纯度之和为95.8%。
d、参考实施例2的方法，以2–[(4R,6R)–6–甲酰基–2,2二甲基–1,3–二氧六环–4–基]乙酸叔丁酯（1D）为原料，制得2–((4R,6R)–6–((2–(2,4–二硝基苯基)腙基)甲基)–2,2–二甲基–1,3–二氧六环–4–烷基)乙酸叔丁酯（2D，混合物），HPLC检测母液中2D1和2D2二峰纯度之和为95.2%。
实施例3：匹伐他汀钙侧链（1A），及其对映异构体（1B）和非对映异构体（1C和1D）的检测方法
取匹伐他汀钙侧链（1A），精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成每1ml约含15mg的溶液，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加4–甲基苯磺酸吡啶的乙腈溶液（取4–甲基苯磺酸吡啶适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml约含0.3mg的溶液）2ml与2,4–二硝基苯肼乙腈溶液（取2,4–二硝基苯肼适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml约含2,4–二硝基苯肼11.5mg的溶液）2ml，摇匀，在60℃水浴中反应10min后取出，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（a），精密移取2ml，置10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（b）。
a、匹伐他汀钙侧链（1A）的含量测定方法
用五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂（Curosil PFP，4.6mm×250mm，5µm）；以1%稀醋酸溶液（用稀醋酸钠试剂调pH值至3.8）–甲醇（20:80）为流动相，检测波长为245nm，柱温为30℃，流速为每分钟1.0ml。精密量取供试品溶液（b）10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰Ⅰ保留时间的3.5倍，按峰面积归一化法计算保留时间分别约为15min（峰Ⅰ）和23min（峰Ⅱ）的两主峰含量之和。
b、非对映异构体（1C和1D）的含量测定方法
用五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂（Curosil PFP，4.6mm×250mm，5µm）；以1%稀醋酸溶液（用稀醋酸钠试剂调pH值至3.8）–甲醇（20:80）为流动相，检测波长为245nm，柱温为30℃，流速为每分钟1.0ml。精密量取供试品溶液（b）10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰Ⅰ保留时间的3.5倍，按峰面积归一化法计算相对保留时间（以主峰Ⅰ相对保留时间为1.0计）分别约为1.1和1.7的两峰含量之和（该色谱条件下，1C的顺式异构体与1D的顺式异构体的保留时间相同，1C的反式异构体和1D的反式异构体的保留时间相同）。
（1）专属性
取非对映异构体1C和1D杂质对照品各15mg，精密称定，置20ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，作为非对映异构体对照品贮备液；取匹伐他汀钙侧链（1A）150mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入非对映异构体对照品贮备液1ml，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液；精密量取混合溶液2ml，加4–甲基苯磺酸吡啶的乙腈溶液2ml与2,4–二硝基苯肼乙腈溶液2ml，摇匀，在60℃水浴中反应10分钟后取出，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（a），精密量取2ml，置10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（b）。
取匹伐他汀钙侧链（1A）150mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取混合溶液2ml，加4–甲基苯磺酸吡啶的乙腈溶液2ml与2,4–二硝基苯肼乙腈溶液2ml，摇匀，在60℃水浴中反应10分钟后取出，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
量取乙腈2ml，加4–甲基苯磺酸吡啶的乙腈溶液2ml与2,4–二硝基苯肼的乙腈溶液2ml，摇匀，在60℃水浴中反应10分钟后取出，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取2ml，置10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为空白溶液。
精密量取上述溶液溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰Ⅰ保留时间的3.5倍。
结果：空白对测定无干扰；主峰和非对映异构体峰与相邻峰的分离度均大于2.0；方法专属性良好。
（2）灵敏度（检测限）
精密量取非对映异构体对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置50ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml，加4–甲基苯磺酸吡啶的乙腈溶液2ml与2,4–二硝基苯肼乙腈溶液2ml，摇匀，在60℃水浴中反应10分钟后取出，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为检测限供试品溶液。
精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰Ⅰ保留时间的3.5倍。
结果：非对映异构体峰的信噪比约为3，检测限约为0.6ng，检测限浓度约相当供试品溶液浓度的0.01%，方法灵敏度符合要求。
（3）准确度（回收率）
取非对映异构体1C和1D对照品各15mg，精密称定，置20ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，作为非对映异构体对照品贮备液；取匹伐他汀钙侧链（1A）300mg，精密称定，置20ml量瓶中，平行配制9份，3份1组；分别加入非对映异构体对照品贮备液0. 5ml、1ml和1.5ml，加乙腈溶解并稀释至刻度（相当于分别含非对映异构体0.25%、0.5%和0.75%），摇匀，分别精密量取2ml，加4–甲基苯磺酸吡啶的乙腈溶液2ml与2,4–二硝基苯肼乙腈溶液2ml，摇匀，在60℃水浴中反应10分钟后取出，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为回收率供试品溶液。
精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰Ⅰ保留时间的3.5倍。结果见表1。
表1
结论：平均回收率为98.1%，方法准确度符合要求（90.0%～110.0%）。
c、对映异构体（1B）的含量测定方法
精密移取含量测定项下供试品溶液（a）2ml，置10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。用五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂（Curosil PFP，4.6mm×250mm，5µm）；以正己烷–无水乙醇（70:30）为流动相，检测波长为245nm，柱温为30℃，流速为每分钟1.0ml。精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰Ⅰ保留时间的4.5倍，按峰面积归一化法计算相对保留时间[以主峰Ⅰ（保留时间约为7min）计]分别约为1.3和2.6的两峰含量之和。
（1）专属性
取对映异构体1B杂质对照品15mg，精密称定，置20ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，作为对映异构体对照品贮备液；取匹伐他汀钙侧链（1A）150mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入非对映异构体对照品贮备液1ml，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液；精密量取混合溶液2ml，加4–甲基苯磺酸吡啶的乙腈溶液2ml与2,4–二硝基苯肼乙腈溶液2ml，摇匀，在60℃水浴中反应10分钟后取出，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（a），精密量取2ml，置10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（b）。
取匹伐他汀钙侧链（1A）150mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取混合溶液2ml，加4–甲基苯磺酸吡啶的乙腈溶液2ml与2,4–二硝基苯肼乙腈溶液2ml，摇匀，在60℃水浴中反应10分钟后取出，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
量取乙腈2ml，加4–甲基苯磺酸吡啶的乙腈溶液2ml与2,4–二硝基苯肼乙腈溶液2ml，摇匀，在60℃水浴中反应10分钟后取出，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取2ml，置10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为空白溶液。
精密量取上述溶液溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰Ⅰ保留时间的4.5倍。
结果：空白对测定无干扰；主峰和对映异构体峰与相邻峰的分离度均大于2.0；方法专属性良好。
（2）灵敏度（检测限）
精密量取对映异构体对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置25ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml，加4–甲基苯磺酸吡啶的乙腈溶液2ml与2,4–二硝基苯肼乙腈溶液2ml，摇匀，在60℃水浴中反应10分钟后取出，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为检测限供试品溶液。
精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰Ⅰ保留时间的4.5倍。
结果：非对映异构体峰的信噪比约为3，检测限约为1.2ng，检测限浓度约相当供试品溶液浓度的0.02%，方法灵敏度符合要求。
（3）准确度（回收率）
取对映异构体（1B）对照品30mg，精密称定，置20ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，作为对映异构体对照品贮备液；取匹伐他汀钙侧链（1A）300mg，精密称定，置20ml量瓶中，平行配制9份，3份1组；分别加入对映异构体对照品贮备液0. 5ml、1ml和1.5ml，加乙腈溶解并稀释至刻度（相当于分别含对映异构体0.25%、0.5%和0.75%），摇匀，分别精密量取2ml，加4–甲基苯磺酸吡啶的乙腈溶液2ml与2,4–二硝基苯肼乙腈溶液2ml，摇匀，在60℃水浴中反应10分钟后取出，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为回收率供试品溶液。
精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰Ⅰ保留时间的3.5倍。结果见表2.
表2
结论：平均回收率为96.1%，方法准确度符合要求（90.0%～110.0%）。

Claims (10)

1.一种匹伐他汀钙侧链的质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步 使用硝基苯肼类衍生化试剂对匹伐他汀钙侧链及其手性杂质进行衍生化，生成有较强紫外吸收的产物；反应式如下：
，即以相应的醛基化合物式1为原料，在催化剂存在下，与硝基苯肼类衍生化试剂反应，制备为式2所述的腙2-1，以及腙2-2，所述催化剂选自盐酸、硫酸、磷酸、对甲苯磺酸、樟脑磺酸、对甲苯磺酸吡啶之一，反应溶剂选自甲醇、乙醇、N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈、二氯甲烷之一，反应温度40–80℃，反应时间5–30分钟；
第二步 使用配备紫外检测器的液相色谱法测定第一步侧链及其手性杂质的衍生物。
2.根据权利要求1所述匹伐他汀钙侧链的质量控制方法，其特征在于，第二步采用顺反异构体的两个峰加合的方法计算主峰及杂质的含量。
3.根据权利要求1所述匹伐他汀钙侧链的质量控制方法，其特征在于，第一步所述硝基苯肼类衍生化试剂选自2–硝基苯肼、3–硝基苯肼、4–硝基苯肼、2,3–二硝基苯肼、2,4–二硝基苯肼、3,4–二硝基苯肼中的任意一种。
4.根据权利要求1所述匹伐他汀钙侧链的质量控制方法，其特征在于，第一步反应溶剂选自乙腈。
5.根据权利要求1所述匹伐他汀钙侧链的质量控制方法，其特征在于，第一步反应温度为60–70 ℃。
6.根据权利要求1所述匹伐他汀钙侧链的质量控制方法，其特征在于，第一步催化剂选自对甲苯磺酸吡啶。
7.根据权利要求1所述匹伐他汀钙侧链的质量控制方法，其特征在于，第一步反应时间为5–10分钟。
8.根据权利要求1所述匹伐他汀钙侧链的质量控制方法，其特征在于，第一步硝基苯肼与总醛的摩尔比为 1:1–2:1。
9.根据权利要求1所述匹伐他汀钙侧链的质量控制方法，其特征在于，第一步硝基苯肼与总醛的摩尔比为1:1。
10.根据权利要求1所述匹伐他汀钙侧链的质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步 取匹伐他汀钙侧链1A，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成每1ml约含15mg的溶液，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加浓度为0.3mg /ml的4–甲基苯磺酸吡啶的乙腈溶液2ml与2,4–二硝基苯肼乙腈溶液2ml，摇匀，在60℃水浴中反应10min后取出，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液a，精密量取2ml，置10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液b；
第二步 含量测定：
匹伐他汀钙侧链1A的含量测定方法：
用五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂；以1%醋酸溶液–甲醇为流动相，检测波长为245nm，柱温为30℃，流速为每分钟1.0ml；所述1%醋酸溶液–甲醇流动相，1%醋酸溶液与甲醇的体积比20:80，所述1%醋酸溶液为用稀醋酸钠调整至pH值为3.8的溶液；
精密量取供试品溶液b 10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰Ⅰ保留时间的3.5倍，按峰面积归一化法计算保留时间分别为15min和23min的两主峰含量之和；
非对映异构体1C和1D的含量测定方法：
用五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂；以1%醋酸溶液–甲醇为流动相，检测波长为245nm，柱温为30℃，流速为每分钟1.0ml；所述1%醋酸溶液–甲醇流动相，1%醋酸溶液与甲醇的体积比20:80，所述1%醋酸溶液为用稀醋酸钠调整至pH值为3.8的溶液；
精密量取供试品溶液b 10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰Ⅰ保留时间的3.5倍，按峰面积归一化法计算相对保留时间分别为1.1和1.7的两峰含量之和；
对映异构体1B的含量测定方法：
精密量取含量测定项下供试品溶液a 2ml，置10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，用五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂，以正己烷–无水乙醇为流动相，检测波长为245nm，柱温为30℃，流速为每分钟1.0ml；
精密量取供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰Ⅰ保留时间的4.5倍，按峰面积归一化法计算相对保留时间Ⅰ分别为1.3和2.6的两峰含量之和，所述正己烷–无水乙醇流动相的体积比为70:30。
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