CN101762706B - 一种检测对人体有害的小分子物质残留的方法及其专用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测对人体有害的小分子物质残留的方法及其专用试剂盒。该免疫试剂盒，包括同一孔中同时包被三种小分子物质包被原的不透明微孔板和发光复合物。本发明充分利用了QDs的多色标记功能，建立简捷、迅速的新型多残留检测试剂盒及方法，将具有不同粒径的QDs，通过其表面特定的官能团(如氨基)与靶标偶联，进而间接标记兽药的多抗或单抗，实现多色标记。通过分离纯化获得不同荧光特性的量子点-抗体多色标记物，并以此为荧光探针，根据其荧光强度的变化建立同步分析不同类多种抗原成分反应体系，实现动物性食品中兽药等多残留的同步检测。且此方法更具有操作简单，荧光强度高，稳定时间长的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测对人体有害的小分子物质残留的方法及其专用试剂盒。
背景技术
近年来食品质量安全的恶性事件频发，严重威胁人民的健康和生命安全，食品安全问题已成为全社会关注的焦点。对兽药、农药、食品添加剂、激素等残留和危害物质进行有效监控是保障动物源食品安全、维护社会稳定的关键。
目前检测上述残留物或危害物质的普遍方法为酶联免疫吸附测定法(ELISA)。其高灵敏度和特异性，使残留分析操作大大简化。由于免疫分析成本低、快速、可靠，且传感器灵敏度高因而广泛用于残留分析和监测。但ELISA技术亦有其自身的缺陷，由于抗原抗体的特异性结合，只可以对一种药物进行检测，即使制备广谱性抗体也只能实现对同一类药物的多残留检测，与真正意义上的多种药物残留检测相距甚远。
半导体量子点纳米晶(semiconductor nanocrystal)，简称量子点(quantumdots，QDs)，是由一定数量的实际原子组成的聚集体，尺寸小于10nm的半导体化合物，是一类理想的荧光指示剂。QDs具有荧光量子产率高、抗光漂白能力强、激发光谱分布连续、荧光发射光谱窄、峰形对称、荧光发射波长随尺寸变化可调等一系列独特的光学性质。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种可同时检测三种对人体有害的小分子物质的免疫试剂盒。
本发明所提供的免疫试剂盒，包括不透明微孔板和发光复合物，所述不透明微孔板中至少有一个孔包被有三种小分子物质包被原；
不透明微孔板可为白色不透明微孔板或黑色不透明微孔板；具体可为96孔的微孔板；
所述三种小分子物质包被原选自如下任意一种且不相同：小分子物质I的半抗原与载体蛋白的偶联物、小分子物质II的半抗原与载体蛋白的偶联物和小分子物质III的半抗原与载体蛋白的偶联物；所述小分子物质I、小分子物质II和小分子物质III不相同；
所述发光复合物为如下1)、2)和3)所示：
1)抗小分子物质I的抗体、抗抗体和量子点I形成的结合物，记作结合物I；其中，量子点I与抗抗体形成复合物，复合物再通过抗抗体与抗小分子物质I的抗体的相互作用而与抗小分子物质I的抗体相结合形成结合物I；
2)抗小分子物质II的抗体、生物素、亲和素与量子点II形成的结合物，记作结合物II；其中，抗小分子物质II的抗体与生物素形成复合物I，亲和素与量子点II形成复合物II，复合物I与复合物II通过生物素与亲和素的相互作用而结合形成结合物II；
3)抗小分子物质III的抗体、金黄色葡萄球菌A蛋白与量子点III形成的结合物，记作结合物III；其中，金黄色葡萄球菌A蛋白与量子点III形成复合物III，复合物III再通过金黄色葡萄球菌A蛋白与抗小分子物质III的抗体的相互作用而与抗小分子物质III的抗体相结合形成结合物III；
所述量子点I、量子点II和量子点III在相同的激发波长下具有不同的特征发射波长；量子点I、量子点II和量子点III的发射波长相差30nm～70nm。
选择具有不同发射波长的量子点，是为了区别各量子点所标记的物质。
所述偶联物是通过戊二醛法或混合酸酐法或重氮化法制备得到的。
在上述试剂盒的具体应用中，实际上是发光复合物对应了三种检测体系，即：
(a)生物素-亲和素体系：“生物素化一抗”与“亲和素-量子点”的结合物；
(b)金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)体系：一抗与“SPA-量子点”的结合物；
(c)二抗体系：一抗与“量子点-二抗”的结合物。
上述免疫试剂盒中，所述小分子物质I、小分子物质II和小分子物质III为对人体或动物体有危害的小分子物质。
上述免疫试剂盒中，还可包括标准品溶液、洗涤液和样品稀释液；
所述标准品溶液为所述小分子物质的标准品溶液；
所述样品稀释液为0.03mol/L～0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，pH 7.2。
上述免疫试剂盒中，所述对人体或动物体有危害的小分子物质为磺胺药物、喹诺酮药物、阿维菌素类药物、聚醚类药物、氯霉素类药物、四环素类药物、大环内酯类药物、氨基糖苷类药物、青霉素类药物、链霉素药物、苏丹红、孔雀石绿或三聚氰胺。
上述免疫试剂盒中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。
上述免疫试剂盒中，所述聚醚类药物为盐霉素；所述磺胺药物为磺胺喹噁啉；所述阿维菌素类药物为阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素或爱普菌素；
所述小分子物质I、小分子物质II和小分子物质III选自如下a)、b)和c)中的任意一种且不相同：a)盐霉素，b)磺胺喹噁啉，c)阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素或爱普菌素；
所述抗小分子物质I的抗体、抗小分子物质II的抗体和抗小分子物质III的抗体选自如下任意一种且不相同：由保藏编号为CGMCC No.1609的单克隆杂交瘤细胞株A-2-3分泌得到的单克隆抗体、由保藏编号为CGMCC No.1606的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4分泌得到的单克隆抗体和由保藏编号为CGMCC No.1615的单克隆杂交瘤细胞株A-4-1分泌得到的单克隆抗体；
所述抗盐霉素的抗体为由保藏编号为CGMCC No.1609的单克隆杂交瘤细胞株A-2-3分泌得到的；
所述抗阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素或爱普菌素的抗体为由保藏编号为CGMCCNo.1606的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4分泌得到的；
所述抗磺胺喹噁啉的抗体为由保藏编号为CGMCC No.1615的单克隆杂交瘤细胞株A-4-1分泌得到的；
所述标准品溶液为如下1)、2)和3)所示：
1)如下各浓度的阿维菌素标准品溶液：0、0.2、1、5、25、125μg/L；
2)如下各浓度的盐霉素标准品溶液：0、0.2、1、5、25、125μg/L；
3)如下各浓度的磺胺喹噁啉标准品溶液：0、0.2、1、5、25、125μg/L。
所述标准品溶液是用样品稀释液稀释各标准品得到的，所述浓度为0μg/L的各标准品溶液为样品稀释液。
上述免疫试剂盒中，所述抗抗体为羊抗鼠抗体。
上述免疫试剂盒中，所述量子点为具有如下发射波长的量子点：525nm、585nm、655nm，激发波长范围为360nm~440nm。量子点的特征是激发带宽发射带窄，在360nm~440nm范围内均可作为激发波长，激发波长优选为400-420nm。
生物素和亲和素为现有技术中常用的能相互结合的生物素和亲和素即可。但是本发明中的N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHSB)更易标记抗体，且和亲和素具有更好的结合效果。
上述免疫试剂盒中，所述不透明微孔板中，所述三种小分子物质包被原的量分别为(48-50)ng/孔、(38-42)ng/孔、(28-32)ng/孔。相同孔中三种小分子物质包被原的量具体可分别为48ng/孔、40ng/孔、30ng/孔。
本发明的另一个目的是提供一种检测样品中对人体或动物体有害的小分子物质残留的方法。
本发明所提供的检测样品中对人体或动物体有害的小分子物质残留的方法，是用上述任一所述免疫试剂盒对待测样品进行检测。
上述方法中，所述方法包括如下步骤：
1)制作上述任一所述免疫试剂盒中的每种小分子物质对应的标准曲线，所述标准曲线的横坐标为所述小分子物质标准品溶液的浓度值、所述小分子物质标准品溶液的浓度值的对数值或所述小分子物质标准品溶液的浓度值的半对数值，所述标准曲线的纵坐标为各小分子物质包被原与孔内发光复合物形成的复合物的相对荧光强度；
2)向上述任一所述免疫试剂盒中的不透明微孔板的孔中加入待测样品的溶液，再加入所述免疫试剂盒中的三种发光复合物，孵育；检测孔中各种所述小分子物质包被原与发光复合物形成的复合物的相对荧光强度；
3)将步骤2)中得到的小分子物质包被原与发光复合物形成的复合物的相对荧光强度与步骤1)中的小分子物质的标准曲线中的相对荧光强度进行比较，得出所测样品中小分子物质的浓度值；
所述检测孔中各种所述小分子物质包被原与发光复合物形成的复合物的相对荧光强度是指用荧光酶标仪特定波长下激发，得到包被抗原与发光复合物形成的复合物的相对荧光强度，通过标准曲线的对比求出待测样品中小分子物质的浓度。通常样品中待测抗原(即下分子物质)浓度越大，包被原结合的发光复合物越少，所测得的相对荧光强度越低。
相对荧光强度定义：荧光的相对强弱，以不同峰、谷的荧光强度之差来表示，是一个对应的值。
所述方法中，在步骤2)前，包括对待测样品进行前处理的步骤。
所述待测样品为食品、血清或饲料。
所述食品为蜂蜜、牛奶、奶粉、禽畜肉、禽畜肝脏或水产。
食品均为新鲜未变质的，通过正常商业渠道均可获得。
对牛奶进行前处理的方法包括如下步骤：将牛奶进行脱脂，用PBS溶液将脱脂后的牛奶稀释，得到的稀释液即为待测样品溶液。
本发明为多组分同步分析，具体是采用多种竞争抗原包被，多种抗体发光复合物竞争，采用同一波长激发，可以测得不同发射波长的荧光强度，从而实现同一样品种不同组分的定量分析。
本发明利用量子点的多色标记功能，以量子点纳米晶作为荧光标记物，将不同直径的量子点分别标记不同物质的抗体，将三种标记的抗体同时用于检测，以量子点为荧光探针，根据其荧光强度的变化得到小分子物质的浓度，即可同时检测出三种小分子物质的含量。本发明方法实现了三种小分子物质的同步检测，大大提高了检测效率。量子点具有激发谱宽、发射谱窄、荧光性强、颜色的可调性等优势。量子点与传统荧光染料相比，荧光光谱对称，荧光强度高，较ELISA相比，荧光稳定性强，检测重复性好。本发明方法的检测灵敏度远远高于普通的ELISA方法，检测灵敏度可提高1～2个数量级，荧光强度高，稳定时间长，减少加入酶标二抗和底物显色的步骤，整个反应只需1步即可完成，大大缩短检测时间和技术难度，减少操作误差。另外，本发明方法样品前处理过程简单，操作简单，实现同步检测，能够快速大量的检测样品，适合于现场监测或大批量样品的初筛。
附图说明
图1为量子点标记的竞争型反应过程模式图。
图2为三种不同颜色量子点发射图谱(激发波长400nm)。
图3为阿维菌素、盐霉素和磺胺喹噁啉标准品的标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
SPA购自上海翔升生物有限公司，产品目录号为EK11230；N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHSB)购自上海锐聪科技发展有限公司，产品目录号为RC2006；链亲和素购于上海锐聪科技发展有限公司，产品目录号为RC00433A。
实施例1、试剂盒的组成及制备
1、同一孔中同时包被阿维菌素包被原、盐霉素包被原和磺胺喹噁啉包被原的酶标板；
阿维菌素包被原为阿维菌素半抗原与卵血清白蛋白的偶联物。
盐霉素包被原为盐霉素半抗原与卵清蛋白的偶联物。
磺胺喹噁啉包被原为磺胺喹噁啉半抗原与人血清白蛋白(HSA)的偶联物。
2、发光复合物：
1)盐霉素单克隆抗体与“量子点与羊抗鼠抗体复合物”形成的结合物；量子点的特征发射波长585nm；
2)“阿维菌素单克隆抗体与生物素的复合物”与“亲和素与量子点的复合物”形成的结合物；生物素为N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHSB)，亲和素为链亲和素；量子点的特征发射波长525nm；
3)磺胺喹噁啉单克隆抗体与“SPA与量子点的复合物”形成的结合物；量子点的特征发射波长655nm。
阿维菌素单克隆抗体：由保藏编号为CGMCC No.1606的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4分泌得到的(ZL 200610007260.7)；
盐霉素单克隆抗体：由保藏编号为CGMCC No.1609的单克隆杂交瘤细胞株A-2-3分泌得到的(ZL 200610007285.7)；
磺胺喹噁啉单克隆抗体：由保藏编号为CGMCC No.1615的单克隆杂交瘤细胞株A-4-1分泌得到的(ZL 200610007256.0)。
3、标准品溶液
1)如下不同浓度的阿维菌素标准品溶液：0、0.2、1、5、25、125μg/L；阿维菌素标准品为阿维菌素；该标准品购自sigma公司，产品目录号为31732；用样品稀释液将该标准品稀释成如上浓度的溶液；0μg/L的标准品溶液为样品稀释液。
2)如下不同浓度的盐霉素标准品溶液：0、0.2、1、5、25、125μg/L；盐霉素标准品为盐霉素；该标准品购自sigma公司，产品目录号为84350；用样品稀释液将该标准品稀释成如上浓度的溶液；0μg/L的标准品溶液为样品稀释液。
3)如下不同浓度的磺胺喹噁啉标准品溶液：0、0.2、1、5、25、125μg/L；磺胺喹噁啉标准品为磺胺喹噁啉；该标准品购自sigma公司，产品目录号为86024；用样品稀释液将该标准品稀释成如上浓度的溶液；0μg/L的标准品溶液为样品稀释液。
4、洗涤液：由吐温20、叠氮化钠和磷酸盐缓冲液组成；洗涤液中磷酸盐的终浓度为0.01M，吐温20在洗涤液中的终浓度为1.0％(v/v)，叠氮化钠在洗涤液中的终浓度为0.5mg/L；洗涤液pH值为7.4；
5、样品稀释液：0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7.2。是将浓缩液稀释20倍得到，浓缩液为0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。
二、试剂盒的制备
(一)包被原及包被有包被原的酶标板的制备
1、包被原的制备
1.1、阿维菌素包被原的制备及验证：
t-BuMe2SiCl(tert-butyldimethylchlorosi lane)购自sigma公司，产品目录号为19905；
阿维菌素半抗原是在阿维菌素的C4″位置上连接琥珀酸酐得到的4″-羟-琥珀酸酐阿维菌素(4″-o-succinoyl AVM)即为阿维菌素半抗原。阿维菌素半抗原的合成分三步：
(1)5-o-t-BuMe2Si-AVM-4″-0H的合成：将1.0g阿维菌素置于25mL三口鸡心瓶中，6mL N，N-二甲基酰胺(DMF)溶解，加0.47g咪唑，混合。机械搅拌下，将2mL DMF稀释的0.52g t-BuMe2SiCl(tert-butyldimethylchlorosilane)逐滴加入，30℃反应2h。向反应液中加入100mL乙酸乙酯(EtoAc)混合。混合液用50mL水洗涤3次。分离EtoAc层，MgSO4干燥，减压浓缩得到微黄色粘稠物。将该微黄色粘稠物用CH2Cl2溶解，硅胶柱层析分离产物，干燥后得到5-o-t-BuMe2Si-AVM-4″-OH。
(2)5-o-t-BuM2Si-AVM-4″-o-succinoyl的合成：取0.50g 5-o-t-BuM2Si-R-4″-OH置于50mL三口鸡心瓶中，加12mLCH2Cl2使其溶解，依次加入0.28g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)、0.45g三乙胺和0.92g琥珀酸酐，水浴中回流2.5小时，溶液由无色变为棕色、黑色(与反应原料无关)。减压蒸干CH2Cl2后，加入100mL乙醚，过滤除去不溶物后转至250mL分液漏斗中，乙醚层用100mL 3.6％(质量百分含量)HCl洗涤2次，再用100mL水洗涤2次。MgSO4干燥，浓缩，得淡黄色粘稠物，用CH2Cl2溶解后，用薄层色谱(TLC)对产物进行分离(展开剂各成分体积比为CH2Cl2∶四氢呋喃(THF)∶CH3OH＝95∶5∶5)。TLC出现三条区带，将中间最大的区带刮下，用CH2Cl2和CH3OH(体积比为1∶1)淋洗，减压浓缩，真空干燥24h(避光)得到5-o-t-BuM2Si-AVM-″-o-succinoyl。
(3)将步骤2)得到的产物脱去保护基5-o-t-BuM2Si，得到4″-o-succinoyl-AVM，即为阿维菌素半抗原。
包被原的制备：本试验采用N-羟基琥珀酰亚胺酯法(NHS)将阿维菌素半抗原与载体蛋白卵清蛋白(OVA)偶联，得到OVA-AVM偶联物即为包被原。
包被原合成的具体步骤如下：
1)取12mg阿维菌素半抗原置于5mL圆底烧瓶中，加0.4mL二甲基甲酰胺(DMF)使阿维菌素半抗原溶解，再加入2.7mg N-羟基琥珀酰亚胺酯和4.7mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)，混合后，室温(18-20℃)避光搅拌10小时。
2)搅拌下，在1h内将步骤1)得到的反应液逐滴加到6mL含30mg OVA和0.6ml DMF的硼酸盐缓冲液(0.2M，pH 9.4)。溶液开始略显混浊，最后有少量沉淀出现，继续搅拌1小时，再转至4℃下搅拌10-12小时，立即进行下述透析纯化。
3)将步骤2)得到的反应液转入透析袋(截止分子量10,000Da)4℃搅拌下，透析2d，其间换PBS三次。将透析物1000rpm离心5min，除去沉淀，得到的上清液即为包被原OVA-AVM偶联物。
通过紫外分光光度法测定特定吸收值，再根据朗伯-比尔定律计算反应产物的偶联比，结果表明：卵清蛋白和阿维菌素半抗原的偶联比率为卵清蛋白：阿维菌素半抗原＝1∶11，偶联物的浓度为3.8mg/mL。
1.2、盐霉素包被原的制备
半抗原的合成：将盐霉素和对氨基苯甲酸通过缩合反应合成盐霉素半抗原。具体步骤为：将盐霉素和对氨基苯甲酸按1∶1比例混合搅拌反应，室温下反应过夜，得到盐霉素半抗原。
包被原的合成：采用混合酸酐法将盐霉素半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原。
包被原的具体制备方法如下：
(1)取盐霉素半抗原2g溶于30ml，50％的N，N’-二甲基甲酰胺溶液中；
(2)取0.5ml氯甲酸异丁酯溶于5ml无水二噁烷中，加到步骤1)得到的半抗原溶液中，室温搅拌反应4小时；
(3)取卵清蛋白22g溶于70ml pH9.6碳酸盐缓冲液中；
(4)将步骤(3)得到的卵清蛋白滴加到步骤(2)得到的半抗原溶液中，4℃搅拌过夜；
(5)将步骤(4)得到的产物用0.2M的磷酸盐缓冲液透析7天，每天换液3～4次，即得到盐霉素包被原。
通过紫外分光光度法测定特定吸收值，再根据朗伯-比尔定律计算反应产物的偶联比，结果表明：卵清蛋白(OVA)和盐霉素半抗原的偶联比率为卵清蛋白∶盐霉素半抗原＝1∶9，偶联物的浓度为4.5mg/mL。
1.3、磺胺喹噁啉包被原的制备
(1)磺胺喹噁啉半抗原的合成方法：将磺胺喹噁啉和对羧基苯甲醛通过缩合反应合成磺胺喹噁啉半抗原，给磺胺喹噁啉接出了一个含苯环的间隔臂，这样突出了磺胺喹噁啉分子结构中的特征基团——喹噁啉。同时也增加了半抗原的抗原性。
其半抗原的制备的过程为：取1g磺胺喹噁啉加入无水乙醇溶解，为溶液I；另取对羧基苯甲醛1g溶于无水乙醇中，为溶液II；将溶液I和溶液II混合，室温条件下磁力搅拌反应2小时，经硅胶柱层析分离得到磺胺喹噁啉半抗原。
(2)包被原：将磺胺喹噁啉半抗原和人血清白蛋白(HSA)水溶性碳化二亚胺法进行偶联得到。
包被原的具体制备方法如下：取磺胺喹噁啉半抗原300mg和人血清白蛋白(HSA)500mg混合溶于50ml水，加入EDC 100μl室温搅拌过夜，得到磺胺喹噁啉包被原。
通过紫外分光光度法测定特定吸收值，再根据朗伯-比尔定律计算反应产物的偶联比，结果表明：人血清白蛋白(HSA)和磺胺喹噁啉半抗原的偶联比率为人血清白蛋白∶磺胺喹噁啉半抗原＝1∶13，偶联物的浓度为4.2mg/mL。
2、包被阿维菌素包被原、盐霉素包被原和磺胺喹噁啉包被原的酶标板的制备
用包被缓冲液稀释阿维菌素包被原，得到阿维菌素包被原溶液，其中阿维菌素包被原的浓度为0.76μg/mL。
用包被缓冲液稀释盐霉素包被原，得到盐霉素包被原溶液，其中盐霉素包被原的浓度为1.2μg/mL。
用包被缓冲液稀释磺胺喹噁啉包被原，得到磺胺喹噁啉包被原溶液，其中磺胺喹噁啉包被原的浓度为1.0μg/mL。
在白色不透明96孔酶标板的同一孔中加入阿维菌素包被原溶液40μl、盐霉素包被原溶液40μl和磺胺喹噁啉包被原溶液40μL，同一孔中盐霉素包被原、阿维菌素包被原和磺胺喹噁啉包被原的物质的量比为1∶1∶1；在pH值9.6、37℃条件下包被2小时；取出，甩干孔内包被液，加入洗涤液260μL/孔，室温反应3~4分钟，倒出孔内液体，拍干；加入封闭液，180μL/孔，37℃封闭2小时，倒出孔内液体，拍干。用铝膜真空密封保存。
包被缓冲液组成：碳酸钠1.59g；碳酸氢钠2.9g；去离子水1000mL。
洗涤液组成：氯化钠320g；磷酸氢二钾10g；氯化钾0.18g；十二水合磷酸二氢钠116g；吐温-20100mL；Proclin300 1.5mL；去离子水4900mL；
封闭液组成：蔗糖50g；十二水合磷酸二氢钠5.8g；小牛血清50mL；Proclin300300μL；去离子水950mL；
(二)发光复合物的制备
1、盐霉素单克隆抗体与“量子点与羊抗鼠抗体复合物”的结合物；
量子点的表征：1、量子点的组成：核为CdSe，壳为ZnS；2、量子点的直径10~15nm；3、量子点的发光情况：橙色荧光；4、在酶标仪检测的波长(即激发波长400nm)下，量子点的特征发射波长585nm。
上述量子点为表面氨基修饰的量子点，购自invitrogen公司，产品目录号Cat.No.Q21511MP；
量子点与羊抗鼠抗体的复合物的制备：
(1)活化量子点：表面氨基(-NH2)修饰的水溶性QDs 2ml经20μl偶联剂SMCC(琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷)活化，形成活性表面，得到活化的量子点。凝胶柱去除过量的SMCC。
(2)还原羊抗鼠抗体：羊抗鼠抗体2ml中加入还原剂DTT 25μl(dithiothreitol，二硫苏糖醇)，断开二硫键形成的巯基。凝胶柱去除DTT。
(3)将活化的量子点和还原的羊抗鼠抗体混合，37℃反应1小时，10μl beta-巯基乙醇终止反应，形成量子点标记的羊抗鼠抗体。最终的反应溶液经凝胶柱分离纯化，收集量子点与羊抗鼠抗体复合物，利用紫外分光光度仪测定浓度。
盐霉素单克隆抗体的制备：将保藏编号为CGMCC No.1609的单克隆杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。
所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为2mg/L；所述细胞培养基的pH为7.4。
盐霉素单克隆抗体与“量子点与羊抗鼠抗体复合物”的结合物的制备：取盐霉素单克隆抗体工作液(A液)5ml，加入量子点与羊抗鼠抗体复合物(B液)3ml(即反应物中，盐霉素单克隆抗体与羊抗鼠抗体的摩尔比为1∶1.5)，轻轻混合，室温下孵育20min后，4℃，避光保存。
2、“阿维菌素单克隆抗体与生物素的复合物”与“亲和素与量子点的复合物”的结合物；
量子点的表征：1、量子点的组成：核为CdSe，壳为ZnS；2、量子点的直径10~15nm；3、量子点的发光情况：绿色荧光；4、在酶标仪检测的波长(即激发波长400nm)下，量子点的特征发射波长525nm。
上述量子点为表面羧基修饰的量子点，购自invitrogen公司，产品目录号为Cat.No.Q21541MP；
阿维菌素单克隆抗体的制备：将保藏编号为CGMCC No.1606的单克隆杂交瘤细胞株置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。
所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为2mg/L；所述细胞培养基的pH为7.4。
阿维菌素单克隆抗体与生物素的复合物的制备：将阿维菌素单克隆抗体用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)或0.5mol/L硼酸缓冲液(pH 8.6)稀释到1mg/m L，对抗体充分透析。用1ml DMSO溶解N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHSB)1mg，向1ml抗体溶液(即一抗蛋白质1mg)加入120μl NHSB溶液(即NHSB 120μg)；在室温下持续搅拌，保温2~4小时；加入9.6μl1mol/l NH4Cl水溶液(即每25μgNHSB加1μl NH4Cl水溶液)，在室温下搅拌10分钟；在4℃，超滤除去游离的生物素；将样品上1ml的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1ml/管，蛋白质在1~3ml之间洗下，得到一抗与生物素的复合物；最后，样品加入叠氮钠(叠氮钠在样品中的终浓度0.5g/L)及BSA(BSA在样品中的终浓度为1.0g/L)。将产物置4℃，避光保存，亦可加入50％重蒸甘油，置-20℃保存。
亲和素与量子点的复合物的制备：用磷酸缓冲液(PBS 0.1mol/L，pH＝8.2)将量子点进行10倍稀释成浓度为0.08μM，加入100μL浓度为5.0g/L的EDC，室温下搅拌1min后，并向其加入5mg的链亲和素，室温下搅拌反应2.5h后。经过Sephadex G2100层析柱进行分离纯化，得到得到量子点标记的链亲和素溶液，将产物置4℃，避光保存。
“阿维菌素单克隆抗体与生物素的复合物”与“亲和素与量子点的复合物”的结合物的制备：取“阿维菌素单克隆抗体与生物素的复合物”(C液)5ml，加入“亲和素与量子点的复合物”(D液)3ml(即反应物中，生物素和亲和素的摩尔比为1∶1)，轻轻混合，室温下孵育20min后，得到“阿维菌素单克隆抗体与生物素的复合物”与“亲和素与量子点的复合物”的结合物；4℃，避光保存。
3、磺胺喹噁啉单克隆抗体与“SPA与量子点的复合物”的结合物
金黄色葡萄球菌A蛋白即为SPA；
量子点的表征：1、量子点的组成：核为CdSe，壳为ZnS；2、量子点的直径10~15nm；3、量子点的发光情况：红色荧光；4、在酶标仪检测的波长(即激发波长400nm)下，量子点的特征发射波长655nm。
上述量子点为表面氨基修饰的量子点，购自invitrogen公司，产品目录号为Cat.No.Q21521MP；
磺胺喹噁啉单克隆抗体的制备：将保藏编号为CGMCC No.1615的单克隆杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。
所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(体积百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为2mg/L；所述细胞培养基的pH为7.4。
“SPA与量子点的复合物”的制备：取氨基修饰的量子点溶于0.2ml的25％戊二醛溶液中(以0.1M、pH值为6.8的PBS缓冲液配制)，盖好瓶盖。室温放置18小时(防止干燥，可放在温盒中)。于4℃下对1000ml生理盐水透析三天，换水3~4次，以除去游离的戊二醛，然后加生理盐水至1ml。加1ml浓度为5mg/ml的SPA生理盐水溶液。加0.1ml 1.0M碳酸盐缓冲液(pH9.5)，混匀，4℃冰箱内静置24小时。加0.1ml、0.2M赖氨酸水溶液，混匀后室温静置2小时，以封闭戊二醛上多余的醛基。1000ml 0.02M PBS缓冲液(pH7.4)透析24小时。搅拌下逐滴加等量100％饱和度的硫酸铵，4℃冰箱内静置60分钟后，离心3000rpm，30分钟(或4000rpm，15分钟)，收集沉淀，沉淀即为SPA与量子点的复合物。沉淀用50％饱和度的硫酸胺洗2次。将沉淀溶于少量0.02M PBS缓冲液(pH7.4)中。4℃PBS缓冲液透析24小时，中间换液三次。结合物4℃，避光保存。
磺胺喹噁啉单克隆抗体与“SPA与量子点的复合物”的结合物的制备：取磺胺喹噁啉单克隆抗体(E液)5ml，加入“SPA与量子点的复合物”溶液(F液)3ml(即反应物中，磺胺喹噁啉单克隆抗体与SPA的摩尔比为1∶2)，轻轻混合，室温下孵育20min后，得到磺胺喹噁啉单克隆抗体与“SPA与量子点的复合物”的结合物，4℃，避光保存。
实施例2、检测方法
1、标准曲线的制作
向包被有三种包被原的酶标板的同一微孔中加入盐霉素标准品溶液20μl、阿维菌素标准品溶液20μl、磺胺喹噁啉标准品溶液20μl，随后相继加入三种发光复合物各40μl，37℃温育30分钟，倒出孔内液体，260μl/孔洗涤4次，拍干。设定激发波长和发射波长(激发波长400nm，发射波长：盐霉素发光复合物对应的发射波长585nm；阿维菌素复合物对应的发射波长525nm；磺胺喹噁啉发光复合物对应的发射波长655nm；)，多功能酶标仪进行读数，测定相对荧光强度。
盐霉素标准品溶液设如下不同浓度：0、0.2、1、5、25、125μg/l；
阿维菌素标准品溶液设如下不同浓度：0、0.2、1、5、25、125μg/l；
磺胺喹噁啉标准品溶液设如下不同浓度：0、0.2、1、5、25、125μg/l；
对于每种标准品而言，用每个浓度的标准品溶液的相对荧光强度平均值(F)除以第一个标准品溶液(0标准)的相对荧光强度(F0)再乘以100％，得到百分相对荧光强度值。以该种标准品浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分相对荧光强度值为Y轴，绘制标准曲线图。得到相应的标准曲线。盐霉素标准品、阿维菌素标准品、磺胺喹噁啉标准品的标准曲线如图3所示。
百分相对荧光强度值(％)＝(F/F0)×100％。
2、对检测样本溶液进行检测
向包被有三种包被原的酶标板同一微孔中加入检测样本溶液50μl，随后相继加入三种发光复合物各40μl，37℃温育30分钟，倒出孔内液体，260μl/孔洗涤4次，拍干。设定激发波长和发射波长，多功能酶标仪进行读数，测定相对荧光强度。
结果判断：用加入检测样本溶液的孔中盐霉素包被原与发光复合物形成的复合物的相对荧光强度平均值(F)除以第一个盐霉素标准品溶液(0标准)的相对荧光强度值(F0)再乘以100％，得到百分相对荧光强度值。将百分相对荧光强度值与盐霉素标准品标准曲线中的百分相对荧光强度值对应，则从标准曲线上读出该检测样本中盐霉素的残留量。同理，得到该检测样本中阿维菌素、磺胺喹噁啉的残留量。
3、样品前处理
在检测前，可对待检测样品进行前处理，例如牛奶样品的处理如下：
对牛奶样品进行脱脂(4000rmp离心5min)后，弃去上层脂类物质，用吸管吸取2ml至50ml聚苯乙烯离心管中，加入0.1mol/l pH7.2的PBS溶液按1∶9进行稀释，混匀后取50μl分析。
实施例3、试剂盒的效果
(一)灵敏度(IC50和检测限)
评价竞争酶联免疫吸附试验反应灵敏度的方法，常用的有IC50抑制浓度(指标准溶液吸光度值的50％处所对应的药物浓度)和检测限，两者值越低说明方法的灵敏度越高。检测限的定义有多种，本实验中检测限的定义为：20份空白样品或零标准品的测定平均值加3倍标准差为方法的检测限。
根据实验二中的三种标准曲线，得到三种物质对应的IC50抑制浓度，如表1-3所示。
将20份不含阿维菌素、盐霉素和磺胺喹噁啉的牛奶样品分别按照实施例2中所述方法进行前处理，然后按照实施例2中所述方法进行检测，计算检测限。结果如表4-表6所示。
表1阿维菌素类IC50统计表μg/l
表2盐霉素IC50统计表μg/l
表3磺胺喹噁啉IC50统计表μg/l
表4阿维菌素空白牛奶测定结果统计表μg/l
表5盐霉素空白牛奶测定结果统计表μg/l
表6磺胺喹噁啉空白牛奶测定结果统计表μg/l
结果表明，本方法对阿维菌素检测的IC50在2.0μg/l左右，对牛奶样品中阿维菌素的检测限为0.5μg/l；对盐霉素检测的IC50在1.5μg/l左右，对牛奶样品中盐霉素的检测限为0.4μg/l；对磺胺喹噁啉检测的IC50在1.0μg/l左右，对牛奶样品中磺胺喹噁啉的检测限为0.15μg/l。
(二)添加回收率试验
向同一份不含阿维菌素、盐霉素和磺胺喹噁啉的空白牛奶样品中，添加阿维菌素、盐霉素和磺胺喹噁啉三种标准品，使牛奶样品中阿维菌素、盐霉素和磺胺喹噁啉的浓度分别为1μg/l和2μg/l；将添加后的样品按照实施例2中样品前处理方法进行前处理，得到样本溶液，再按照实施例2中检测方法进行检测。每个浓度做5个平行，分别计算每种添加物质的回收率(回收率＝实测值/添加值)。
结果见表7。
表7样本回收率测定
结果表明，牛奶样品中三种物质的添加回收率在73.5％~97.2％之间，符合准确度的测定标准。
(三)精密度试验
向同一份不含阿维菌素、盐霉素和磺胺喹噁啉的空白牛奶样品中，添加阿维菌素、盐霉素和磺胺喹噁啉三种标准品，使牛奶样品中阿维菌素、盐霉素和磺胺喹噁啉的浓度分别为4.0μg/l；将添加后的样品按照实施例2中样品前处理方法进行前处理，得到样本溶液，再按照实施例2中检测方法进行检测。每个实验重复5次，分别计算变异系数。结果分别见表8、9、10。
板内变异系数的计算方法：板内变异系数＝同一次测定的同一块板内某样本(一般为中等水平)重复测定次数所得结果的变异系数。
批内变异系数的计算方法：批内变异系数＝同一次测定中各平行样本的变异系数。
批间变异系数的计算方法：批间变异系数＝同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。
表8添加阿维菌素的精密度试验结果(添加浓度4.0μg/l)
表9添加盐霉素的精密度试验结果(添加浓度4.0μg/l)
表10添加磺胺喹噁啉的精密度试验结果(添加浓度4.0μg/l)
结果，本试剂盒添加阿维菌素类药物样品的精密度在4.7％~10.2％之间，添加盐霉素药物样品精密度在5.5％~9.6％，添加磺胺喹噁啉药物样品精密度在3.4％~9.2％，满足残留检测需求。
(四)交叉反应率试验
选择与待测药物类似结构的化合物和临床使用的代表兽药，测定交叉反应率。通过各种标准曲线分别得到其50％抑制浓度。用下式计算该方法对其它类似物的交叉反应率。
结果如表11所示。
表11交叉反应率
| 名称 | 交叉反应率(％) | 名称 | 交叉反应率(％) | 名称 | 交叉反应率(％) |
| 阿维菌素 | 100 | 盐霉素 | 100.0 | 磺胺喹噁啉 | 100.0 |
| 伊维菌素 | 85 | 马杜霉素 | ＜2 | 磺胺甲噁唑 | ＜1.0 |
| 多拉菌素 | 71 | 甲基盐霉素 | ＜1.0 | 磺胺嘧啶 | ＜1.0 |
| 爱普菌素 | 62 | 红霉素 | ＜1.0 | 磺胺二甲嘧啶 | ＜1.0 |
| 四环素 | ＜0.1 | 泰乐菌素 | ＜0.1 | 磺胺间甲氧嘧啶 | ＜1.0 |
| 红霉素 | ＜0.1 | 莫能菌素 | ＜0.1 | 磺胺甲嘧啶 | ＜1.0 |
结果表明，本方法对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、爱普菌素、磺胺喹噁啉和盐霉素的特异性好，可以用于对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、爱普菌素、磺胺喹噁啉和盐霉素药物的同步测定。
Claims (7)
1.一种免疫试剂盒，包括不透明微孔板和发光复合物，所述不透明微孔板中至少有一个孔包被有三种小分子物质包被原；
所述三种小分子物质包被原选自如下任意一种且不相同：小分子物质I的半抗原与载体蛋白的偶联物、小分子物质II的半抗原与载体蛋白的偶联物和小分子物质III的半抗原与载体蛋白的偶联物；所述小分子物质I、小分子物质II和小分子物质III不相同；
所述发光复合物为如下1)、2)和3)所示：
1)抗小分子物质I的抗体、抗抗体和量子点I形成的结合物，记作结合物I；其中，量子点I与抗抗体形成复合物，复合物再通过抗抗体与抗小分子物质I的抗体的相互作用而与抗小分子物质I的抗体相结合形成结合物I；
2)抗小分子物质II的抗体、生物素、亲和素与量子点II形成的结合物，记作结合物II；其中，抗小分子物质II的抗体与生物素形成复合物I，亲和素与量子点II形成复合物II，复合物I与复合物II通过生物素与亲和素的相互作用而结合形成结合物II；
3)抗小分子物质III的抗体、金黄色葡萄球菌A蛋白与量子点III形成的结合物，记作结合物III；其中，金黄色葡萄球菌A蛋白与量子点III形成复合物III，复合物III再通过金黄色葡萄球菌A蛋白与抗小分子物质III的抗体的相互作用而与抗小分子物质III的抗体相结合形成结合物III；
所述量子点I、量子点II和量子点III在相同的激发波长下具有不同的特征发射波长；
所述抗小分子物质I的抗体、抗小分子物质II的抗体和抗小分子物质III的抗体选自如下任意一种且不相同：由保藏编号为CGMCC No.1609的单克隆杂交瘤细胞株A-2-3分泌得到的单克隆抗体、由保藏编号为CGMCC No.1606的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4分泌得到的单克隆抗体和由保藏编号为CGMCC No.1615的单克隆杂交瘤细胞株A-4-1分泌得到的单克隆抗体；
所述小分子物质I、小分子物质II和小分子物质III选自如下a)、b)和c)中的任意一种且不相同：a)盐霉素，b)磺胺喹噁啉，c)阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素或爱普菌素。
2.根据权利要求1所述的免疫试剂盒，其特征在于：所述免疫试剂盒中包括标准品溶液、洗涤液和样品稀释液；
所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。
3.根据权利要求2所述的免疫试剂盒，其特征在于：所述标准品溶液为如下1)、2)和3)所示：
1)如下各浓度的阿维菌素标准品溶液：0、0.2、1、5、25、125μg/L；
2)如下各浓度的盐霉素标准品溶液：0、0.2、1、5、25、125μg/L；
3)如下各浓度的磺胺喹噁啉标准品溶液：0、0.2、1、5、25、125μg/L。
4.根据权利要求3所述的免疫试剂盒，其特征在于：所述抗抗体为羊抗鼠抗体。
5.根据权利要求4所述的免疫试剂盒，其特征在于：所述量子点为具有如下发射波长的量子点：525nm、585nm或655nm。
6.根据权利要求5所述的免疫试剂盒，其特征在于：所述不透明微孔板中，所述三种小分子物质包被原的量分别为48-50ng/孔、38-42ng/孔和28-32ng/孔。
7.一种检测样品中对人体或动物体有害的小分子物质残留的方法，是用权利要求6所述免疫试剂盒对待测样品进行检测；
所述方法包括如下步骤：
1)制作权利要求6所述免疫试剂盒中的每种小分子物质对应的标准曲线，所述标准曲线的横坐标为所述小分子物质标准品溶液的浓度值、所述小分子物质标准品溶液的浓度值的对数值或所述小分子物质标准品溶液的浓度值的半对数值，所述标准曲线的纵坐标为各所述小分子物质包被原与发光复合物形成的复合物的相对荧光强度；
2)向权利要求6所述免疫试剂盒中的不透明微孔板的孔中加入待测样品的溶液，再加入所述免疫试剂盒中的三种发光复合物，孵育；检测孔中各种所述小分子物质包被原与发光复合物形成的复合物的相对荧光强度；
3)将步骤2)中得到的小分子物质包被原与发光复合物形成的复合物的相对荧光强度与步骤1)中的小分子物质的标准曲线中的相对荧光强度进行比较，得出所测样品中小分子物质的浓度值。
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| CN101762706A (zh) | 2010-06-30 |
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