KR101578960B1 - 당쇄 표지 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생체 시료로부터 당쇄를 정제하여 표지하는 공정을 간편하게 실시하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 하고, 생체 시료 중에 함유된 당쇄를 표지화하는 방법으로서, (a) 생체 시료로부터 당쇄를 특이적으로 포착하는 물질인 당쇄 포착 물질에 당쇄를 포착하는 공정, (b) 당쇄를 포착한 당쇄 포착 물질을 세정하는 공정, (c) 당쇄 포착 물질로부터 당쇄를 유리시키는 공정, (d) 유리된 당쇄를 표지화하는 공정을 포함하고 (a), (b), (c), (d) 공정을 동일한 반응 용기 내에서 연속하여 실시하는 것을 특징으로 하는 당쇄 표지 방법이다.

Description

당쇄 표지 방법{METHOD OF LABELING SUGAR CHAIN}
본 발명은 생체 시료 중에 포함되는 당쇄를 효율적으로 정제, 표지하기 위한 방법에 관한 것이다.
당쇄, 당단백, 당펩티드, 펩티드, 올리고펩티드, 단백, 핵산, 지질 등이라고하는 생체 고분자는 의학, 세포 공학, 장기 공학 등의 생명공학 분야에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있어, 이들 물질에 의한 생체 반응의 제어 기구를 밝히는 것은 생명공학 분야의 발전으로 이어지게 된다.
이 중에서도 당쇄는 매우 다양성이 풍부하여 천연에 존재하는 생물이 갖는 여러가지 기능에 관여하는 물질이다. 당쇄는 생체 내에서 단백질이나 지질 등에 결합한 복합 당질로서 존재하는 일이 많아, 생체 내의 중요한 구성 성분의 하나이다. 생체 내의 당쇄는 세포간 정보 전달, 단백질의 기능이나 상호 작용의 조정 등에 깊이 관련되어 있는 것이 밝혀지고 있다.
또한, 당쇄란 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 자일로스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 시알산 등의 단당 및 이들의 유도체가 글리코시드 결합에 의해 쇄상(鎖狀)으로 결합한 분자의 총칭이다.
예를 들면, 당쇄를 갖는 생체 고분자로는 세포의 안정화에 기여하는 식물세포 세포벽의 프로테오글리칸, 세포의 분화, 증식, 접착, 이동 등에 영향을 주는 당지질 및 세포간 상호 작용이나 세포 인식에 관여하고 있는 당단백질 등을 들 수 있다. 이들 생체 고분자에 포함되는 당쇄가 이 생체 고분자와 서로 기능을 대행, 보조, 증폭, 조절 혹은 서로 저해하면서 고도하고 정밀한 생체 반응을 제어하는 기구가 점차 밝혀지고 있다. 또한 이와 같은 당쇄와 세포의 분화 증식, 세포 접착, 면역 및 세포 암화의 관계가 명확하게 되면, 이 당쇄 공학과 의학, 세포 공학 혹은 장기 공학을 밀접하게 관련시켜 새로운 전개를 도모하는 것을 기대할 수 있다.
또, 당단백질성 의약품에서는 그 당쇄가 생물 활성 발현 등에 중요한 역할을 담당하고 있는 경우가 많다. 따라서, 당단백질성 의약품 품질관리의 매개변수로서 당쇄의 평가는 극히 중요하고, 특히 항체 의약품에 대해서는 그 당쇄 구조가 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC 활성)을 좌우한다는 보고가 되어 있어 당쇄 구조 해석의 중요성이 높아지고 있다.
이 때문에 근래 당쇄 구조를 신속, 간편하게 또한 고정밀도로 해석하는 방법이 요구되게 되어, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC), 핵자기 공명법, 모세관 전기 영동법(CE법), 질량분석법, 렉틴 어레이법 등의 다종다양한 방법에 의해 당쇄 해석이 실시되고 있다.
이들 여러가지 수법을 이용하여 당쇄를 해석하기 위해서는 미리 생체 시료 중에 포함되는 단백질, 펩티드, 지질, 핵산 등과 당쇄를 분리·정제하는 것이 필요하다. 또, HPLC나 CE는 분리가 좋은 점, 재현성이 좋은 점, 정량성, 감도가 높은 점 등이라고 하는 점으로부터 널리 이용되는 수법이지만, 높은 감도를 얻기 위해서 당쇄의 환원 말단을 환원 아미노화법 등에 의해 표지화할 필요가 있다. 그렇지만, 이들 당쇄의 정제나 표지화는 시간과 공정이 소요되고, 한번에 다량의 시료를 조정하는 것은 곤란하다.
상술한 과제를 해결하는 기술로서 예를 들면 특허 문헌 1에 기재된 특정 당쇄 포착 물질을 이용하여 실현되는 시료 조정 방법을 들 수 있다.
특허 문헌 1: 국제 공개 제2008/018170호 팜플렛
상기에서도 기술한 바와 같이 당쇄의 분리·정제 및 표지화는 시간과 공정을 필요로 한다. 당쇄의 분리·정제에는, 예를 들면 이온 교환 수지, 역상 크로마토그래피, 활성탄, 겔 여과 크로마토그래피 등의 수법이 이용되지만, 이들 분리 수단은 당을 특이적으로 인식하는 방법은 아니기 때문에 협잡물(펩티드, 단백질 등)의 혼입을 피하지 못하고, 또 당쇄의 구조에 의해 회수율에 차이가 생기는 경우가 많다. 또, 당쇄를 표지하려면 정제 공정 후 얻어진 당쇄 시료를 완전하게 건조시킬 필요가 있는 등 정제로부터 표지화까지 일련의 조작에 며칠을 필요로 하여 버린다.
본 발명의 목적은 생체 시료로부터 당쇄를 정제하여 표지하는 공정을 간편하게 실시하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 이하와 같다.
(1) 생체 시료 중에 함유된 당쇄를 표지화하는 방법으로서,
(a) 생체 시료로부터 당쇄를 특이적으로 포착하는 물질인 당쇄 포착 물질에 당쇄를 포착하는 공정,
(c) 당쇄 포착 물질로부터 당쇄를 유리시키는 공정,
(d) 유리된 당쇄를 표지화하는 공정을 포함하고 (a), (c), (d) 공정을 동일한 반응 용기 내에서 연속하여 실시하는 것을 특징으로 하는 당쇄 표지 방법.
(2) 생체 시료 중에 함유된 당쇄를 표지화하는 방법으로서,
(a) 생체 시료로부터 당쇄를 특이적으로 포착하는 물질인 당쇄 포착 물질에 당쇄를 포착하는 공정,
(b) 당쇄를 포착한 당쇄 포착 물질을 세정하는 공정,
(c) 당쇄 포착 물질로부터 당쇄를 유리시키는 공정,
(d) 유리된 당쇄를 표지화하는 공정을 포함하고 (a), (b), (c), (d) 공정을 동일한 반응 용기 내에서 연속하여 실시하는 것을 특징으로 하는 당쇄 표지 방법.
(3) (a) 공정에 있어서, 당쇄 포착 물질이 당쇄의 알데히드기와 특이적으로 반응하는 관능기를 갖는 담체인 (1) 또는 (2)에 기재된 당쇄 표지 방법.
(4) 상기 관능기가 히드라지드기 또는 아미노옥시기인 (3)에 기재된 당쇄 표지 방법.
(5) 상기 당쇄 포착 물질이 하기 (식 1)로 나타내는 가교형 폴리머 구조를 갖는 것인 (4)에 기재된 당쇄 표지 방법.
Figure 112010076169868-pct00001
(R1, R2는 -O-, -S-, -NH-, -CO-, - CONH-로 중단되어도 되는 탄소수 1~20인 탄화수소쇄, R3, R4, R5는 H, CH3 또는 탄소수 2~5인 탄화수소쇄를 나타낸다. m, n은 모노머 단위 수를 나타낸다.)
(6) 상기 당쇄 포착 물질이 하기 (식 2)로 나타내는 가교형 폴리머 구조를 갖는 것인 (5)에 기재된 당쇄 표지 방법.
Figure 112010076169868-pct00002
(m, n은 모노머 단위 수를 나타낸다.)
(7) (c) 공정에 있어서, 당쇄 포착 물질에 산 처리를 실시하는 공정을 갖는 (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 당쇄 표지 방법.
(8) (a) 및 (c) 공정에 있어서, 반응 용매를 증발시키는 공정을 갖는 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 당쇄 표지 방법.
(9) (d) 공정에 있어서, 당쇄의 표지화를 아미노기를 갖는 화합물에 의해 실시하는 (1)~(8) 중 어느 하나에 기재된 당쇄 표지 방법.
(10) 상기 아미노기를 갖는 화합물에 의한 당쇄의 표지화가 환원적 아미노화 반응에 의해 이루어지는 것인 (9)에 기재된 당쇄 표지 방법.
(11) 상기 아미노기를 갖는 화합물이 자외 가시 흡수 특성 또는 형광 특성을 갖는 것인 (9) 또는 (10)에 기재된 당쇄 표지 방법.
(12) 상기 아미노기를 갖는 화합물이
8-아미노피렌-1,3,6-트리술포네이트, 8-아미노나프탈렌-1,3,6-트리술포네이트, 7-아미노-1,3-나프탈렌디술폰산, 2-아미노-9(10H)-아크리돈, 5-아미노플루오레세인, 단실에틸렌디아민, 2-아미노피리딘, 7-아미노-4-메틸쿠마린, 2-아미노벤즈아미드, 2-아미노벤조산, 3-아미노벤조산, 7-아미노-1-나프톨, 3-(아세틸아미노)-6-아미노아크리딘, 2-아미노-6-시아노에틸피리딘, 에틸 p-아미노벤조에이트, p-아미노벤조니트릴 및 7-아미노나프탈렌-1,3-디술폰산으로부터 선택되는 적어도 하나인 (9)~(11) 중 어느 하나에 기재된 당쇄 표지 방법.
(13) (1)~(12) 중 어느 하나에 기재된 당쇄 표지 방법에 의해 표지화된 당쇄를 검출하는 공정을 포함하는 당쇄의 검출 방법.
(14) (1)~(12) 중 어느 하나에 기재된 당쇄 표지 방법에 의해 표지화된 당쇄를 분취하는 공정을 포함하는 당쇄의 분취방법.
본 발명의 당쇄 표지 방법에 의하면, 생체 시료 중에 함유된 당쇄 등의 표적 화합물의 정제 및 표지화를 동일한 반응 용기 내에서 실시하여, 표적 화합물을 간편하게 표지하는 것이 가능해진다. 또, HPLC나 CE 등의 분석에 일반적으로 이용되는 아미노 화합물에 의한 표지도 간편하게 실시하는 것이 가능해진다.
상술한 목적 및 그 외의 목적, 특징 및 이점은 이하에 기술하는 바람직한 실시의 형태 및 그에 부수하는 이하의 도면에 의해 더욱 분명해진다.
도 1은 실험예 1에서 얻어진 2-AB 표지 소 유래 페투인(bovine fetuin) 당쇄를 고속 액체 크로마토그래피에 의해 측정한 결과를 나타내는 차트 도면이다.
도 2는 실험예 2에서 얻어진 2-AB 표지 소 혈청 유래 IgG 당쇄를 고속 액체 크로마토그래피에 의해 측정한 결과를 나타내는 차트 도면이다.
도 3은 실험예 3에서 얻어진 2-AB 표지 소 유래 페투인 당쇄를 고속 액체 크로마토그래피에 의해 측정한 결과를 나타내는 차트 도면이다.
본 발명은 생체 시료 중에 함유된 당쇄를 표지화하는 방법으로서,
(a) 생체 시료로부터 당쇄를 특이적으로 포착하는 물질인 당쇄 포착 물질에 당쇄를 포착하는 공정,
(b) 당쇄를 포착한 당쇄 포착 물질을 세정하는 공정,
(c) 당쇄 포착 물질로부터 당쇄를 유리시키는 공정,
(d) 유리된 당쇄를 표지화하는 공정을 포함하고 (a), (b), (c), (d) 공정을 동일한 반응 용기 내에서 연속하여 실시하는 당쇄 표지 방법이다.
(a) 공정에 있어서, 당쇄를 특이적으로 포착하는 물질은 당쇄의 알데히드기와 반응하는 관능기를 가지고 있는 것이 바람직하다. 관능기로는 히드라지드기 또는 옥실아미노기인 것이 보다 바람직하다.
이와 같은 당쇄 포착 물질로는 하기 (식 1) 또는 (식 2)로 나타내는 구조를 갖는 가교형 폴리머를 담체로서 이용하는 것이 바람직하다.
Figure 112010076169868-pct00003
(R1, R2는 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH-로 중단되어도 되는 탄소수 1~20인 탄화수소쇄, R3, R4, R5는 H, CH3 또는 탄소수 2~5인 탄화수소쇄를 나타낸다. m, n은 모노머 단위 수를 나타낸다.)
R1은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH-로 중단되어도 되는 탄소수 1~20인 탄화수소쇄를 나타내고, 예를 들면 하기의 것을 들 수 있다. 또한 식 중 a, b, d는 1에서 5인 정수를 나타내고, c는 1에서 10인 정수를 나타낸다.
Figure 112010076169868-pct00004
R2는 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH-로 중단되어도 되는 탄소수 1~20인 탄화수소쇄를 나타내고, 예를 들면 하기의 것을 들 수 있다. 하기 식 중 e, f는 1에서 5인 정수를 나타내고, g는 1에서 10인 정수를 나타낸다.
Figure 112010076169868-pct00005
R3, R4, R5는 각각 동일해도 달라도 되고, H, CH3 또는 탄소수 2~5인 탄화수소쇄를 나타내고, 예를 들면 하기의 것을 들 수 있다. 하기 식 중 h는 1에서 4인 정수를 나타낸다.
Figure 112010076169868-pct00006
또, 이와 같은 (식 1) 중 특히 바람직한 물질 A로는 하기 (식 2)로 나타내는 가교형 폴리머 구조를 갖는 것을 들 수 있다.
Figure 112010076169868-pct00007
(m, n은 모노머 단위 수를 나타낸다.)
그 외 시판하는 히드라지드기 함유 가교 입자, 예를 들면, 아피겔 Hz(BIO-RAD, 153-6047), CarboLink(TM) Coupling Gel(PIERCE, 20391), UltraLink(R) Hydrazide Gel(PIERCE, 53149) 등을 이용해도 된다.
또, 당쇄 포착 물질로서 하기 (식 5) 또는 (식 6)으로 나타내는 구조를 갖는 가교형 폴리머를 담체로서 이용할 수도 있다.
Figure 112010076169868-pct00008
(R1, R2는 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH-로 중단되어도 되는 탄소수 1~20인 탄화수소쇄, R3, R4, R5는 H, CH3 또는 탄소수 2~5인 탄화수소쇄를 나타낸다. m, n은 모노머 단위 수를 나타낸다.). 또, R1으로부터 R5의 구체적인 예로는 (식 1)에서의 설명에서 예로 들었던 것과 동일한 것을 들 수 있다.
또한 이와 같은 (식 5)로 나타낸 폴리머 입자에 있어서, 하기 (식 6)으로 나타내는 구조를 갖는 폴리머 입자를 매우 적합하게 사용할 수도 있다.
Figure 112010076169868-pct00009
(m, n은 모노머 단위 수를 나타낸다.)
이들 당쇄 포착 물질 중 히드라지드기를 함유하는 물질을 매우 적합하게 사용할 수 있다.
또, 당쇄와 당쇄 포착 물질을 반응시키는 반응계에 있어서 pH가 산성 조건인 것이 바람직하고, 바람직하게는 2~9, 보다 바람직하게는 2~7이고, 더욱 바람직하게는 2~6이다. 반응 온도에 관해서는 4~90℃가 바람직하고, 바람직하게는 25~90℃이고, 더욱 바람직하게는 40~90℃이다. 반응 시간은 10분간~24시간, 바람직하게는 10분간~8시간, 보다 바람직하게는 10분간~2시간이다. 반응은 당쇄의 포착 반응을 효율적으로 실시하는 관점으로부터 개방계에서 실시하여 용매를 완전하게 증발시키는 것이 바람직하다.
이어서, (b) 공정에서는 (a) 공정에서 당쇄가 포착된 당쇄 포착 물질을 세정하고, 당쇄 포착 물질에 포착되지 않았던 당쇄, 다른 생체 시료 등을 제거한다. 당쇄 포착 물질의 세정에 이용되는 용액으로는 구아니딘이나 계면활성제 수용액과 같은 단백 변성제 용액, 메탄올, 에탄올 등의 알코올류, 물 및 수성 완충액 등이 사용된다. 여기서, 세정에 수용액이 이용되는 경우 이 수용액의 pH는 중성 부근인 것이 바람직하고, 그 pH는 4~10, 보다 바람직하게는 6~8이다.
또한, (b)의 세정 공정은 당초 생체 시료의 상태, 예를 들면 당쇄 이외의 물질의 혼재 정도에 따라서는 실시하지 않아도 상관없다.
(c) 공정에서는 당쇄가 포착된 당쇄 포착 물질로부터 당쇄를 유리시킨다, 즉 당쇄를 당쇄 포착 물질로부터 잘라내는 반응을 실시한다. 이 공정에서는 산과 유기용매의 혼합 용매 혹은 산과 물과 유기용매의 혼합 용매에서 당쇄 포착 물질에 산 처리를 실시하는 것이 바람직하다. 산과 물과 유기용매의 혼합 용매인 경우 물의 함유율은 바람직하게는 0.1%~90%, 보다 바람직하게는 0.1%~80%, 더욱 바람직하게는 0.1%~50%이다. 물 대신에 수성 완충액을 함유해도 된다. 완충액의 농도는 바람직하게는 0.1mM~1M, 보다 바람직하게는 0.1mM~500mM, 더욱 바람직하게는 1mM~100mM이다. 반응 용액의 pH는 바람직하게는 2~9, 보다 바람직하게는 2~7이고, 더욱 바람직하게는 2~6이다. 사용하는 산은 예를 들면 아세트산, 포름산, 트리플루오로아세트산, 염산, 시트르산, 인산, 황산이 바람직하고, 보다 바람직하게는 아세트산, 포름산, 트리플루오로아세트산, 인산, 더욱 바람직하게는 아세트산, 트리플루오로아세트산이다. 반응 온도에 관해서는 4~90℃가 바람직하고, 바람직하게는 25~90℃이고, 더욱 바람직하게는 40~90℃이다. 반응 시간은 10분간~24시간, 바람직하게는 10분간~8시간, 보다 바람직하게는 10분간~3시간이다. 반응은 당쇄를 유리시키는 반응을 효율적으로 실시하는 관점으로부터 개방계에서 실시하여 용매를 완전하게 증발시키는 것이 바람직하다.
약산성으로부터 중성 부근에서 당쇄를 잘라내는 반응을 실시할 수 있기 때문에 종래의 강산성 처리, 예를 들어 10% 트리플루오로아세트산 처리에 의해 잘라낸 것과 같은 강산의 존재하에서 잘라내는 반응에 비해, 시알산 잔기의 탈리 등 당쇄의 가수분해 등을 일으키는 것을 억제할 수 있게 된다.
(d) 공정에서는 (c) 공정에서 얻어진 유리 당쇄를 표지화한다. 표지화 방법은 아미노기를 갖는 화합물에 의해 예를 들면 환원적 아미노화 반응을 이용하여 임의의 아미노 화합물로 표지화하는 반응인 것이 바람직하다. 반응계에 있어서 pH가 산성으로부터 중성의 조건인 것이 바람직하고, 바람직하게는 2~9, 보다 바람직하게는 2~8이고, 더욱 바람직하게는 2~7이다. 반응 온도에 관해서는 4~90℃가 바람직하고, 바람직하게는 25~90℃이고, 더욱 바람직하게는 40~90℃이다. 아미노 화합물의 농도는 1mM~10M인 것이 바람직하고, 환원제의 농도는 1mM~10M인 것이 바람직하다. 반응 시간은 10분간~24시간, 바람직하게는 10분간~8시간, 보다 바람직하게는 10분간~3시간이다.
여기서, 아미노기를 갖는 화합물은 자외 가시 흡수 특성 또는 형광 특성을 갖는 것이 바람직하고, 예를 들면 하기의 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것이 바람직하다.
8-아미노피렌-1,3,6-트리술포네이트, 8-아미노나프탈렌-1,3,6-트리술포네이트, 7-아미노-1,3-나프탈렌디술폰산, 2-아미노-9(10H)-아크리돈, 5-아미노플루오레세인, 단실에틸렌디아민, 2-아미노피리딘, 7-아미노-4-메틸쿠마린, 2-아미노벤즈아미드, 2-아미노벤조산, 3-아미노벤조산, 7-아미노-1-나프톨, 3-(아세틸아미노)-6-아미노아크리딘, 2-아미노-6-시아노에틸피리딘, 에틸 p-아미노벤조에이트, p-아미노벤조니트릴 및 7-아미노나프탈렌-1,3-디술폰산.
특히, 아미노 화합물이 2-아미노벤즈아미드인 경우 pH가 산성으로부터 중성인 조건에서 바람직하게는 2~9, 보다 바람직하게는 2~8이고, 더욱 바람직하게는 2~7이다. 반응 온도에 관해서는 4~90℃, 바람직하게는 30~90℃이고, 더욱 바람직하게는 40~80℃이다. 아미노 화합물의 농도는 1mM~10M, 바람직하게는 10mM~10M이고, 더욱 바람직하게는 100mM~1M이다. 환원제의 농도는 1mM~10M, 바람직하게는 10mM~10M, 더욱 바람직하게는 100mM~2M이다. 반응 시간은 10분간~24시간, 바람직하게는 10분간~8시간, 더욱 바람직하게는 1시간~3시간이다.
또, 환원제는 예를 들면 시아노 수소화 붕소나트륨, 메틸아민보란, 디메틸아민보란, 트리메틸아민보란, 피콜린보란, 피리딘보란 등이 사용 가능하지만, 시아노 수소화 붕소나트륨을 사용하는 것이 반응성의 면으로부터 고려하여 바람직하다.
(d) 공정 후 얻어지는 용액은 표지된 당쇄와 과잉량 가한 미반응 아미노 화합물, 환원제가 존재하기 때문에 이들 잉여 시약을 제거하는 공정을 실시하는 것이 바람직하다. 실리카 컬럼에 의한 제거, 겔 여과에 의한 제거, 이온 교환 수지에 의한 제거, 어느 방법을 이용해도 되지만 시알산의 이탈을 막기 위해서 사용하는 용매는 중성인 것이 바람직하다.
이상, 당쇄 표지 방법에 대해 설명했지만, 본 발명은 다른 측면으로부터 상기 당쇄 표지 방법에 의해 표지화된 당쇄를 검출하는 공정을 포함하는 당쇄의 검출 방법을 제공한다. 또, 추가로 다른 측면으로부터 상기 당쇄 표지 방법에 의해 표지화된 당쇄를 분취하는 공정을 포함하는 당쇄의 분취방법을 제공한다.
특허 문헌 1에 기재된 당쇄 포착 기술에서는 포착한 당쇄의 표지화에 있어서, 과잉 시약을 가해 실시하는 교환 반응에 의한 표지 기술을 이용하고 있는데 비해 본 발명에서는 환원 아미노화법에 의한 표지 기술을 이용하고 있다. 환원 아미노화법은 일반적으로 실시되는 반응이지만, 통상은 당쇄의 정제, 탈염 및 건고에 시간이 걸린다. 본 발명에서는 담체로의 포착, 정제를 조합함으로써 환원 아미노화법을 간편하게 실시하는 것을 가능하게 하고 있다. 환원 아미노화법에 의한 표지는 특허 문헌 1에 기재된 바와 같은 표지화 기술과 비교하여 (1) 2-아미노벤즈아미드나 2-아미노피리딘과 같은 일반적으로 사용되어 온 표지 화합물에 적응 가능한 것으로부터 그들 표지를 이용하여 얻어진 과거의 식견을 참고로 하는 것이 가능하고, (2) 당쇄와 표지 화합물의 결합이 보다 안정하기 때문에 장기 보존이 가능하다고 하는 점에서 바람직하다.
실시예
이하, 본 발명을 이하의 실험예로 이루어진 실시예에 의해 설명한다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 실시예에서는 표준 사례로서 당단백질인 소 혈청 유래 페투인 및 소 혈청 유래 IgG의 당쇄를 분석 시료로 하여 조제하는 방법 및 그 측정 방법을 나타낸다.
(실험예 1)
(생체 시료의 예비 처리)
소 혈청 유래 페투인 1mg을 100mM 중탄산암모늄 50㎕에 용해시킨 후 120mM DTT(디티오트레이톨)를 5㎕ 가해 60℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 종료후 123mM IAA(요오드아세트아미드) 10㎕를 가해 차광하, 실온에서 1시간 반응시켰다. 이어서 400U의 트립신에 의해 프로테아제 처리를 하여, 단백질 부분을 펩티드 단편화하였다. 반응 용액을 90℃에서 5분 처리한 후 5U의 글리코시다제 F에 의해 처리를 실시하여 당쇄를 펩티드로부터 유리시켜 예비 처리를 끝낸 생체 시료를 얻었다.
(당쇄 포착 공정 (a), 세정 공정 (b))
당쇄 포착용 담체인 히드라지드기를 갖는 비드 5mg(BlotGlyco(R), 스미토모 베이클라이트 주식회사제, BS-45601S, 식 2의 구조를 갖고, 모노머 투입비가 m:n=20:1인 폴리머)가 들어간 일회용 컬럼(disposable column)에 예비 처리를 끝낸 생체 시료 현탁물 20㎕ 및 180㎕의 2% 아세트산/아세토니트릴 용액을 가해 80℃에서 1시간 반응시켰다. 반응은 개방계에서 실시하여, 용매가 완전하게 증발하여 비드가 건고한 상태인 것을 눈으로 봐서 확인하였다. 이어서, 구아니딘 용액, 물, 메탄올, 트리에틸아민 용액에서 비드를 세정한 후 10% 무수 아세트산/메탄올을 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시켜 미반응 히드라지드기를 캡핑하였다. 캡핑한 후 메탄올, 염산 수용액, 물로 비드를 세정하였다.
(당쇄 유리 공정 (c))
비드가 들어간 일회용 컬럼에 초순수 20㎕ 및 2% 아세트산/아세토니트릴 용액 180㎕를 가해 60℃에서 2시간 반응시켰다. 반응은 개방계에서 실시하여, 용매가 완전하게 증발하여 비드가 건고한 상태인 것을 눈으로 봐서 확인하였다.
(표지화 공정 (d))
비드가 들어간 일회용 컬럼에 2-아미노벤즈아미드(2-AB) 및 시아노 수소화 붕소나트륨의 마지막 농도가 각각 0.35M, 1M로 되도록 30% 아세트산/DMSO 혼합 용매에 용해시켜 조정한 용액 50㎕를 첨가하여, 60℃에서 2시간 반응시켰다.
상기 당쇄 포착 공정 (a), 세정 공정 (b), 당쇄 유리 공정 (c) 및 표지화 공정 (d)는 동일한 용기인 일회용 컬럼 내에서 실시하였다.
(잉여 시약 제거 공정)
반응 용액 50㎕를 회수하고, 아세토니트릴로 10배로 희석한 후 실리카 겔(Iatrobeads, 6RS-8060, 미츠비시화학 이아트론제)을 채운 컬럼에 첨가하여 실리카 겔에 표지 당쇄를 흡착시켰다. 아세토니트릴, 아세토니트릴/물 혼합 용액(95:5)으로 컬럼을 세정한 후 초순수 50㎕에서 표지 당쇄를 회수하였다.
(표지화 당쇄의 검출)
얻어진 표지 당쇄를 HPLC로 측정하였다. 아미노 컬럼(Shodex Asahipak NH2P-50)을 이용하여 여기 파장 330nm, 형광 파장 420nm에서 측정하였다. 도 1에 측정 결과를 나타낸다. 2AB에 의해 표지화된 당쇄가 검출되었다.
또한, 도 1에 있어서 1은 1 시알산 함유 당쇄 유래 피크를 나타내고, 2는 2 시알산 함유 당쇄 유래 피크를 나타내며, 3은 3 시알산 함유 당쇄 유래 피크를 나타내고, 4는 4 시알산 함유 당쇄 유래 피크를 나타낸다.
(실험예 2)
소 혈청 유래 페투인 대신에 소 혈청 유래 IgG를 이용한 것 이외에는 실험예 1과 동일하게 실시하였다. 도 2에 HPLC의 측정 결과를 나타낸다. 2AB에 의해 표지화된 당쇄가 검출되었다.
또한, 도 2에 있어서 5는 중성 당 유래 피크를 나타내고, 6은 산성 당쇄 유래 피크를 나타낸다.
(실험예 3)
당쇄 포착용 담체인 히드라지드기를 갖는 비드로서 아피겔 Hz(BIO-RAD, 153-6047)를 이용한 것 이외에는 실험예 1과 동일하게 실시하였다. 아피겔 Hz는 50㎕ 사용하였다. 도 3에 HPLC의 측정 결과를 나타낸다. 도면에서 실선은 아피겔 Hz 사용인 경우, 파선은 실험예 1의 BlotGlyco(R) 사용인 경우를 나타낸다. 아피겔 Hz 사용인 경우도 BlotGlyco(R)를 이용했을 경우와 비교하면 강도가 약해지지만, 2AB에 의해 표지화된 당쇄가 검출되었다.

Claims (14)

  1. 생체 시료 중에 함유된 당쇄를 표지화하는 방법으로서,
    (a) 생체 시료로부터 당쇄를 특이적으로 포착하는 물질인 당쇄 포착 물질에 당쇄를 포착하는 공정,
    (c) 당쇄 포착 물질로부터 당쇄를 유리시키는 공정,
    (d) 유리된 당쇄를 표지화하는 공정을 포함하고,
    상기 (d) 공정에 있어서, 상기 당쇄의 표지화가 아미노기를 갖는 화합물에 의한 환원적 아미노화 반응에 의해 이루어지며,
    상기 (a), (c), (d) 공정을 동일한 반응 용기 내에서 연속하여 실시하는 것을 특징으로 하는 당쇄 표지 방법.
  2. 생체 시료 중에 함유된 당쇄를 표지화하는 방법으로서,
    (a) 생체 시료로부터 당쇄를 특이적으로 포착하는 물질인 당쇄 포착 물질에 당쇄를 포착하는 공정,
    (b) 당쇄를 포착한 당쇄 포착 물질을 세정하는 공정,
    (c) 당쇄 포착 물질로부터 당쇄를 유리시키는 공정,
    (d) 유리된 당쇄를 표지화하는 공정을 포함하고,
    상기 (d) 공정에 있어서, 상기 당쇄의 표지화가 아미노기를 갖는 화합물에 의한 환원적 아미노화 반응에 의해 이루어지며,
    상기 (a), (b), (c), (d) 공정을 동일한 반응 용기 내에서 연속하여 실시하는 것을 특징으로 하는 당쇄 표지 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    (a) 공정에 있어서, 당쇄 포착 물질이 당쇄의 알데히드기와 특이적으로 반응하는 관능기를 갖는 담체인 당쇄 표지 방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 관능기가 히드라지드기 또는 아미노옥시기인 당쇄 표지 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 당쇄 포착 물질이 하기 (식 1)로 나타내는 가교형 폴리머 구조를 갖는 것인 당쇄 표지 방법.
    Figure 112010076169868-pct00010

    (R1, R2는 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH-로 중단되어도 되는 탄소수 1~20인 탄화수소쇄, R3, R4, R5는 H, CH3 또는 탄소수 2~5인 탄화수소쇄를 나타낸다. m, n은 모노머 단위 수를 나타낸다.)
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 당쇄 포착 물질이 하기 (식 2)로 나타내는 가교형 폴리머 구조를 갖는 것인 당쇄 표지 방법.
    Figure 112010076169868-pct00011

    (m, n은 모노머 단위 수를 나타낸다.)
  7. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    (c) 공정에 있어서, 당쇄 포착 물질에 산 처리를 실시하는 공정을 갖는 당쇄 표지 방법.
  8. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    (a) 및 (c) 공정에 있어서, 반응 용매를 증발시키는 공정을 갖는 당쇄 표지 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 아미노기를 갖는 화합물이 자외 가시 흡수 특성 또는 형광 특성을 갖는 것인 당쇄 표지 방법.
  12. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 아미노기를 갖는 화합물이 8-아미노피렌-1,3,6-트리술포네이트, 8-아미노나프탈렌-1,3,6-트리술포네이트, 7-아미노-1,3-나프탈렌디술폰산, 2-아미노-9(10H)-아크리돈, 5-아미노플루오레세인, 단실에틸렌디아민, 2-아미노피리딘, 7-아미노-4-메틸쿠마린, 2-아미노벤즈아미드, 2-아미노벤조산, 3-아미노벤조산, 7-아미노-1-나프톨, 3-(아세틸아미노)-6-아미노아크리딘, 2-아미노-6-시아노에틸피리딘, 에틸 p-아미노벤조에이트, p-아미노벤조니트릴 및 7-아미노나프탈렌-1,3-디술폰산으로부터 선택되는 적어도 하나인 당쇄 표지 방법.
  13. 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 당쇄 표지 방법에 의해 표지화된 당쇄를 검출하는 공정을 포함하는 당쇄의 검출 방법.
  14. 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 당쇄 표지 방법에 의해 표지화된 당쇄를 분취하는 공정을 포함하는 당쇄의 분취방법.
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