CN101852720B

CN101852720B - 一种检测猪肉中莱克多巴胺的生物传感器方法

Info

Publication number: CN101852720B
Application number: CN2010101703716A
Authority: CN
Inventors: 吕潇; 黎秀卿; 苑学霞; 邓立刚; 郑红; 赵善仓; 郭长英; 张红; 王文正; 汝医
Original assignee: CENTRAL LABORATORY OF SHANDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCE
Current assignee: CENTRAL LABORATORY OF SHANDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCE
Priority date: 2010-05-12
Filing date: 2010-05-12
Publication date: 2011-08-24
Anticipated expiration: 2030-05-12
Also published as: CN101852720A

Abstract

本发明公开了一种检测猪肉中莱克多巴胺的生物传感器方法。它利用了竞争抑制反应的原理，在芯片表面固定莱克多巴胺衍生物，然后将莱克多巴胺抗体和含有莱克多巴胺的样品混合后注射到芯片表面，则样品中莱克多巴胺抑制抗体与芯片表面莱克多巴胺衍生物的结合，利用样品中莱克多巴胺含量与抗体与芯片表面莱克多巴胺衍生物的结合相对响应值成反比，来检测样品中的莱克多巴胺的残留量，包括：猪肉样品的前处理、莱克多巴胺衍生物的固定、猪肉样品中莱克多巴胺的残留检测和分析检测结果。本方法操作简单，成本低，特异性强，无需标记，再生简单，回收率，精密度良好，并可实现实时检测。为准确的，低成本的猪肉中莱克多巴胺的在线检测提供了技术支持。

Description

一种检测猪肉中莱克多巴胺的生物传感器方法

技术领域

本发明涉及一种检测莱克多巴胺残留的方法，特别涉及猪肉中莱克多巴胺残留的生物传感器测定方法。

背景技术

莱克多巴胺(ractopamine，Rac)属于苯乙胺类-β₂受体激动剂，见结构式如下所示：

Rac起初主要用于治疗支气管哮喘、阻塞性肺炎，痉挛等症状。后来发现它和盐酸克伦特罗一样，有营养再分配的作用，抑制脂肪的合成，促进蛋白质的积累，从而提高胴体的瘦肉率，但人体的摄入量超过了一定值后，就会发生头痛，胸闷等不良反应，因此欧盟和我国先后都颁布法令禁止在畜禽生产中使用该类药物。

现存的检测猪肉中莱克多巴胺的方法有以下几种。

酶联免疫(ELISA)法，是利用抗原抗体特异性结合的原理来检测样品中药物的一种方法。如Shelver W L，Smith D J.J.Agric.Food Chem.，2002，50(10)：2742～2747。但是此方法需要标记，而且反应时间比较长。

气相色谱质谱联用法，如应永飞，陆春波，任玉琴，吴平谷，林仙军.中国兽药杂志，2006，40(5)：23～26.此方法需要衍生化，一方面衍生化试剂比较昂贵，另一方面衍生化过程不仅消耗时间，还会产生许多副产物，从而影响检测结果的准确性。

液相色谱质谱联用法，因不需衍生化最近几年被普遍使用，而且灵敏度高，特异性好，如M L，Churchwell，C L Holder，D Little，S Preece，D J Smith，D R Doerge.RapidCommun，Mass Spectrom.2002；16：1261-1265.但对操作人员的专业能力要求很高，机器运转，前处理所需要的固相萃取柱的成本也很昂贵。

生物传感器检测莱克多巴胺残留的方法国内还没有涉及，国外对莱克多巴胺的检测涉及也很少，如W.L.Shelver，D.J.Smith.Agric.Food Chem.2003，51，3715-3721.，只是涉及到尿样的检测。如Thompson C S，Haughey S A，Traynor I M，Fodey T L，Elliott C T，Antignac JP，Bizec B L，Crooks S R H.，Anal.Chim.Acta，2008，608(2)：217～225.虽然对动物源性食品进行了检测，但对样品的基质效应并没有系统的讨论，对前处理也没做出优化处理。

发明内容

本发明旨在运用表面等离子谐振原理，提供一种检测猪肉中莱克多巴胺的生物传感器方法。此方法样品前处理相对简单，去除基质干扰能力强，成本低，无需标记，还能实现实时自动检测，克服现有技术存在的上述缺点。

本发明的技术方案是：利用了竞争抑制反应的原理，在芯片表面固定上莱克多巴胺衍生物，然后将莱克多巴胺抗体和含有莱克多巴胺的样品混合后注射到芯片表面，则样品中莱克多巴胺将抑制抗体与芯片表面莱克多巴胺衍生物的结合。利用样品中莱克多巴胺含量与抗体与芯片表面莱克多巴胺衍生物的结合相对响应值成反比，来检测样品中的莱克多巴胺的残留量。

本发明的具体步骤如下：

(1)猪肉样品的前处理

称取匀质好的猪肉样品，加入提取液，涡旋震荡，调PH为1.0，离心过滤后，滤液调PH到11，然后加入萃取液，震荡混匀，离心后移取上清液，重复萃取一次，合并上清液，氮气吹干后，用复溶液溶解后超声混匀，离心，过滤膜后，待生物传感器检测；

(2)莱克多巴胺衍生物的固定

首先将EDC(N-乙基-N′-(二甲氨基丙基)碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)混合后，对修饰有羧甲基化葡聚糖的芯片表面进行活化，然后将莱克多巴胺衍生物用醋酸缓冲溶液稀释后注入芯片表面，反应一段时间后，最后用乙醇胺灭活多余的酯键；

(3)猪肉样品中莱克多巴胺的残留检测

将步骤(1)制备的样品溶液与含有莱克多巴胺抗体的PBS缓冲液混合后，注入芯片表面反应，记录反应前后响应值的变化，然后通入HCl对芯片进行再生，每次通入样品前后都要通入含1％甲醇的PBS缓冲液，为了使基线平衡，并消除非特异性结合；

(4)分析检测结果

用含1％甲醇的PBS缓冲液逐级稀释标准中间液，配制成一组工作标准溶液，其中抗体的最终稀释度为1∶200，莱克多巴胺的终浓度为0、1、2、5、10、20ng/mL，然后按随机顺序通入芯片中，以每个浓度下的标准溶液所得的相对响应值为纵坐标(Y)，标准溶液的浓度为横坐标(X)，建立标准校正曲线，在检测实际样品时，根据样品所得的相对响应值，然后从标准曲线中读出样品中药物含量。

优选地，步骤(1)前处理方法：所述提取液优选为高氯酸；所述萃取液优选为乙酸乙酯，复溶液优选为甲醇∶PBS缓冲液＝1∶9(V/V)。

所述步骤(1)最优选的处理方式为：称取5g匀质好的猪肉样品，加入20mL 0.1M的高氯酸，涡旋震荡3min，调pH为1.0，以4000rpm离心10min，过滤后，滤液用1M的氢氧化钠调pH到11，然后加入10mL乙酸乙酯，震荡混匀，以4000rpm离心10min离心后移取上清液，再在残余物中加入10mL乙酸乙酯，重复萃取一次，合并上清液，在40℃水浴下氮气吹干后，复溶于250uL的甲醇∶PBS(1∶9，V/V)溶液中，超声混匀30s，以10000rpm离心10min，离心后，取上清液过0.22um滤膜后，取25uL供生物传感器检测。

优选地，步骤(2)莱克多巴胺衍生物的固定方法为：

a活化：将0.4M EDC和0.1M NHS(1∶1，V/V)混合后，以10μL/min的流速对修饰有羧甲基化葡聚糖的芯片表面进行活化，活化时间为7min；

b固定：将莱克多巴胺衍生物(Rac-OVA，莱克多巴胺-鸡卵清白蛋白偶联物)用pH＝4.6的0.2M的醋酸缓冲溶液稀释100倍，然后以10μL/min的流速注入芯片表面反应10min；

c灭活：用1M乙醇胺(pH8.5)以10uL/min的流速注入7min，灭活多余的酯键。

优选地，步骤(3)猪肉样品中莱克多巴胺的残留检测为：将样品提取液按照1∶9(V/V)比例与含有莱克多巴胺抗体的PBS缓冲液混合，其中抗体的最终稀释度为1∶200，以10μL/min的流速注入芯片表面反应10min，记录反应前后响应值的变化，然后以20uL/min流速通入0.1M HCl再生3min，每次通入样品前后都要通入含1％甲醇的PBS缓冲液，为了使基线平衡，并消除非特异性结合。

优选地，步骤(4)标准中间液的配制为：首先称取莱克多巴胺标准品10mg，先用甲醇溶解为10mg/mL的标准储备液于-20℃保存，然后用pH＝7.4的PBS缓冲液稀释到1ug/mL的中间液，密封保存于4℃。

其中，表面等离子谐振生物传感器检测猪肉中莱克多巴胺残留的原理为：

(1)表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance SPR)是一种基于麦克斯韦电磁波理论的物理光学现象。当一束光照到表面溅射有金膜的芯片表面时，若入射光的波矢与金膜表面的等离子体波的波矢相等，表面等离子体与光子会发生共振，导致一部分光的能量被等离子所吸收，从而发生表面等离子体共振(SPR)现象。如果改变入射光的角度，同时记录反射光强的变化，可以得到SPR曲线。在曲线上的某个特定角度处，光吸收达到最大值，反射光的光强达到最小值，这称为SPR谐振峰，如果在金膜上固定某种生物分子，而该生物大分子可以与流通通道中的目标分子反应并结合，那么目标分子在芯片表面的结合则会使传感芯片金膜上的介质层折射率发生改变，进而促使SPR曲线谐振峰移动。通过检测谐振峰的移动就可以检测生物大分子之间的反应。

(2)样品检测采用竞争抑制反应法，将已知浓度的莱克多巴胺抗体与样品提取液混合后，注入固定有莱克多巴胺衍生物的芯片表面，样品中莱克多巴胺会抑制抗体与芯片表面衍生物的结合，样品中药物的浓度越高，抑制越强，SPR生物传感器产生的相对响应值越低，即SPR生物传感器产生的相对响应值与样品中莱克多巴胺的浓度成反比。

本发明的有益效果为：

(1)在猪肉样品的前处理过程，以高氯酸作为提取液，一方面对药物进行了酸解，使中性分子状态的莱克多巴胺转变成离子状态，最大限度的提取样品中的药物。另一方面在一定的PH下的强酸溶液中，猪肉中的蛋白质达到等电点，形成沉淀，去除了大部分基质干扰，一定程度上避免了非特异性吸附。

(2)在猪肉样品的前处理过程中，当把pH调到高于pKa时莱克多巴胺则又呈现中性分子状态，易溶于一定极性疏水有机溶剂乙酸乙酯，所以很容易的将药物从高氯酸层萃取到乙酸乙酯层，又一次的消除了杂质的干扰。

(3)在猪肉样品的前处理过程中，采用高速微量离心的方式，能有效的去除猪肉中的脂肪。

(4)本测定采用竞争抑制反应方法，利用传感器芯片表面响应值的变化进行定量和定性检测样品中莱克多巴胺的残留量。操作简单，成本低，特异性强，无需标记，再生简单，回收率，精密度良好，并可实现实时检测。为准确的，低成本的猪肉中莱克多巴胺的在线检测提供了技术支持。

附图说明

图1为三种校正曲线对基质效应影响结果图。

图2a为固定RAC抗体和采用直接法反应的SPR的曲线。图中1.活化；2.RAC抗体的固定；3.灭活；4.通入2.2ug/mL RAC 5.通入0.44ug/mL RAC。

图2b为固定RAC衍生物和采用间接竞争法反应的SPR的曲线。图中1.活化；2.RAC衍生物的固定；3.灭活(inactivation)；4.通入稀释200倍的抗体。

图3为莱克多巴胺衍生物的固定过程图。图中1.活化；2.pH4.6的醋酸缓冲液固定；3.灭活；4.通入含1％甲醇的PBS缓冲液。

图4为0.1M HCl对传感器的再生图。其中1.以10μL/min流速通入含1％甲醇的PBS缓冲液；2.以10μL/min的流速通入含有抗体的浓度为10ng/mL的莱克多巴胺溶液；3.同1；4.以20μL/min的流速通入0.1M HCl洗脱；5.以20μL/min的流速通入含1％甲醇的PBS缓冲液；6.同1。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。

本实施例所使用的表面等离子生物传感器为中国科学院电子学研究所自行研制的SPR-2004生物传感器，系统由以下模块组成：机械扫描系统，光学系统(入射光源，光接收器，光路系统)，流体注入分析系统，生化传感器芯片，系统控制和软件系统。

实施例1样品的前处理优化

对于血浆，胆汁，尿样，蜂蜜等液体样品，一般通过稀释处理即可去除大部分基质干扰，但是因猪肉中富含了大量的脂肪和蛋白质，并且这些基质的存在会引起非特异性反应，在竞争抑制反应中表现为假阴性。为了减少基质干扰，本发明通过比较两种前处理方法，对样品的处理进行了优化，具体如下：

方法一

称取5g匀质好的猪肉样品，加入20mL 0.1M的高氯酸，涡旋震荡3min，调pH为1.0，以4000rpm离心10min，过滤后，滤液用1M的氢氧化钠调pH到11，然后加入10mL乙酸乙酯，震荡混匀，以4000rpm离心10min离心后移取上清液，再在残余物中加入10mL乙酸乙酯，重复萃取一次，合并上清液，在40℃水浴下氮气吹干后，复溶于250uL的甲醇∶PBS(1∶9，V/V)溶液中，超声混匀30s，以10000rpm离心10min，离心后，取上清液过0.22um滤膜后，取25uL供生物传感器检测。

方法二

称取5g匀质好的猪肉样品，加入20mL无水乙腈，涡旋震荡3min，以4000rpm离心10min，过滤得上清液，再在残余物中加入10mL乙腈重复提取一次，合并上清液，在40℃水浴下氮气吹干后，复溶于250uL的甲醇∶PBS(1/9，V/V)溶液中，超声混匀30s，以10000rpm离心10min，离心后，取上清液过0.22um滤膜后，取25uL供生物传感器检测。

本实验采用测定校正曲线的方法。利用三种方式绘制校正曲线：(1)用含1％甲醇的PBS(纯溶剂)为稀释液配制工作标准液，进样建立校正曲线；(2)用PBS稀释10倍的阴性基质提取液(第一种前处理方法)作为稀释液配制工作标准液，进样建立校正曲线线；(3)用PBS稀释10倍的阴性基质提取液(第二种前处理方法)作为稀释液配制工作标准液，进样建立校正曲线线。通过比较三种校正曲线对基质效应及前处理方法进行考察。结果(如图1所示)显示，第一种前处理方法处理得到的阴性基质与纯溶剂校正曲线基本吻合，而第二种前处理方法处理得到的阴性基质与纯溶剂校正曲线差别较大，响应值增大。这主要的原因可能是抗体与猪肉中的蛋白质发生了非特异性反应，使响应值本底增大，而第一种前处理方法使用PH＝1的高氯酸提取，使蛋白质达到了等电点沉淀，从而有效的减少了基质中蛋白质对响应值的影响。然后再利用莱克多巴胺在碱性条件下易溶于一定极性的疏水有机溶剂，从而萃取到有机层。

另外复溶液选择甲醇∶PBS(1∶9，V/V)是为了更好的溶解被提取出来的分析物。

实施例2SPR生物传感器检测方法的优化

羧甲基葡聚糖的羧基经EDC和NHS活化后生成的活泼酯能与莱克多巴胺衍生物或莱克多巴胺抗体中所含的氨基发生耦联反应，从而使其固定在芯片表面，

为了简化实验，起初我们尝试直接将抗体固定在芯片上，然后在流通通道中通入一定浓度的莱克多巴胺标准品，记录分析物与抗体直接反应的信号值，见图2a，从图中可看到不管是通入高浓度(2.2ug/mL)的RAC(图2a，4)还是低浓度(0.44ug/mL)的RAC(图2a，5)，反应前后基线无明显变化，即响应值几乎没有改变。然后又尝试将莱克多巴胺衍生物固定于芯片上，采用间接竞争法，通入已知浓度(稀释200倍)的莱克多巴胺抗体与RAC的混合液，见图2b，从图2b，4和5中我们看到反应前后基线有明显的升高，即响应值有明显的变化。这主要的原因可能是直接法中RAC的分子量很小，产生的SPR信号值很小，而间接法中RAC先与抗体大分子反应，然后SPR记录的是莱克多巴胺衍生物与剩余的抗体大分子的反应，所以信号值比较大。

图2a中1.活化；2.RAC抗体的固定；3.灭活；4.通入2.2ug/mL RAC 5.通入0.44ug/mLRAC

图2b中1.活化；2.RAC衍生物的固定；3.灭活(inactivation)；4.通入稀释200倍的抗体

实施例3莱克多巴胺衍生物的固定

芯片表面的羧甲基葡聚糖的羧基经EDC和NHS活化后生成的活泼酯能与莱克多巴胺衍生物中所含的氨基发生偶联反应，从而使抗原固定在芯片表面，本实验中所采用的pH＝4.6，稀释度为1∶100的抗原在芯片表面能很快的结合。多余的活泼酯则与乙醇胺反应生成酰胺而失活。具体过程如下：

首先，将0.4M EDC和0.1M NHS(1∶1，V/V)混合后，以10μL/min的流速对修饰有羧甲基化葡聚糖的芯片表面进行活化，活化时间为7min；然后将莱克多巴胺衍生物用PH＝4.6的0.2M的醋酸缓冲溶液稀释100倍，然后以10μL/min的流速注入仪器中，反应10min，最后用1M乙醇胺(pH8.5)以10uL/min的流速注入7min，灭活多余的酯键。莱克多巴胺衍生物的固定过程见图3，图中1.活化；2.pH4.6的醋酸缓冲液固定；3.灭活；4.通入含1％甲醇的PBS缓冲液。

实施例4生物传感器的再生

抗体不仅能与固定在芯片表面上的抗原发生特异性结合，还可以与一部分未处理掉的基质蛋白发生非特异性结合，但这部分非特异性结合一般通过PBS缓冲液就可基本洗脱掉，见图4，其中2中响应值的升高为特异性和非特异性综合反应的结果，而1和3反应前后响应值的增加才是特异性反应的结果。但特异性结合是比较稳定的，若不进行有效的处理，芯片上就会残留有上一次反应的抗体，导致芯片的记忆效应，从而影响检测的准确性，这可通过酸碱解离或者通入有机溶剂的方法破坏抗原和抗体的键合作用，使芯片再生，进入下一个检测周期。本实验对0.1M NaOH，0.1M HCl，0.1M H₃PO₄三种溶液的再生能力进行了比较，0.1M HCl的洗脱能力较强，基本能使基线回复到结合前的水平，见图4中1和6.但是随着检测次数的增加，洗脱效果就达不到先前的效果，基线就会有显著的增加，这时可适当增加洗脱的时间来减少抗体的积累。

图4中1.以10μL/min流速通入1％甲醇PBS缓冲液；2.以10μL/min的流速通入含有抗体的浓度为10ng/mL的莱克多巴胺溶液；3.同1；4.以20μL/min的流速通入0.1M HCl洗脱；5.以20μL/min的流速通入1％甲醇PBS缓冲液；6.同1。

实施例5方法的确证

通过上述基质效应及前处理方法的考察，发现使用第一种前处理方法能有效的减少基质效应，并且和纯溶剂校正曲线基本一致，为了简化实验过程，故直接采用纯溶剂标准曲线制备定量校正曲线。

将一组纯溶剂工作标准溶液，其中抗体的最终稀释度为1∶200，莱克多巴胺的终浓度为0、1、2、5、10、20ng/mL，按随机顺序通入芯片，构建标准曲线方程。以混合物所得相对响应值为纵坐标(Y)，样品中莱克多巴胺的浓度为横坐标(X)，得相关系数R²＞0.98，SPR抑制反应方法的检出限采用6个不同批次空白猪肉样品经第一种前处理方法处理后，进行生物传感器检测，根据标准曲线得到的浓度计算其平均值(X)，再减去三倍标准偏差(SD)，得莱克多巴胺的方法检出限为0.6μg/kg，IC₅₀为6个空白浓度50％抑制处所对应的药物浓度，为6.1μg/kg。标准曲线的构建受到抗体，抗原的稀释度，流速，反应时间等条件的影响，由于本实验中抗原和抗体的反应时间只有10min，还远未达到平衡状态，所以延长反应时间会使检测线更低，更接近于倒“S”型曲线。

实施例6回收率，精密度测定

在空白猪肉样品中加入莱克多巴胺，配制成1μg/kg，2μg/kg，4μg/kg三个浓度的添加水平，每个浓度做三个平行，然后按照第一种前处理方法处理后SPR生物传感器检测。结果见表1，由结果我们可以看出回收率都大于80％，并且三种浓度的精密度RSD％都小于10％，说明本方法较稳定，适合猪肉中莱克多巴胺的检测。见表1。

表1空白猪肉中的莱克多巴胺添加回收率实验(n＝5)

Claims

1.一种检测猪肉中莱克多巴胺的生物传感器方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)猪肉样品的前处理

称取匀质好的猪肉样品，加入提取液，涡旋震荡，调PH为1.0，离心过滤后，滤液调PH到11，然后加入萃取液，震荡混匀，离心后移取上清液，重复萃取一次，合并上清液，氮气吹干后，用复溶液溶解后超声混匀，离心，过滤膜后，待生物传感器检测；所述提取液为高氯酸；所述萃取液为乙酸乙酯；所述复溶液为体积比1∶9的甲醇∶PBS缓冲液；

(2)莱克多巴胺衍生物的固定

首先将N-乙基-N′-(二甲氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合后，对修饰有羧甲基化葡聚糖的芯片表面进行活化，然后将莱克多巴胺衍生物用醋酸缓冲溶液稀释后注入芯片表面，反应一段时间后，最后用乙醇胺灭活多余的酯键；

(3)猪肉样品中莱克多巴胺的残留检测

将步骤(1)制备的样品溶液与含有莱克多巴胺抗体的PBS缓冲液混合后，注入芯片表面反应，记录反应前后响应值的变化，然后通入HCl对芯片进行再生，每次通入样品前后都要通入含1％甲醇的PBS缓冲液；

(4)分析检测结果

用含1％甲醇的PBS缓冲液逐级稀释标准中间液，配制成一组工作标准溶液，其中抗体的最终稀释度为1∶200，莱克多巴胺的终浓度为0、1、2、5、10、20ng/mL，然后按随机顺序通入芯片，以每个浓度下的标准溶液所得的相对响应值为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标，建立标准校正曲线，在检测实际样品时，根据样品所得的相对响应值，然后从标准曲线中读出样品中药物含量。

2.如权利要求1所述的一种检测猪肉中莱克多巴胺的生物传感器方法，其特征是，所述步骤(1)为：称取5g匀质好的猪肉样品，加入20mL 0.1M的高氯酸，涡旋震荡3min，调pH为1.0，以4000rpm离心10min，过滤后，滤液用1M的氢氧化钠调pH到11，然后加入10mL乙酸乙酯，震荡混匀，以4000rpm离心10min离心后移取上清液，再在残余物中加入10mL乙酸乙酯，重复萃取一次，合并上清液，在40℃水浴下氮气吹干后，复溶于250μL的体积比为1∶9的甲醇∶PBS溶液中，超声混匀30s，以10000rpm离心10min，离心后，取上清液过0.22μm滤膜后，取25μL供生物传感器检测。

3.如权利要求1或2所述的一种检测猪肉中莱克多巴胺的生物传感器方法，其特征是，所述步骤(2)莱克多巴胺衍生物的固定为：

a活化：将体积比1∶1的0.4M N-乙基-N′-(二甲氨基丙基)碳二亚胺和0.1M N-羟基琥珀酰亚胺混合后，以10μL/min的流速对修饰有羧甲基化葡聚糖的芯片表面进行活化，活化时间为7min；

b固定：将莱克多巴胺衍生物用pH＝4.6的0.2M的醋酸缓冲溶液稀释100倍，然后以10μL/min的流速注入芯片表面反应10min；

c灭活：用1M乙醇胺以10μL/min的流速注入7min，灭活多余的酯键。

4.如权利要求3所述的一种检测猪肉中莱克多巴胺的生物传感器方法，其特征是，所述步骤(3)猪肉样品中莱克多巴胺的残留检测为：将样品提取液与含有莱克多巴胺抗体的PBS缓冲液按照体积比1∶9的比例混合，其中莱克多巴胺抗体的最终稀释度为1∶200，以10μL/min的流速注入芯片表面反应10min，记录反应前后响应值的变化，然后以20μL/min流速通入0.1M HCl再生3min，每次通入样品前后都要通入含1％甲醇的PBS缓冲液。

5.如权利要求1或4所述的一种检测猪肉中莱克多巴胺的生物传感器方法，其特征是，所述步骤(4)标准中间液的配制为：首先称取莱克多巴胺标准品10mg，先用甲醇溶解为10mg/mL的标准储备液于-20℃保存，然后用pH＝7.4的PBS缓冲液稀释到1μg/mL的中间液，密封保存于4℃。