CN101315379B - 一种用于检测莱克多巴胺的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测莱克多巴胺的试剂盒及其应用，所述的试剂盒包括下述成分：①包被了莱克多巴胺抗原的酶标板；②莱克多巴胺标准样溶液；③莱克多巴胺抗体；④链霉亲和素标记辣根过氧化物酶；⑤生物素标记的第二抗体；⑥底物显色液：所述的显色液包括底物溶液A和底物溶液B，所述的底物溶液A包括无水醋酸钠8.2重量份、β-糊精2.5重量份、过氧化氢脲0.150重量份、双蒸水1000重量份；所述的底物溶液B包括0.050重量份的四甲基联苯胺TMB和5重量份的二甲基亚砜DMSO；⑦终止液：所述的终止液为浓度为1.25mol/L的硫酸。本发明提供的试剂盒不仅适于大批量样本快速检测，而且灵敏度较高且检出限低于同类检测产品，属于莱克多巴胺的检测领域。

Description

一种用于检测莱克多巴胺的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种莱克多巴胺的检测领域，具体涉及一种用于检测莱克多巴胺的试剂盒，本发明还涉及上述试剂盒在检测莱克多巴胺中的应用。

背景技术

莱克多巴胺(Ractopamine，RAC )，化学名称为N-[2-(4-羟基苯基)-2-羟基乙基]-1-甲基-3-(4-羟基苯基)丙氨，化学结构如式(I)所示。市场销售的莱克多巴胺为其盐酸盐，称为盐酸莱克多巴胺(RAC·HCl)，分子式为C₁₈H₂₃O₃H·HCl，分子量为337.83，成白色粉末状，常温下暴露在空气中性质稳定，微溶于丙酮，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，溶液成中性，pH为6.0～7.0。

式I莱克多巴胺的化学结构

美国FDA规定人对于RAC的最大摄入量(ADI)为1.25μg/(kg体重·d)。超过这一剂量，就会出现不同程度的中毒反应，其症状与动物中毒症状相似，表现为肌肉震颤、四肢麻痹、心动过速、心律失常、腹痛、肌肉疼痛、恶心、眩晕等。目前，莱克多巴胺在我国属于违禁药物。

生物素-亲合素系统(biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。BAS已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。其性质概括如下：

(1)二者具有高度的特异的亲和性：生物素与(链霉)亲和素之间的亲和性，至少是抗原抗体间的一万倍以上，且不易受外界干扰，复合物稳定；

(2)桥联作用：二者均可偶联蛋白质、核酸、多糖和酶等生物活性物质，同时还能与固相材料结合，通过这些特性可将它们偶联起来；

(3)多级放大作用：一个蛋白质(或核酸等)分子上可结合多个生物素分子，而一个亲和素又可结合四个生物素，因而生物素与亲和素具有多级放大作用。

BA技术的这些特性，使其在生物学、分子生物学、生物化学、临床医学等领域广泛应用。

CN1766630A公开了一种检测动物源性食品中莱克多巴胺的酶联免疫试剂盒，及使用该试剂盒对预处理的动物源性食品进行莱克多巴胺残留检测的方法。该试剂盒组成为：包被了莱克多巴胺抗原或抗抗体的酶标板、莱克多巴胺鼠单克隆抗体或多克隆抗体工作液、酶标记的抗抗体或酶标记的莱克多巴胺抗原、莱克多巴胺标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液和浓缩复溶液。该试剂盒存在灵敏度低的缺陷。

目前，常用于莱克多巴胺残留检测的方法主要有微生物法和仪器分析法，微生物法检测虽然经济、操作简便，但在样本中有其他文生物抑制剂存在时，其灵敏度和特异性受到限制；高效液相色谱分析法、气谱、气质联机法等单纯的仪器分析法，虽然灵敏度高，但样本前处理及测定操作烦琐，费用高，不适宜大量样本筛查。

发明内容

本发明的目的是提供一种适于大批量样本快速检测、灵敏度较高且检出限低于同类检测产品的用于检测莱克多巴胺的试剂盒。

本发明的另一目的是提供上述试剂盒检测莱克多巴胺的方法。

为实现上述发明目的，本发明的发明人在现有技术的基础上进行了大量的研究和创造性的劳动，研制出了一种用于检测莱克多巴胺的试剂盒，所述的试剂盒由下述成分组成：

①包被了莱克多巴胺抗原的酶标板；

②莱克多巴胺标准样溶液；

③莱克多巴胺抗体；

④链霉亲和素标记辣根过氧化物酶；

⑤生物素标记的第二抗体；

⑥底物显色液：所述的显色液包括底物溶液A和底物溶液B，所述的底物溶液A包括无水醋酸钠8.2重量份、β-糊精2.5重量份、过氧化氢脲0.150重量份、双蒸水1000重量份；所述的底物溶液B包括0.050重量份的四甲基联苯胺TMB和5重量份的二甲基亚砜DMSO；

⑦终止液：所述的终止液为浓度为1.25mol/L的硫酸。

一种利用所述试剂盒检测莱克多巴胺的方法，包括下述步骤：

①处理样品；

②向试剂盒中加入莱克多巴胺标准样溶液：将溶解于磷酸盐缓冲液中的莱克多巴胺标准样品加入到反应孔中，每孔加入100μL；

③向试剂盒中加入莱克多巴胺抗体：将莱克多巴胺抗体用磷酸盐缓冲液稀释1000倍，加入到反应孔中，每孔100μL，室温孵育60分钟，弃去孔中液体，洗液洗涤4次；

④利用链霉亲和素标记辣根过氧化物酶进行放大：将生物素标记第二抗体用磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液稀释50,000倍，每孔加入100μL，37℃反应30分钟后吐温20洗板4次，每孔加入100μL 0.5％小牛血清/磷酸盐缓冲液稀释50,000倍的链霉亲和素标记辣根过氧化物酶，37℃反应40分钟，吐温20洗板5次。

⑤用底物显色液进行显色：底物溶液A和底物溶液B混匀，显色时每孔加入150μL的底物显色液；

⑥利用终止液终止反应：显色20分钟后每孔加入50μL浓度为1.25mol/L的硫酸终止液，终止反应；

⑦读数：反应液在酶标仪450nm读取吸光值。

所述的步骤①为：将剔除脂肪的动物肌肉组织样品于离心管中，加入磷酸盐缓冲液，漩涡振荡器剧烈震荡2-5min，室温离心15min，取上清液15mL移至分液漏斗，加入正己烷，充分混合后静置，取下层清夜备用。

其中所述的试剂盒制备时，包被了莱克多巴胺抗原的酶标板按照如下的方法制备：将包被抗原RAC-OVA溶于50mmol、pH9-10的碳酸缓冲液中，配制成10μg/mL的包被液，在酶标板每孔中加入100μL包被液，37℃包被3小时后，弃去孔中液体，用磷酸盐缓冲液0.05％(v/v)，吐温20洗液洗涤3次；再利用封闭液封闭：酶标板的每孔加入0.5％脱脂奶粉/磷酸盐缓冲液封闭液200μL，在37℃条件下封闭1小时，弃去孔中液体，吐温20洗板3次。

本发明中使用的莱克多巴胺抗原可以采用使用活性酯法将莱克多巴胺半抗原与载体蛋白进行偶联得到，也可以从市场购买得到。

下面详细说明本发明的检测过程：

1、检测步骤

试剂盒的包被了莱克多巴胺抗原的酶标板的制备包括下述的包被和封闭步骤：

包被：将包被抗原(RAC-OVA)溶于50mmol、pH9-10的碳酸缓冲液中，配制成10μg/mL的包被液，于酶标板每孔中加入100μL包被液，37℃包被3小时后，弃去孔中液体，用磷酸盐缓冲液0.05％(v/v)，吐温20洗液洗涤3次；

封闭：每孔加入0.5％脱脂奶粉/磷酸盐缓冲液封闭液200μL，37℃封闭1小时，弃去孔中液体，吐温20洗板3次；

加样：将溶解于磷酸盐缓冲液中的莱克多巴胺标准样品或待测样品加入到反应孔中，每孔加入100μL；

竞争：将抗体用磷酸盐缓冲液稀释1000倍，加入到反应孔中，每孔100μL，室温孵育60分钟，弃去孔中液体，洗液洗涤4次；

放大：将生物素标记第二抗体用磷酸盐缓冲液稀释50,000倍，每孔加入100μL，37℃反应30分钟后吐温20洗板4次，每孔加入100μL 0.5％小牛血清/磷酸盐缓冲液稀释50,000倍的链霉亲和素标记辣根过氧化物酶，37℃反应40分钟，吐温20洗板5次。

显色：将无水醋酸钠8.2g、β-糊精2.5g、过氧化氢脲150mg溶解于1000mL双蒸水中，调pH至5.0，配置成底物溶液A，4℃保存；将50mg四甲基联苯胺(TMB)溶于5mL二甲基亚砜(DMSO)，配成底物溶液B；显色前混匀A与B。显色时每孔加入150μL的底物溶液，显色20分钟后每孔加入50μL 1.25mol/L的硫酸终止；

读数：反应液在酶标仪450nm读取吸光值。

2、条件优化及标线建立

2.1包被抗原、抗体使用浓度的确定

选定不同包被抗原及抗体浓度设置棋盘，按检测步骤进行实验，初步优选包被原及抗体浓度。

2.2封闭液的优选

初步选定以下几种物质作为备选封闭液：3％聚乙二醇，5％甘氨酸，0.5％脱脂奶粉，1％牛血清白蛋白(BSA)，1％卵清蛋白(OVA)，按照上述的实验步骤进行实验，每种封闭液对应不同标样浓度设置三个平行，比较封闭液封闭效果。

2.3其他条件的优化

生物素化第二抗体的稀释倍数、反应时间、温度条件，链霉亲和素标记辣根过氧化物酶的稀释倍数、反应时间、温度条件的优化方法参考封闭液的优选方法。

2.4绘制标准曲线

按照优选的条件及检测步骤测定不同标样浓度对应的吸光度值A_标样，以及空白值A_空白，对照值A_对照，根据公式计算抑制率值

(A为吸光值)

以莱克多巴胺浓度对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线是典型的S型曲线，参见图1。

3、基质前处理方法(基质影响的消除)

称取4g剔除脂肪的动物肌肉组织样品于50mL离心管中，加入20mL磷酸盐缓冲液，漩涡振荡器剧烈震荡2min，室温离心15min，转速为4000rpm，取上清液15mL移至100mL分液漏斗，加入10mL正己烷，充分混合后静置，取下层清夜备用。

从图2中的曲线的重合程度看，两条曲线基本重合，可以说，应用本发明的前处理方法，基本上消除了基质影响，达到了预期的目的。

4、方法的评价

4.1精密度

精密度是指对于同一样品多次测定结果的变化程度。以变异系数(CV％)表示，主要考查板内变异和板间变异。

取6个不同浓度的莱克多巴胺标准溶液，进行间接生物素-亲和素酶联免疫吸附分析法(BA-ELISA)分析，每个浓度10个平行，对于建立的方法进行精密度的测试。根据吸光度值求得抑制率进行分析。

取六个不同浓度的莱克多巴胺标准溶液，进行BA-ELISA分析，每个浓度每天作两次分析，综合5天测得的抑制率进行分析。

4.2准确度

准确度是指样品测定值与真实值的符合程度，通常以回收率实验来表示。

在未检出莱克多巴胺的阴性样品中添加不同含量水平的RAC标准品，进行添加回收试验。根据样品前处理结果确定以1μg/kg、2μg/kg和10μg/kg三个浓度添加到所选样品中，每个浓度做3个平行，进行间接BA-ELISA测定，计算回收率。

本发明提供的用于检测莱克多巴胺的试剂盒与现有技术相比，增加了信号放大系统链霉亲和素标记辣根过氧化物酶，使得检测的灵敏度大大提高，检测限低，节省了大量抗体用量。莱克多巴胺的检测实验表明，样品检测限达到0.3±0.05ng/mL，而且抗体的稀释度可达到1000倍，整板用量(按100孔计)约为30μg，与直接竞争ELISA(约100μg)和间接竞争ELISA(约100μg)相比，大大减少了抗体的使用量。

利用本发明提供得到试剂盒进行莱克多巴胺检测时，样品前处理是将剔除脂肪的动物肌肉组织样品于离心管中，加入磷酸盐缓冲液，漩涡振荡器剧烈震荡2-5min，室温离心15min，取上清液15mL移至分液漏斗，加入正己烷，充分混合后静置，取下层清夜备用。上述前处理方法操作简便、快速，无需有机溶剂反复萃取，蒸干有机溶剂及复溶等繁琐操作。完成全部检测操作过程需4-5小时，适合现场检测的需要。从图2中曲线的重合程度看，两条曲线基本重合，可以说，应用本发明的前处理方法，基本上消除了基质影响，达到了预期的目的。

莱克多巴胺的检测实验

1.检测条件的确立：

包被：将包被抗原(RAC-OVA)溶于50mmo l、pH9-10的碳酸缓冲液中，配制成10μg/mL的包被液，于酶标板每孔中加入100μL包被液，37℃包被3小时后，弃去孔中液体，用磷酸盐缓冲液0.05％(v/v)，吐温20洗液封闭：每孔加入0.5％脱脂奶粉/磷酸盐缓冲液封闭液200μL，37℃封闭1小时，弃去孔中液体，吐温20洗板3次；

加样：将溶解于磷酸盐缓冲液中的莱克多巴胺标准样品或待测样品加入到反应孔中，每孔加入100μL；

竞争：将抗体用磷酸盐缓冲液稀释1000倍，加入到反应孔中，每孔100μL，室温孵育60分钟，弃去孔中液体，洗液洗涤4次；

放大：将生物素标记第二抗体用磷酸盐缓冲液稀释50,000倍，每孔加入100μL，37℃反应30分钟后吐温20洗板4次，每孔加入100μL0.5％小牛血清/磷酸盐缓冲液稀释50,000倍的链霉亲和素标记辣根过氧化物酶，37℃反应40分钟，吐温20洗板5次。

显色：将无水醋酸钠8.2g、β-糊精2.5g、过氧化氢脲150mg溶解于1000mL双蒸水中，调pH至5.0，配置成底物溶液A，4℃保存；将50mg四甲基联苯胺(TMB)溶于5mL二甲基亚砜(DMSO)，配成底物溶液B；显色前混匀A与B。显色时每孔加入150μL的底物溶液，显色20分钟后每孔加入50μL1.25mol/L的硫酸终止；

读数：反应液在酶标仪450nm读取吸光值。

2.标线建立

以莱克多巴胺浓度对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线是典型的S型曲线，参见图1：

按照优选的条件及检测步骤测定不同标样浓度对应的吸光度值A_标样，以及空白值A_空白，对照值A_对照，根据公式计算抑制率值

(A为吸光值)

3.基质影响的消除

参见图2(需要说明如何做的图)：从图中曲线的重合程度看，两条曲线基本重合，可以说，应用本发明的前处理方法，基本上消除了基质影响，达到了预期的目的。

4.方法评价：

4.1精密度

4.1.1板内变异

取6个不同浓度的莱克多巴胺标准溶液，进行间接BA-ELISA分析，每个浓度10个平行，对于建立的方法进行精密度的测试。根据吸光度值求得抑制率进行分析，结果见表1。

表1莱克多巴胺间接BA-ELISA板内变异

从表中数据可以看出，除最低浓度点变异系数较大外，其余各点均小于10％。

4.1.2板间变异

取六个不同浓度的莱克多巴胺标准溶液，进行BA-ELISA分析，每个浓度每天做两次分析，综合5天测得的抑制率进行分析，结果见表2。

表2莱克多巴胺间接BA-ELISA板间变异

4.2准确度

在未检出莱克多巴胺的阴性样品中添加不同含量水平的RAC标准品，添加浓度为1μg/kg、2μg/kg和10μg/kg，计算得回收率见表3。

表3猪肉样品的回收率

附图说明

图1为莱克多巴胺的检测实验中莱克多巴胺浓度与抑制率关系。

图2为莱克多巴胺的检测实验中基质对抑制率的影响图

图3为实施例1中抗体用磷酸盐缓冲液加样示意图；

图4为实施例1中莱克多巴胺浓度与抑制率关系曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步描述。

1.1样品的前处理：

选取猪肉阴性样，预先添加莱克多巴胺标准样品，添加最终浓度为2μg/kg。

称取4g上述猪肉，剔除脂肪，置于50mL离心管中，加入20mL磷酸盐缓冲液，漩涡振荡器剧烈震荡2min，室温离心15min，转速为4000rpm，取上清液15mL移至100mL分液漏斗，加入10mL正己烷，充分混合后静置，下层清液即为待测液，保存备用。

1.2检测方法

包被：将包被抗原(RAC-OVA)溶于50mmol、pH9-10的碳酸缓冲液中，配制成10μg/mL的包被液，于酶标板每孔中加入100μL包被液，37℃包被3小时后，弃去孔中液体，用磷酸盐缓冲液0.05％(v/v)，吐温20洗液洗涤3次；

封闭：每孔加入0.5％脱脂奶粉/磷酸盐缓冲液封闭液200μL，37℃封闭1小时，弃去孔中液体，吐温20洗板3次；

配样：以磷酸盐缓冲液配置浓度为20ng/mL的莱克多巴胺标准溶液，由该溶液5倍梯度稀释，最终得到如下浓度标准溶液，20ng/mL、4ng/mL、0.8ng/mL、0.16ng/mL、0.032ng/mL、0.0064ng/mL。

加样：加样示意图如图4，将梯度稀释的莱克多巴胺标准溶液浓度由低到高分别加入到对应反应孔I-VI中，每孔加入100μL，每个浓度设置3个平行孔；反应孔B、C孔分别加入100μL磷酸盐缓冲液；反应孔M孔(6个平行)，加入1.1方法处理过的代测液100μL。

竞争：将抗体用磷酸盐缓冲液稀释1000倍，加入到反应孔中(除B孔外)，每孔100μL，B孔中加入100μL磷酸盐缓冲液，室温孵育60分钟，弃去孔中液体，洗液洗涤4次，加样示意图参见图3；

放大：将生物素标记第二抗体用磷酸盐缓冲液稀释50,000倍，所有反应孔均加入100μL，37℃反应30分钟后吐温20洗板4次，所有反应孔均加入100μL浓度为0.5％小牛血清/磷酸盐缓冲液稀释50,000倍的链霉亲和素标记辣根过氧化物酶，37℃反应40分钟，吐温20洗板5次。

显色：将无水醋酸钠8.2g、β-糊精2.5g、过氧化氢脲150mg溶解于1000mL双蒸水中，调pH至5.0，配置成底物溶液A，4℃保存；将50mg四甲基联苯胺(TMB)溶于5mL二甲基亚砜(DMSO)，配成底物溶液B；显色前混匀A与B。显色时所有反应孔均加入150μL的底物溶液，显色20分钟后每孔加入50μL 1.25mol/L的硫酸终止；

读数：反应液在酶标仪450nm读取吸光值。

绘制标准曲线：根据公式计算抑制率值，以莱克多巴胺浓度对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制标准曲线，如图4所示。

样品检测结果：由吸光值计算出抑制率为48.18％，读取图4得到检测结果约为0.31ng/mL，根据前处理方法(5倍提取)换算出样品中莱克多巴胺的含量为1.55μg/kg，回收率为77.5％。

Claims (2)

1.一种用于检测莱克多巴胺的试剂盒，其特征在于所述试剂盒由下述成份组成：

①包被了莱克多巴胺抗原的酶标板；

②莱克多巴胺标准样溶液；

③莱克多巴胺抗体；

④链霉亲和素标记辣根过氧化物酶；

⑤生物素标记的第二抗体；

⑥底物显色液：所述的底物显色液包括底物溶液A和底物溶液B，所述的底物溶液A为无水醋酸钠8.2g、β-糊精2.5g、过氧化氢脲0.150g、溶解于双蒸水1000ml中，调节pH至5.0；所述的底物溶液B为0.050g的四甲基联苯胺TMB溶于5ml的二甲基亚砜DMSO；

⑦终止液：所述的终止液为浓度为1.25mol/L的硫酸。

2.一种利用权利要求1所述试剂盒检测莱克多巴胺的方法，其包括下述步骤：

①处理样品：将剔除脂肪的动物肌肉组织样品于离心管中，加入磷酸盐缓冲液，漩涡振荡器剧烈震荡2-5min，室温离心15min，取上清液15mL移至分液漏斗，加入正己烷，充分混合后静置，取下层清液备用；

②加样：将溶解于磷酸盐缓冲液中的莱克多巴胺标准样品或待测样品加入到反应孔中，每孔加入100μL；

③竞争：将莱克多巴胺抗体用磷酸盐缓冲液稀释1000倍，加入到反应孔中，每孔100μL，室温孵育60分钟，弃去孔中液体，洗液洗涤4次；

④放大：将生物素标记的第二抗体用磷酸盐缓冲液稀释50,000倍，每孔加入100μL，37℃反应30分钟后吐温20洗板4次，每孔加入100μL 0.5％小牛血清/磷酸盐缓冲液稀释50,000倍的链霉亲和素标记辣根过氧化物酶，37℃反应40分钟，吐温20洗板5次；

⑤用底物显色液进行显色：底物溶液A和底物溶液B混匀，显色时每孔加入150μL的底物显色液；

⑥利用终止液终止反应：显色20分钟后每孔加入50μL浓度为1.25mo l/L的硫酸，终止反应；

⑦读数：反应液在酶标仪450nm读取吸光值。

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