CN103588661A

CN103588661A - 尼卡巴嗪半抗原和人工抗原的制备

Info

Publication number: CN103588661A
Application number: CN201210292698.XA
Authority: CN
Inventors: 吴小平; 徐飞; 王照鹏; 何丹婷; 王世恩; 王亚辉; 杨光
Original assignee: BEIJING WDWK BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING WDWK BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-08-17
Filing date: 2012-08-17
Publication date: 2014-02-19

Abstract

本发明公开了一种尼卡巴嗪的人工抗原制备方法，属于生物化工技术领域。本发明以4-硝基苯胺、草酰氯为主要原料，合成一种尼卡巴嗪半抗原；用碳二亚胺法将其与载体蛋白人血清白蛋白（HSA）偶联制备偶联物，用紫外分光光度法测定偶联物的偶联比。试验结果表明我们制得偶联物产生了针对尼卡巴嗪很好的抗体，即是尼卡巴嗪人工抗原。本发明成功合成了尼卡巴嗪人工抗原，步骤简洁合理，效果理想。本发明所制备的尼卡巴嗪人工抗原适合用于尼卡巴嗪残留的酶联免疫分析。

Description

尼卡巴嗪半抗原和人工抗原的制备

技术领域

本发明涉及一种尼卡巴嗪半抗原和人工抗原的制备方法，属于生物化工领域。

背景技术

尼卡巴嗪（Nicarbazin）又名硝脲嘧啶、球虫净。1955年由美国默克(Merck)公司研制合成。尼卡巴嗪为4,4'-二硝基苯脲(DNC)和2-羟基-4,6-二甲基嘧啶(HDP)以1:1的比例组成的复合物。分子式为C13H10N4O5•C6H8N20；相对分子质量426.38。尼卡巴嗪为淡黄色结晶粉末，无臭。熔点265-275℃（分解）。不吸湿，不溶于水、乙醇、氯仿和乙醚，微溶于二甲基甲酰胺。与水研磨时会慢慢分解，在稀酸中分解较快。尼卡巴嗪主要用以预防鸡盲肠球虫(柔嫩艾美耳球虫)和堆型、巨型、毒害、布氏艾美耳球虫。由于尼卡巴嗪中的HDP成分在动物体内迅速通过尿液排出体外，而抗球虫活性分成-DNC较缓慢的通过粪便排泄，因此目前国内外均规定尼卡巴嗪在鸡组织中的残留标示物为DNC。1999年食品法典委员会（Codex Aliment Commission, CAC）确定尼卡巴嗪在鸡组织中的最大残留限量（MRL）为0.2 mg/kg，日许量(ADI)为0-400 μg/kg·bw。2002年，FAO/WHO公布禁止在进口动物源性食品中使用尼卡巴嗪，日本相继公布了进口禽肉中尼卡巴嗪的最大残留限量为0.2 mg/kg。我国农业部2002发布的235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》规定了尼卡巴嗪在鸡组织中的MRL为0.2 mg/kg。美国现行标准（鸡组织中）规定为4 ppm。

国内外以前多采用紫外分光法测定饲料和禽肉中尼卡巴嗪的含量。目前国内外大多采用高效液相色谱法测定，这些方法特异性强、灵敏度高、但是样品前处理操作步骤繁琐，成本较高，也不适用于大批量样品的筛选检测。免疫化学分析由于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足。免疫化学分析由于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足，尼卡巴嗪人工抗原的制备为这一方法的实施奠定了重要基础。

影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成就是产生特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础和最关键的步骤。

发明内容

本发明的目的是提供一种尼卡巴嗪人工抗原及其制备方法与应用。

本发明所提供的尼卡巴嗪人工抗原，是将尼卡巴嗪半抗原与载体蛋白偶联获得的抗原。

尼卡巴嗪半抗原是一种化合物，其结构为式Ⅰ所示。

尼卡巴嗪半抗原也是属于本发明的保护范围。

其中，所述的化合物与所述载体蛋白以酰胺键偶联，结构式见式Ⅱ。所述载体蛋白为人血清白蛋白或卵清蛋白。

本发明还保护式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：4-硝基苯胺溶于四氢呋喃

中；加入草酰氯， 2,6-二甲基吡啶催化反应，获得所述化合物。

本发明还保护一种尼卡巴嗪人工抗原，为将式（Ⅰ）所示化合物与载体蛋白偶联得到的偶联物。式（Ⅰ）所示化合物与所述载体蛋白可以以酰胺键偶联。尼卡巴嗪的人工抗原在尼卡巴嗪与载体蛋白间含有一个间隔臂。所述尼卡巴嗪人工抗原可以作为免疫原也可以作为包被原。

附图说明

图1尼卡巴嗪半抗原结构式Ⅰ；

图2尼卡巴嗪人工抗原结构式Ⅱ；

图3 4-硝基苯胺结构式Ⅲ；

图4四氢呋喃结构式Ⅳ；

图5尼卡巴嗪人工抗原的紫外光谱图（其中HSA为人血清白蛋白）。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。人血清白蛋白简称HSA。卵清蛋白简称OVA。

4-硝基苯胺如（式Ⅲ）所示，分子量为138.12，购自国药集团化学试剂北京有限公司。

四氢呋喃如（式Ⅳ）所示，分子量为100.08，购自国药集团化学试剂北京有限公司。

实施例1、制备尼卡巴嗪半抗原

1. 尼卡巴嗪半抗原的制备

1) 4-硝基苯胺（0.1g, 0.724 mmol）溶于5ml四氢呋喃中；加入（0.18 g, 1.448 mmol）

草酰氯，20 mL 2,6-二甲基吡啶催化反应， 60度反应3 h。

2) 反应完后，立即冷却到25度，加20ml水淬灭反应。加入100 ml乙酸乙酯萃取，分

出有机相，再用100 ml乙酸乙酯萃取一次，合并有机相，干燥浓缩，TLC分离纯化，展开剂氯仿/乙酸乙酯/甲醇/甲酸86:10:4:1。DMF洗脱，氮气吹干，减压干燥，得到尼卡巴嗪半抗原。

2. 尼卡巴嗪半抗原的鉴定

对产物进行元素分析，结果（%，计算值）如下：C, 45.72; H, 2.88; N,13.33; O,

38.07。

尼卡巴嗪半抗原的结构式如式Ⅰ所示

实施例2、制备尼卡巴嗪人工抗原

1）尼卡巴嗪人工抗原的制备

8 mg尼卡巴嗪半抗原溶于1 ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，N,N’-二环己基碳化二亚

胺（DCC）16.2 mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）8 mg加入到上述尼卡巴嗪半抗原溶液中，室温搅拌反应4 h；HSA30 mg溶于5 ml 碳酸钠缓冲液（0.1 mol/L pH10）中，搅拌状态下将活化药物逐滴加入到蛋白溶液中，室温条件下反应2 h，之后4℃反应过夜。然后将反应液装入透析袋，在4度用生理盐水溶液透析48小时，换水6次。将透析液在无菌条件下通过0.2 μm的滤膜，分装于安培瓶中，-20度保存。

2）尼卡巴嗪人工抗原的鉴定

尼卡巴嗪人工抗原用PBS配成溶液进行紫外（200-400 nm）光谱扫描，以HSA作为对照，紫外（200-400 nm）光谱扫描结果见图5。

Claims

1.尼卡巴嗪半抗原的制备

1）4-硝基苯胺（0.1g, 0.724 mmol）溶于5ml四氢呋喃中；加入（0.18 g，1.448 mmol）草酰氯，20 uL 2,6-二甲基吡啶催化反应，60度反应3 h；

2）反应完后，立即冷却到25度，加20ml水淬灭反应；加入100 ml乙酸乙酯萃取，分出有机相，再用100 ml乙酸乙酯萃取一次，合并有机相，干燥浓缩，TLC分离纯化，展开剂氯仿/乙酸乙酯/甲醇/甲酸86:10:4:1；DMF洗脱，氮气吹干，减压干燥，得到尼卡巴嗪半抗原。

2.尼卡巴嗪半抗原的鉴定

对产物进行元素分析，结果（%，计算值）如下：C, 45.72; H, 2.88; N,13.33; O, 38.07。

3.尼卡巴嗪人工抗原的制备

8 mg尼卡巴嗪半抗原溶于1 ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，N,N’-二环

己基碳化二亚胺（DCC）16.2 mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）8 mg加入到上述尼卡巴嗪半抗原溶液中，室温搅拌反应4 h；HSA30 mg溶于5 ml 碳酸钠缓冲液（0.1 mol/L pH10）中，搅拌状态下将活化药物逐滴加入到蛋白溶液中，室温条件下反应2 h，之后4℃反应过夜；然后将反应液装入透析袋，在4度用生理盐水溶液透析48小时，换水6次；将透析液在无菌条件下通过0.2 μm的滤膜，分装于安培瓶中，-20度保存。

4.尼卡巴嗪人工抗原的鉴定

尼卡巴嗪人工抗原用PBS配成溶液进行紫外（200-400 nm）光谱扫描，以HSA作为对照。