CN112625119B - 一种雌酮抗原及其制备方法 - Google Patents

一种雌酮抗原及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112625119B
CN112625119B CN202011338549.3A CN202011338549A CN112625119B CN 112625119 B CN112625119 B CN 112625119B CN 202011338549 A CN202011338549 A CN 202011338549A CN 112625119 B CN112625119 B CN 112625119B
Authority
CN
China
Prior art keywords
estrone
antigen
aminobutyric acid
reaction
triene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011338549.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112625119A (zh
Inventor
曾繁荣
郑曙剑
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Clongene Biotech Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Clongene Biotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Clongene Biotech Co ltd filed Critical Hangzhou Clongene Biotech Co ltd
Priority to CN202011338549.3A priority Critical patent/CN112625119B/zh
Publication of CN112625119A publication Critical patent/CN112625119A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112625119B publication Critical patent/CN112625119B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4717—Plasma globulins, lactoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/77—Ovalbumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及生物化工技术领域，公开了一种雌酮抗原及其制备方法。该雌酮抗原的制备方法包括以下步骤：a）以雌酮为原料，与4‑氨基丁酸进行缩合反应并还原后，得到3‑羟基雌甾‑1,3,5(10)‑三烯‑17‑氨基丁酸；b）将步骤a）得到的产物用三氟乙酸酐保护羟基与仲胺基后，得到3‑三氟乙酰氧基雌甾‑1,3,5(10)‑三烯‑17‑(N‑三氟乙酰基)氨基丁酸；c）将步骤b）得到的产物与载体蛋白偶联，脱去保护基后，得到雌酮抗原。本发明的雌酮抗原比较完整地保留了雌酮的分子结构以及活性基团羟基，因而具有较强的特异性和较高的灵敏度。

Description

一种雌酮抗原及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及一种雌酮抗原及其制备方法。
背景技术
雌酮(Estrone)又名雌素酮，学名“3-羟雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-酮”，其结构式如下：
Figure BDA0002797903910000011
雌酮是一种甾体激素类化合物，具有环戊烷并多氢菲母核，为天然内源性雌激素，可从孕妇或孕马的妊娠尿液中提取而得，也存在于其他妊娠动物的卵巢或其卵泡液、人的胎盘中，通常用作药物治疗子宫发育不全、月经失调、更年期障碍等。
雌酮的提取、加工及医用治疗过程中因排废等会使雌酮在江河、湖泊、水库等水体中累积，造成环境水体的污染，继而由于生物富集作用进入食物链，造成食品污染。雌酮已证实在很低的浓度下就会干扰人体内分泌系统，危害人体生殖机能，阻碍卵细胞生长，抑制精子产生，对人体健康的影响不容小觑。因此，建立特异性强，灵敏度高的雌酮检测方法已成为环境内分泌干扰物质研究领域中一大课题及改善食品安全现状、保护人类健康所要关注的问题之一。
雌酮常用检测分析方法主要有：气相色谱法(GC)、气-质联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液-质联用法(LC-MS)、高效毛细管电泳法(HPCE)、免疫分析法(IA)等。仪器分析方法具有极高的灵敏度和精密度，但需要昂贵的仪器、设备和经过专门培训的技术人员，不适于批量样品的筛选检测和现场即时检测。近年发展起来的免疫检测法具有操作简便、高效、灵敏、适合大规模检测等优点，已被广泛应用于各类毒品的检测。
要建立雌酮的免疫检测方法，必须获得具有抗原活性的雌酮全抗原。但现有的雌酮全抗原通常存在制备过程复杂、抗原活性较低的问题。例如，公开号为CN109180768B的中国专利文献公开了一种雌酮衍生物、免疫原、抗体、酶标偶联物、检测试剂及其制备方法，该雌酮衍生物通过在雌酮羟基上引入马来酰亚胺，使其能与牛血清蛋白偶联制成全抗原，该方法通过三步反应即可制得雌酮全抗原，制备方法简单，但无法保留雌酮中的活性基团羟基，故获得的全抗原存在抗原活性低、特异性差、灵敏度低的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种雌酮抗原及其制备方法。该雌酮抗原能比较完整地保留雌酮分子结构中的活性基团，具有较强的特异性和较高的灵敏度。
本发明的具体技术方案为：
一种雌酮抗原，其结构式为：
Figure BDA0002797903910000021
其中，R为载体蛋白。
一种所述雌酮抗原的制备方法，包括以下步骤：
a)以雌酮为原料，与4-氨基丁酸进行缩合反应并还原后，得到3-羟基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17- 氨基丁酸；
b)将步骤a)得到的产物用三氟乙酸酐保护羟基与仲胺基后，得到3-三氟乙酰氧基雌甾 -1,3,5(10)-三烯-17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸；
c)将步骤b)得到的产物与载体蛋白偶联，脱去保护基后，得到雌酮抗原。
本发明雌酮抗原的制备原理如下：步骤a)中，通过与4-氨基丁酸进行缩合和还原反应，将含有羧基且具有一定长度的连接臂引入雌酮分子中；步骤b)中，采用三氟乙酸酐对羟基和仲胺基进行保护，防止半抗原在与载体蛋白进行偶联时小分子间相互偶联，导致产品不纯及收率下降；步骤c)中，步骤b)的产物通过羧基与载体蛋白中的氨基偶联，形成具有免疫原性的雌酮抗原。
采用本发明的方法制备雌酮抗原，能比较完整地保留雌酮的分子结构以及活性基团羟基，使获得的抗原具有较强的特异性和较高的灵敏度。此外，本发明的方法工艺步骤简单，步骤a)-c)在较温和的反应条件下即可实现，反应收率较高，且不需要使用毒性和腐蚀性较强的试剂。
作为优选，步骤a)的具体过程如下：将雌酮和4-氨基丁酸溶于有机溶剂中，加入缩合反应催化剂，在60-80℃下反应10-24h；降至10-30℃后，加入硼氢化钠，在10-30℃下反应10-24h后，分离产物，得到3-羟基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-氨基丁酸。
进一步地，步骤a)中，所述有机溶剂为甲醇和/或乙醇。
进一步地，步骤a)中，所述雌酮与4-氨基丁酸的质量比为1.8-2.8:1；。
进一步地，步骤a)中，所述缩合反应催化剂为对甲基苯磺酸，所述缩合反应催化剂与雌酮的质量比为1:25-35。
进一步地，步骤a)中，所述硼氢化钠与雌酮的质量比为1:5-6，所述硼氢化钠分批次加入。
作为优选，步骤b)的具体过程如下：将步骤a)得到的产物溶于反应溶剂中，加入三氟乙酸酐后，在10-60℃下反应，分离产物，得到3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-(N- 三氟乙酰基)氨基丁酸。
进一步地，步骤b)中，所述在10-60℃下反应的具体过程如下：先在50℃下反应1h，再室温反应15h。
进一步地，步骤b)中，所述步骤a)得到的产物与三氟乙酸酐的质量体积比为 1-1.5g:1mL。
进一步地，步骤b)中，所述反应溶剂为丙酮。
作为优选，步骤c)中，偶联的具体过程如下：将步骤b)得到的产物溶于偶联溶剂中，加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)，在15-30℃下反应12-18h后，离心取上清液，加入到载体蛋白的PBS溶液中，在4-20℃下反应13-18h。
进一步地，步骤c)中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)、鸡卵白蛋白(OVA)、牛丙种球蛋白(BGG)中的一种。
进一步地，步骤c)中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白，所述步骤b)得到的产物、N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、载体蛋白的质量比为1:0.21-0.24:0.37-0.39:0.8-1。
NHS和DCC相对于反应物的用量会影响产品收率和效价：若NHS和DCC的相对用量过大，则易造成载体蛋白之间相互偶联，导致沉淀过多，致使产品效价及产品收率降低；若NHS和DCC的相对用量过小，则易造成半抗原中的羧基活化不完全，产品效价降低。
载体蛋白相对于3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸(即步骤b)的产物)的用量也会影响产品收率和效价：若载体蛋白的相对用量过小，则会导致产品收率过低；若载体蛋白的相对用量过大，则会导致载体蛋白包裹过多的雌酮分子，影响抗原与抗体的结合，进而导致产品效价过低。
本发明通过将步骤b)得到的产物、N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、载体蛋白BSA的质量比控制在1:0.21-0.24:0.37-0.39:0.8-1的范围内，能获得较高的收率，且制得的雌酮抗原具有较高的效价，因而具有较高的灵敏度。
进一步地，步骤c)中，所述载体蛋白的PBS溶液中，载体蛋白的浓度为4-6mg/mL。
进一步地，步骤c)中，所述偶联溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
作为优选，步骤c)中，脱去保护基的具体过程如下：将偶联反应后获得的反应液pH调节至11.5-12.5后，置于pH为11.5-12.5的氢氧化钠的PBS溶液中透析20-24h，再置于pH为7.4的PBS溶液中透析70-72h，期间每20-24h更换PBS溶液一次。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明的制备方法能比较完整地保留雌酮分子结构及其中的活性基团羟基，使获得的抗原具有较强的特异性和较高的灵敏度；
(2)本发明的制备方法工艺步骤简单，反应条件温和，反应收率较高，且不需要使用毒性和腐蚀性较强的试剂。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种雌酮抗原的制备方法，包括以下步骤：
a)合成3-羟基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-氨基丁酸(II)：
Figure BDA0002797903910000041
具体过程如下：将质量比为1.8-2.8:1；雌酮(I)和4-氨基丁酸溶于有机溶剂中，加入缩合反应催化剂对甲基苯磺酸，所述缩合反应催化剂与雌酮的质量比为1:25-35，在60-80℃下反应 10-24h；降至10-30℃后，加入硼氢化钠，所述硼氢化钠与雌酮的质量比为1:5-6，在10-30℃下反应10-24h后，分离产物，得到3-羟基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-氨基丁酸(II)；
b)合成3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸(III)：
Figure BDA0002797903910000042
具体过程如下：将步骤a)得到的产物(II)溶于反应溶剂中，加入三氟乙酸酐，所述步骤a) 得到的产物(II)与三氟乙酸酐的质量体积比为1-1.5g:1mL，先在50℃下反应1h，再室温反应15h，分离产物，得到3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸(III)；
c)合成雌酮抗原(IV)：
Figure BDA0002797903910000051
具体过程如下：将步骤b)得到的产物(III)溶于偶联溶剂中，加入NHS和DCC，所述步骤 b)得到的产物(III)、NHS、DCC的质量比为1:0.21-0.24:0.37-0.39，在15-30℃下反应12-18h 后，离心取上清液，加入到载体蛋白的PBS溶液中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、 KLH、OVA、BGG中的一种(当载体蛋白为BSA时，所述载体蛋白与步骤b)得到的产物(III) 的质量比为1:0.8-1)，在4-20℃下反应13-18h；然后将反应液的pH调节至11.5-12.5，置于 pH为11.5-12.5的氢氧化钠的PBS溶液中透析20-24h，再置于pH为7.4的PBS溶液中透析 70-72h，期间每20-24h更换PBS溶液一次，离心取清液，得到雌酮抗原(IV)。
实施例1
一种雌酮抗原的制备方法，包括以下步骤：
a)合成3-羟基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-氨基丁酸(II)：
将1620mg雌酮(I)和830mg 4-氨基丁酸溶于30mL乙醇中，加入60mg对甲基苯磺酸，在 80℃下回流反应14h；降至室温后，10min内分四次加入300mg硼氢化钠，在室温下反应15h；反应结束后，减压浓缩至干，加入300mL水和1200mL乙酸乙酯，萃取分层，有机层依次用2×300mL水洗后，将有机层用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到2280mg粗品3-羟基雌甾 -1,3,5(10)-三烯-17-氨基丁酸(Ⅱ)；
b)合成3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸(III)：
将2280mg粗品3-羟基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-氨基丁酸(Ⅱ)溶于120mL丙酮中，加入1.68mL 三氟乙酸酐，先在50℃下反应1h，再室温反应15h；反应结束后，减压浓缩至干，用2×6mL 乙醇提取浓缩物，再对提取物进行柱层析，得到336mg 3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯 -17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸(Ⅲ，用于实施例1及对比例2-5有关雌酮抗原的制备)；
c)合成雌酮抗原(IV)：
将56mg 3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸(Ⅲ)溶于2mL DMF 中，加入12mg NHS和21mg DCC，在室温下反应15h后，离心取上清液，加入到10mL BSA 的PBS溶液(其中，BSA的浓度为5mg/mL，PBS的浓度为0.1mol/L，pH为7.4)中，在15℃下反应15h；然后用1mol/L的氢氧化钠溶液将反应液的pH调节至12，置于pH为12的氢氧化钠的PBS溶液(其中，PBS的浓度为0.1mol/L)中透析24h，再置于pH为7.4的PBS溶液中透析72h，期间每24h更换PBS溶液一次；将透析后的反应液离心，取上清液，得到12mL 3.5mg/mL的雌酮抗原(IV)。
实施例2
一种雌酮抗原的制备方法，包括以下步骤：
a)合成3-羟基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-氨基丁酸(II)：
将270mg雌酮和130mg 4-氨基丁酸溶于5mL甲醇中，加入10.8mg对甲基苯磺酸，在70℃下回流反应24h；降至30℃后，10min内分四次加入45mg硼氢化钠，在30℃下反应24h；反应结束后，减压浓缩至干，加入50mL水和200mL乙酸乙酯，萃取分层，有机层依次用2×50mL水洗后，将有机层用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到344mg粗品3-羟基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-氨基丁酸(Ⅱ)；
b)合成3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸(III)：
将344mg粗品3-羟基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-氨基丁酸(Ⅱ)溶于20mL丙酮中，加入0.34mL 三氟乙酸酐，先在50℃下反应1h，再室温反应15h；反应结束后，减压浓缩至干，用2×1mL 乙醇提取浓缩物，再对提取物进行柱层析，得到51mg 3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯 -17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸(Ⅲ)；
c)合成雌酮抗原(IV)：
将51mg 3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸(Ⅲ)溶于2mL DMF 中，加入11mg NHS和18.9mg DCC，在15℃下反应18h后，离心取上清液，加入到9mL BSA 的PBS溶液(其中，BSA的浓度为5mg/mL，PBS的浓度为0.1mol/L，pH为7.4)中，在4℃下反应18h；然后用1mol/L的氢氧化钠溶液将反应液的pH调节至11.5，置于pH为11.5的氢氧化钠的PBS溶液(其中，PBS的浓度为0.1mol/L)中透析20h，再置于pH为7.4的PBS 溶液中透析70h，期间每20h更换PBS溶液一次；将透析后的反应液离心，取上清液，得到10.5mL 3mg/mL的雌酮抗原(IV)。
实施例3
一种雌酮抗原的制备方法，包括以下步骤：
a)合成3-羟基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-氨基丁酸(II)：
将270mg雌酮和135mg 4-氨基丁酸溶于5mL乙醇中，加入7.7mg对甲基苯磺酸，在60℃下反应10h；降至10℃后，10min内分四次加入54mg硼氢化钠，在10℃下反应10h；反应结束后，减压浓缩至干，加入50mL水和200mL乙酸乙酯，萃取分层，有机层依次用2×50mL水洗后，将有机层用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到417mg粗品3-羟基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-氨基丁酸(Ⅱ)；
b)合成3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸(III)：
将417mg粗品3-羟基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-氨基丁酸(Ⅱ)溶于20mL丙酮中，加入0.28mL 三氟乙酸酐，先在50℃下反应1h，再室温反应15h；反应结束后，减压浓缩至干，用2×1mL 乙醇提取浓缩物，再对提取物进行柱层析，得到58mg 3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯 -17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸(Ⅲ)；
c)合成雌酮抗原(IV)：
将58mg 3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸(Ⅲ)溶于2mL DMF 中，加入12.8mg NHS和22mg DCC，在30℃下反应12h后，离心取上清液，加入到10mL BSA 的PBS溶液(其中，BSA的浓度为5mg/mL，PBS的浓度为0.1mol/L，pH为7.4)中，在20℃下反应13h；然后用1mol/L的氢氧化钠溶液将反应液的pH调节至12.5，置于pH为12.5的氢氧化钠的PBS溶液(其中，PBS的浓度为0.1mol/L)中透析22h，再置于pH为7.4的PBS 溶液中透析70h，期间每20h更换PBS溶液一次；将透析后的反应液离心，取上清液，得到 12mL3.8mg/mL的雌酮抗原(IV)。
对比例1
一种雌酮抗原的制备方法，包括以下步骤：
将56mg雌酮(I)溶于2mL DMF中，加入12mg NHS和21mg DCC，在室温下反应15h后，离心取上清液，加入到10mL BSA的PBS溶液(其中，BSA的浓度为5mg/mL，PBS的浓度为0.1mol/L，pH为7.4)中，在15℃下反应15h；反应结束后，将反应液置于pH为7.4的 PBS溶液中透析72h，期间每24h更换PBS溶液一次；将透析后的反应液离心，取上清液，得到12mL1.8mg/mL的雌酮抗原。
对比例2
一种雌酮抗原的制备方法，包括以下步骤：
将56mg 3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸(Ⅲ，实施例1中制得)溶于2mL DMF中，加入11mg NHS和20mg DCC，在室温下反应15h后，离心取上清液，加入到10mL BSA的PBS溶液(其中，BSA的浓度为5mg/mL，PBS的浓度为0.1mol/L，pH 为7.4)中，在15℃下反应15h；然后用1mol/L的氢氧化钠溶液将反应液的pH调节至12，置于pH为12的氢氧化钠的PBS溶液(其中，PBS的浓度为0.1mol/L)中透析24h，再置于 pH为7.4的PBS溶液中透析72h，期间每24h更换PBS溶液一次；将透析后的反应液离心，取上清液，得到11.5mL 3.5mg/mL的雌酮抗原(IV)。
对比例3
一种雌酮抗原的制备方法，包括以下步骤：
将56mg 3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸(Ⅲ，实施例1中制得)溶于2mL DMF中，加入14mg NHS和22.2mg DCC，在室温下反应15h后，离心取上清液，加入到10mL BSA的PBS溶液(其中，BSA的浓度为5mg/mL，PBS的浓度为0.1mol/L， pH为7.4)中，在15℃下反应15h；然后用1mol/L的氢氧化钠溶液将反应液的pH调节至12，置于pH为12的氢氧化钠的PBS溶液(其中，PBS的浓度为0.1mol/L)中透析24h，再置于 pH为7.4的PBS溶液中透析72h，期间每24h更换PBS溶液一次；将透析后的反应液离心，取上清液，得到12mL 2.2mg/mL的雌酮抗原(IV)。
对比例4
一种雌酮抗原的制备方法，包括以下步骤：
将56mg 3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸(Ⅲ，实施例1中制得)溶于2mL DMF中，加入12mg NHS和21mg DCC，在室温下反应15h后，离心取上清液，加入到8mL BSA的PBS溶液(其中，BSA的浓度为5mg/mL，PBS的浓度为0.1mol/L，pH为7.4)中，在15℃下反应15h；然后用1mol/L的氢氧化钠溶液将反应液的pH调节至12，置于pH为12的氢氧化钠的PBS溶液(其中，PBS的浓度为0.1mol/L)中透析24h，再置于 pH为7.4的PBS溶液中透析72h，期间每24h更换PBS溶液一次；将透析后的反应液离心，取上清液，得到9mL 3.0mg/mL的雌酮抗原(IV)。
对比例5
一种雌酮抗原的制备方法，包括以下步骤：
将56mg 3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸(Ⅲ，实施例1中制得)溶于2mL DMF中，加入12mg NHS和21mg DCC，在室温下反应15h后，离心取上清液，加入到13mL BSA的PBS溶液(其中，BSA的浓度为5mg/mL，PBS的浓度为0.1mol/L，pH 为7.4)中，在15℃下反应15h；然后用1mol/L的氢氧化钠溶液将反应液的pH调节至12，置于pH为12的氢氧化钠的PBS溶液(其中，PBS的浓度为0.1mol/L)中透析24h，再置于 pH为7.4的PBS溶液中透析72h，期间每24h更换PBS溶液一次；将透析后的反应液离心，取上清液，得到14.5mL 3.6mg/mL的雌酮抗原(IV)。测试例
利用胶体金免疫层析法对实施例1-3和对比例1-5中制得的雌酮抗原进行检测，检测条件如下：用喷膜机以1.0μg/cm的喷量，将雌酮抗原以3.0mm的宽度喷在NC膜上，以雌酮抗体标记胶体金，结合玻璃纤维纸及吸水纸，组装成试纸条，对试纸条进行检测。检测结果如表1 和表2所示。
表1
Figure BDA0002797903910000091
表2
Figure BDA0002797903910000092
从表1可知：实施例1-3在参数范围内调整制备半抗原的制备参数，所得抗原的阴性检测T 线显色强度均达到G8.5，证明合成的雌酮抗原活性较高，能被抗体所识别并发生高效结合；阳性检测证明雌酮的PBS溶液对合成的雌酮抗原有竞争性抑制且有较高灵敏度和梯度。
对比例1与实施例1的区别在于，对比例1未对雌酮进行改性而直接与载体蛋白进行偶联，而实施例1则采用本发明的方法对雌酮进行改性后再将其与载体蛋白偶联。从表2可知：对比例1所得抗原的阴性检测T线不显色。说明雌酮本身不能直接与蛋白质偶联，需通过本发明的方法对雌酮进行改性后，能使其实现与载体蛋白的偶联，制得的雌酮抗原具有较强的特异性和较高的灵敏度。
对比例2与实施例1的区别在于，在步骤c)中，实施例1中步骤b)得到的产物、 NHS、DCC、载体蛋白BSA的质量比为1:0.214:0.375:0.893，对比例2中则为 1:0.196:0.357:0.893。从表1和表2可知：对比例2所得抗原的阴性检测T线显色强度只有 G6.0，明显低于实施例1。原因在于：NHS和DCC的用量占比过小，会造成半抗原中的羧基活化不完全，产品效价降低。
对比例3与实施例1的区别在于，在步骤c)中，实施例1中步骤b)得到的产物、NHS、DCC、载体蛋白BSA的质量比为1:0.214:0.375:0.893，对比例3中则为 1:0.250:0.396:0.893。从表1和表2可知：对比例3所得抗原的阴性检测T线显色强度只有 G7.5，明显低于实施例1，-50％阳性检测灵敏度也有所下降。另外，所得抗原的收率也降低。原因在于：NHS和DCC的用量占比过大，易造成载体蛋白之间相互偶联，导致沉淀过多，致使产品效价及产品收率降低。
对比例4与实施例1的区别在于，在步骤c)中，实施例1中步骤b)的产物与载体蛋白BSA的质量比为1:0.893，对比例4中则为1:0.714。从表1和表2可知：对比例4所得抗原的阴性检测T线显色强度可达到G9.0，阳性检测结果与实施例1相同。但相较于实施例1 而言，对比例4抗原的收率有所下降。原因在于：相对较少的载体蛋白可让更多的雌酮分子暴露在外，更易与抗体结合，从而提高效价，但同时会导致产品收率降低。
对比例5与实施例1的区别在于，在步骤c)中，实施例1中步骤b)的产物与载体蛋白BSA的质量比为1:0.893，对比例5中则为1:1.161。从表1和表2可知：对比例5所得抗原的阴性检测T线显色强度只有G7.0，明显低于实施例1。原因在于：载体蛋白的相对用量过大，会包裹过多的雌酮分子，影响抗原与抗体的结合，进而导致产品效价过低。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.一种雌酮抗原，其特征在于，其结构式为：
Figure FDA0003140806190000011
其中，R为载体蛋白；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白、鸡卵白蛋白、牛丙种球蛋白中的一种。
2.一种如权利要求1所述雌酮抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)以雌酮为原料，与4-氨基丁酸进行缩合反应并还原后，得到3-羟基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-氨基丁酸；
b)将步骤a)得到的产物用三氟乙酸酐保护羟基与仲胺基后，得到3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸；
c)将步骤b)得到的产物溶于偶联溶剂中，加入N-羟基丁二酰亚胺和二环己基碳二亚胺，进行羧基活化反应后，离心取上清液，加入到载体蛋白的PBS溶液中，进行偶联反应，再脱去保护基后，得到雌酮抗原；所述载体蛋白为牛血清白蛋白，所述步骤b)得到的产物、N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、载体蛋白的质量比为1:0.21-0.24:0.37-0.39:0.8-1。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤a)的具体过程如下：将雌酮和4-氨基丁酸溶于有机溶剂中，加入缩合反应催化剂，在60-80℃下反应10-24h；降至10-30℃后，加入硼氢化钠，在10-30℃下反应10-24h后，分离产物，得到3-羟基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-氨基丁酸。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中：
所述雌酮与4-氨基丁酸的质量比为1.8-2.8:1；和/或
所述缩合反应催化剂为对甲基苯磺酸，所述缩合反应催化剂与雌酮的质量比为1:25-35；和/或
所述硼氢化钠与雌酮的质量比为1:5-6，所述硼氢化钠分批次加入。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤b)的具体过程如下：将步骤a)得到的产物溶于反应溶剂中，加入三氟乙酸酐后，在10-60℃下反应，分离产物，得到3-三氟乙酰氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-(N-三氟乙酰基)氨基丁酸。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中：
所述在10-60℃下反应的具体过程如下：先在50℃下反应1h，再室温反应15h；和/或
所述步骤a)得到的产物与三氟乙酸酐的质量体积比为1-1.5g:1mL。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤c)中，所述羧基活化反应的温度为15-30℃，时间为12-18h；所述偶联反应的温度为4-20℃，时间为13-18h。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤c)中，脱去保护基的具体过程如下：
将偶联反应后获得的反应液pH调节至11.5-12.5后，置于pH为11.5-12.5的氢氧化钠的PBS溶液中透析20-24h，再置于pH为7.4的PBS溶液中透析70-72h，期间每20-24h更换PBS溶液一次。
CN202011338549.3A 2020-11-25 2020-11-25 一种雌酮抗原及其制备方法 Active CN112625119B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011338549.3A CN112625119B (zh) 2020-11-25 2020-11-25 一种雌酮抗原及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011338549.3A CN112625119B (zh) 2020-11-25 2020-11-25 一种雌酮抗原及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112625119A CN112625119A (zh) 2021-04-09
CN112625119B true CN112625119B (zh) 2021-10-22

Family

ID=75303888

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011338549.3A Active CN112625119B (zh) 2020-11-25 2020-11-25 一种雌酮抗原及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112625119B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114456224B (zh) * 2022-04-12 2022-08-12 北京纳百生物科技有限公司 硫酸雌酮半抗原的合成及应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS56133300A (en) * 1980-03-21 1981-10-19 Eiken Kagaku Kk Novel steroid compound, its preparation, and antigen for preparing antibody for measuring estrone sulfate by immunochemical measurement comprising it
CN103145831A (zh) * 2013-03-28 2013-06-12 江南大学 一种特异性沙丁胺醇人工抗原的合成方法
CN109180768B (zh) * 2018-09-06 2020-04-17 苏州博源医疗科技有限公司 雌酮衍生物、免疫原、抗体、酶标偶联物、检测试剂及其制备方法
CN110981949B (zh) * 2019-11-26 2020-11-06 杭州隆基生物技术有限公司 一种氯胺酮抗原的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112625119A (zh) 2021-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2155658C3 (de) Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von einem Hapten oder dessen Antikörper
CA1217478A (en) Aminomethylfluorescein derivatives
US4495281A (en) Tricyclic antidepressant drug immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US20070254323A1 (en) Malachite green derivatives for immunoassay reagents to detect malachite green
CN112285037A (zh) 6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途
EP0201751A2 (en) 4'-aminomethyfluorescein derivatives for use in fluorescence polarization immunoassys
CN103588661A (zh) 尼卡巴嗪半抗原和人工抗原的制备
CN112625119B (zh) 一种雌酮抗原及其制备方法
Goldzieher et al. A clinical method for the determination of urinary pregnanediol and pregnanetriol
US4064227A (en) Radioimmunoassay method for the determination of cardiotonic glycosides
DE4439345A1 (de) Oligomere Trägermoleküle mit definiert eingebauten Markierungsgruppen und Haptenen
EP0285995B1 (en) Diagnostic immunoassay by solid phase separation for digoxin
EP0747699A1 (de) Entstörungsreagenz für die Bestimmung eines Analyten mit einem lumineszenzfähigen Metallkomplex
SATO et al. Evidence of a small molecule in mouse Leydig cell tumors which inhibits the conversion of estrogen receptor from 4S to 5S
CA1249811A (en) Rigid coupling compounds
CN101776691A (zh) 一种基于金包裹四氧化三铁纳米颗粒的免疫亲和固相萃取方法
CN109438424B (zh) 利巴韦林半抗原和人工抗原及其制备方法与应用
Watson et al. Penicillin as an antigen
US4952569A (en) Estriol derivatives
CN110526964B (zh) 女性黄体功能快速无创监测技术
Bauminger et al. Antiserum to 5α-dihydrotestosterone: production, characterization and use in radioimmunoassay
EP0178683B1 (en) Imunoassay for estriol-3-sulfate
CN109884318B (zh) 一种均相酶免疫偶联物及其制备方法和应用
CA1038372A (en) Reagents for the assay of cardiac glycosides and method of using them
Francis et al. The mechanism of the reaction between di-(2-chloroethyl) sulphone (mustard-gas sulphone) and amino acids

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant