CN111363055B - 以pvdf膜为载体准确提取糖链的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种以PVDF膜为载体准确提取糖链的方法，是以Direct Blue 71染色液对印迹有目的蛋白质的PVDF膜进行染色，使用甲醇进行脱色、激活，关键是在胰酶消化前采用聚乙烯醇溶液浸泡PVDF膜，实现对PVDF膜的亲水化处理，解决了酶蛋白吸附在膜表面而不能进入膜内部影响酶切或β‑游离反应效率的问题。聚乙烯醇溶液低廉且不会对糖链解析图谱产生干扰，无需经过反复洗涤将其去除，具有操作简单，省时省力、降低成本、提高提取效率等优点，可避免糖蛋白因反复洗涤而丢失，重复性好，提高了糖链提取准确率。本发明有效提高了检测灵敏度，可从仅40 ng糖蛋白中检测出与原液中完全相同数量的糖链。

Description

以PVDF膜为载体准确提取糖链的方法
技术领域
本发明涉及一种糖链提取方法，尤其是一种操作简单、重复性好，可有效提高准确率及灵敏度的以PVDF膜为载体准确提取糖链的方法。
背景技术
糖蛋白依据糖链结构(N-连接聚糖或O-连接聚糖)和糖基化位点的不同，主要分为N-糖蛋白和O-糖蛋白两大类，从糖蛋白上提取糖链必须先将目标糖蛋白纯化出来。糖蛋白多定位于细胞表面(属于膜蛋白)，水溶性差，其有效提取是糖组学糖链结构研究的瓶颈之一。以往常采用制备质膜，然后用CHAPS等去污剂释放或TritonX-114相分离、有机溶剂萃取等提取粗糖蛋白，然后经过透析、超滤、电泳和层析等方法对粗糖蛋白分离纯化，但是所得产物基本是混合蛋白的聚糖混合物，若要得到某单一蛋白质的糖链，就必须将目的糖蛋白有效地分离纯化出来。目前，经常使用IP方法从细胞或组织裂解液中分离出目的糖蛋白、抗体及一些其他非特异性作用蛋白的混合溶液，再将含有目的糖蛋白质的混合溶液进行PAGE电泳分离，然后将目的蛋白凝胶条带切下，在凝胶内进行酶解或酸水解后提取目的糖蛋白糖链，或者将被分离的蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上，再从PVDF膜上进行糖链提取，即以PVDF膜为载体提取糖链。
现有以PVDF膜为载体提取糖链的方法是使用凝胶将蛋白质进行梯度分离；将已梯度分离的蛋白质从凝胶印迹到PVDF膜；将印迹有目的蛋白质的PVDF膜进行染色；脱色经染色的PVDF膜；晾干脱色后的PVDF膜；用水清洗从PVDF膜剪下的载有目的蛋白质部位的PVDF膜碎片上灰尘；将PVDF膜碎片转移至EP管内；用甲醇等浸泡PVDF膜碎片；去除浸泡液，向PVDF膜碎片中加入NH4HC03溶液及胰酶溶液进行孵育；停止胰酶消化反应；根据目的糖链类型进行糖链释放反应：如进行N-糖链提取，往EP管内加入PNGase F酶进行孵育；若进行O-糖链提取，则先将灭活的胰酶溶液冻干，再向EP管内直接加入等体积的NaOH和NaBH4混合溶液进行孵育。由于PVDF膜本身疏水性极强(与蛋白质之间主要是通过疏水键结合)，很容易直接将酶蛋白吸附到膜表面，使酶蛋白不能进入膜内部，影响了酶切或β-游离反应效率。为了提高酶切或β-游离反应效率，已有在酶液消化前用聚乙烯吡咯烷酮40000(Polyvinylpyrrolidone，PVP-40)事先处理PVDF膜的相关报道，但由于PVP-40为胶状溶液，处理后需要对PVDF膜反复多次用清水洗涤，以去除PVP-40产生的污染物对糖链解析图谱产生干扰。反复洗涤不仅费时费力、提高操作成本、影响提取效率，而且还会使存量不多的糖蛋白丢失，重复性差，降低糖链提取准确率。另外，即使反复洗涤仍会残余PVP-40，难免出现干扰糖链解析图谱的现象。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简单、重复性好，可有效提高准确率及灵敏度的以PVDF膜为载体准确提取糖链的方法。
本发明的技术解决方案是：一种以PVDF膜为载体准确提取糖链的方法，依次按照如下步骤进行：
(1)使用凝胶将蛋白质进行梯度分离；
(2)将已梯度分离的蛋白质从凝胶印迹到PVDF膜上；
(3)将印迹有目的蛋白质的PVDF膜浸泡在Direct Blue 71染色液中进行染色；
(4)用甲醇脱色经Direct Blue 71染色的PVDF膜；
(5)晾干脱色后的PVDF膜；
(6)从PVDF膜剪下载有目的蛋白质部位的PVDF膜碎片并用纯水清洗；
(7)将PVDF膜碎片转移至EP管内；
(8)用甲醇浸泡PVDF膜碎片；
(9)去除甲醇，立即将PVDF膜碎片浸泡在聚乙烯醇溶液中，室温震荡15～25min，所述聚乙烯醇溶液是质量体积比浓度为0.25％的纯水溶液；
(10)去除PVDF膜碎片中的聚乙烯醇溶液；
(11)向PVDF膜碎片中加入NH4HC03溶液及胰酶溶液进行孵育；
(12)停止胰酶消化反应；
(13)根据目的糖链类型进行糖链释放反应。
本发明是以Direct Blue 71染色液对印迹有目的蛋白质的PVDF膜进行染色，使用甲醇进行脱色、激活，关键是在胰酶消化前采用聚乙烯醇溶液浸泡PVDF膜，实现对PVDF膜的亲水化处理，解决了酶蛋白吸附在膜表面而不能进入膜内部影响酶切或β-游离反应效率的问题。聚乙烯醇溶液价格低廉且不会对糖链解析图谱产生干扰，无需经过反复洗涤将其去除，具有操作简单，省时省力、降低成本、提高提取效率等优点，同时还可避免糖蛋白因反复洗涤而丢失的问题，重复性好，提高了糖链提取准确率。另外，本发明有效提高了检测灵敏度高，可从仅40ng糖蛋白中检测出所含多数糖链。
附图说明
图1是本发明实施例1的bovine fetuin DB-71染色图。
图2是本发明实施例1、对比例1及对比例2的bovine fetuin N-糖链质谱图。
图3是本发明实施例2、对比例3及对比例4的bovine fetuin O-糖链质谱图。
图4是本发明实施例3的transferrin DB-71染色图。
图5是本发明实施例3的transferrin和对比例5的N-糖链的质谱图。
具体实施方式
实施例1：
本发明的以PVDF膜为载体准确提取bovine fetuin N-糖链的方法，依次按照如下步骤进行：
(1)取bovine fetuin标准品配成5μg/μl原液，取1μl蛋白质原液使用凝胶进行梯度分离(SDS-PAGE)；
(2)将已梯度分离的蛋白质从凝胶印迹到PVDF膜上；
(3)将印迹有目的蛋白质的PVDF膜浸泡在Direct Blue 71染色液中进行染色，结果如图1所示；图1中可以看出100kDa上部有条带被染色，这说明蛋白质原液中混入了杂质蛋白；
(4)用甲醇(质量百分比浓度≥99.9％，Sigma生产)脱色经Direct Blue 71染色的PVDF膜；
(5)将脱色后的PVDF膜室温下放在滤纸上自然干燥2h；
(6)从PVDF膜上剪下载有目的蛋白质部位的膜碎片并用纯水清洗，以去除表面灰尘；
(7)将PVDF膜碎片转移至EP管内；
(8)用甲醇(质量百分比浓度≥99.9％，Sigma生产)浸泡PVDF膜碎片30s；
(9)去除甲醇，为防止甲醇挥发后导致膜碎片干燥应立即将PVDF膜碎片浸泡在20μl聚乙烯醇溶液中，室温震荡20min，聚乙烯醇溶液是质量体积比浓度为0.25％的纯水溶液；
(10)可通过离心方式，再用移液枪最小枪头将残余在EP管壁及PVDF膜碎片表面上的聚乙烯醇溶液清除干净；
(11)向PVDF膜碎片中加入NH4HC03溶液及胰蛋白酶，在37℃轻柔震荡16h；
(12)95℃，加热5min，停止胰酶消化反应；
(13)冷却至室温后加入1μl PNGase F酶，37℃轻柔震荡24h，向EP管中加入10μl1％ACOH，37℃轻柔震荡30min后超声2次，10min/次，将EP管内液体转移至MCX柱内，收集滤液，冻干后转移至衍生瓶内。
用50μl DMSO溶解衍生瓶内干燥的聚糖样品，加入50μl氢氧化钠及DMSO的悬浊液后，再加入50μl碘甲烷溶液，盖紧瓶盖后在室温下剧烈振荡衍生瓶以充分进行反应20min；于冰上将1ml 5％ACOH缓慢加入到反应混合物中结束全甲基化反应，然后将聚糖的衍生物通过Sep-Pak柱除盐，用1ml水反复洗涤几次后，用体积浓度为80％乙腈纯水溶液(750μl)洗脱全甲基化聚糖，冻干，加入20μl 50％乙腈(体积浓度)溶解后进行质谱检测，结果见图2C及表1。
对比例1与本发明实施例1基本相同，其区别是步骤(9)是去除甲醇，立即将PVDF膜碎片浸泡在20μl质量体积比浓度为1％的PVP-40(PVP-40in 50％甲醇)溶液中，室温震荡20min，用纯水清洗5遍。质谱检测结果见图2B及表1。
对比例2是采用1μl bovine fetuin原液加入NH4HC03溶液及胰蛋白酶，在37℃静置16h，95℃，加热5min，停止胰酶消化反应；冷却至室温后加入1μl PNGase F酶，37℃静置24h，向EP管中加入10μl 1％ACOH，37℃静置30min后，将EP管内液体转移至MCX柱内，收集滤液，冻干后转移至衍生瓶内，之后的提取N-糖链步骤同实施例1，其提取N-糖链的质谱检测结果见图2A及表1。
表1
Figure GDA0002489325250000041
表1中，solution为对比例2，PVP-40为对比例1，PVA为本发明实施例1，m/z值为单同位素质量数，“–”表示未检测到。
a)聚糖以全甲基化和[M+Na]+计算。
b)使用GlycoMod数据库检索确定单糖成分。单糖有：Hex,hexose；HexNAc,N-acetyl hexosamine；Fuc,fucose；NeuAc,N-acetyl neuraminic acid；NeuGc,N-glycolylneuraminic acid and Man,mannose。
从图2A、B、C可以看出，对比例2从fetuin原液中提取的聚糖峰度，多数都高于从膜中提取的聚糖峰度，主要是因为原液中混入的其他糖蛋白对聚糖峰度做出贡献。而从正确位置的膜条上无论是本发明实施例1还是对比例1，提取的N-聚糖糖型完全一致，说明本发明实施例1的方法是完全正确的。本发明实施例1与对比例1相比，对比例1的结果中缺少4,5,6,8号4种聚糖，而本发明实施例1提取的N-聚糖更为丰富，聚糖种类与对比例2相同，聚糖峰度高于对比例1。
实施例2：
本发明的以PVDF膜为载体准确提取bovine fetuin O-糖链的方法及对比例3的方法分别与实施例1和对比例1基本相同，区别是步骤(13)将灭活的胰酶溶液冻干，向冻干的样品中加入等体积NaOH和NaBH4混合溶液30μl进行β-游离反应，45℃孵育16h，然后向样品中加入10μl 1％ACOH中和成弱酸性后(PH值为5-6即可)进行超声2次，10min/次，将EP管内液体转移至MCX柱内，收集滤液，冻干后加入1％ACOH(甲醇溶解)，震荡离心，再冻干，重复两次。
将冻干样品转移至衍生瓶内，用50μl DMSO溶解衍生瓶内干燥的聚糖样品，加入50μl氢氧化钠与DMSO的悬浊液后，再加入50μl碘甲烷溶液，盖紧瓶盖后在室温下剧烈振荡衍生瓶以充分进行反应20min；于冰上将1ml 5％ACOH缓慢加入到反应混合物中结束全甲基化反应，然后将聚糖的衍生物通过Sep-Pak柱除盐，用1ml水反复洗涤几次后，用50％乙腈纯水溶液(750μl)洗脱全甲基化聚糖，冻干，加入20μl 50％乙腈溶解后进行质谱检测，结果分别见图3C、图3B及表2。
对比例4是采用1μl bovine fetuin原液加入NH4HC03溶液及胰蛋白酶，在37℃静置16h，95℃，加热5min，停止胰酶消化反应，将灭活的胰酶溶液冻干，向冻干的样品中加入等体积NaOH和NaBH4混合溶液30μl进行β-游离反应，45℃孵育16h。然后向样品中加入10μl1％ACOH中和成弱酸性(PH值为5-6即可)后将EP管内液体转移至MCX柱内，收集滤液，冻干后加入1％ACOH(甲醇溶解)，震荡离心，再冻干，重复两次。将冻干样品转移至衍生瓶内，之后的提取O-糖链步骤同实施例2，其提取O-糖链的质谱检测结果见图3A及表2。
表2
Figure GDA0002489325250000061
表2中solution为对比例4，PVP-40为对比例3，PVA为本发明实施例2，m/z值为单同位素质量数。
a)聚糖以全甲基化的醛醇和[M+Na]+计算。
b)使用GlycoMod数据库检索确定单糖成分，单糖有：Hex,hexose；HexNAc,N-acetyl hexosamine；NeuAc,N-acetyl neuraminic acid；NeuGc,N-glycolylneuraminicacid。
如图3及表2所示，本发明实施例2、对比例3、对比例4均出现4种聚糖，糖型也非常一致。但是在对比例3处理的结果中出现了一个信号较高的杂质峰(图3B中X为杂质峰)，说明虽然对比例3PVP-40浸泡处理后反复用水清洗，但仍有PVP40产生的污染物对糖链解析图谱产生干扰。
实施例3：
本发明以PVDF膜为载体准确提取转铁蛋白(transferrin，MW＝79.57kDa)N-糖链的方法基本步骤同实施例1，区别是(1)步骤，是转铁蛋白(transferrin，MW＝79.57kDa)标准品梯度稀释后(1.25μg、625ng、315ng、159ng、80ng和40ng)进行SDS-PAGE，凝胶上被分离的蛋白转移至PVDF膜后，用DB-71染色，结果如图4所示，(6)步骤是从PVDF膜上剪下40ng的条带PVDF膜碎片并用纯水清洗，以去除表面灰尘，(7)～(13)步骤均同本发明实施例1。
对比例5与对比例2的方法基本相同，区别是用40ng转铁蛋白原液进行N-糖链提取。本发明实施例3与对比例5所提取N-糖链质谱测定分析结果如图5A、图5B和表3所示。
表3
Figure GDA0002489325250000071
表3中，solution为对比例5，PVA为本发明实施例3，m/z值为单同位素质量数，“–”表示未检测到。
a)聚糖以全甲基化和[M+Na]+计算。
b)使用GlycoMod数据库检索确定单糖成分。单糖有：Hex,hexose；HexNAc,N-acetylhexosamine；Fuc,fucose；NeuAc,N-acetyl neuraminic acid；NeuGc,N-glycolylneuraminic acid and Man,mannose。
结果表明：本发明实施例3，即使在蛋白含量仅有40ng的情况下，依然能从PVDF膜上提取出与同质量的原液中数量完全相同的N-糖链，说明本发明灵敏度较高。

Claims (1)

1.一种以PVDF膜为载体准确提取糖链的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
（1）使用凝胶将蛋白质进行梯度分离；
（2）将已梯度分离的蛋白质从凝胶印迹到PVDF膜上；
（3）将印迹有目的蛋白质的PVDF膜浸泡在Direct Blue 71染色液中进行染色；
（4）用甲醇脱色经Direct Blue 71染色的PVDF膜；
（5）晾干脱色后的PVDF膜；
（6）从PVDF膜剪下载有目的蛋白质部位的PVDF膜碎片并用纯水清洗；
（7）将PVDF膜碎片转移至EP管内；
（8）用甲醇浸泡PVDF膜碎片；
（9）去除甲醇，立即将PVDF膜碎片浸泡在聚乙烯醇溶液中，室温震荡15~25 min，所述聚乙烯醇溶液是质量体积比浓度为0.25%的纯水溶液；
（10）去除PVDF膜碎片中的聚乙烯醇溶液；
（11）向PVDF膜碎片中加入NH4HCO 3溶液及胰酶溶液进行孵育；
（12）停止胰酶消化反应；
（13）根据目的糖链类型进行糖链释放反应。
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