CN102768132A - 一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全o-连接糖链及其鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链及其鉴别方法，以解决现有技术反应效率较低、可鉴定的糖链种类较少的问题。本发明利用8～12KD滤膜的分子筛效应，将从糖蛋白上释放的糖链与蛋白分离，在8～12KD分子筛上糖蛋白的O-连接糖链经β-消除反应释放，通过清洗、反复离心的方法使O-连接糖链流出，蛋白仍保留于滤膜上，从而一步实现了O-糖链的分离。该方法分离糖链效果明显，并避免了因非特异性吸附和化学反应带入副产物；反应效率高、反应步骤简明。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链及其鉴别方法。
背景技术
糖类物质是一种广泛存在于机体中的生物分子，在生物体内起着多种重要的作用。糖类物质主要是以糖类复合物的形式存在，如糖脂，糖蛋白，蛋白聚糖，肽葡聚糖，脂多糖等。其中蛋白质糖基化广泛分布于细胞表面和细胞外基质中，其上的糖链结构与很多的重要的生物功能相互关联，主要涉及调节蛋白的构象和稳定性，控制蛋白质甚至细胞的半衰期。另外，这些糖链结构作为配体的特异性结合介导蛋白的靶向识别，细胞与细胞以及细胞与胞外基质相互作用。生物体中的糖蛋白一般包括多个糖基化位点，而其每个糖基化位点的糖链结构具有其特异的糖型。因此鉴定糖蛋白上所有的糖链结构是非常具有挑战性，其中包括鉴定糖蛋白上的糖基化位点，分析每个糖型结构中的糖链组成，糖链序列，分支类型以及糖链残基中的羟基基团与其他残基的连接方式。现在没有一种技术可以完全得到糖蛋白糖基化修饰所有信息，只有将多种方法联合起来，如多种质谱技术联合，再加上糖链生物合成通路特点才能得到糖链的信息。
糖链分离和分析的方法在最近几年也得到长足的发展。通常，糖蛋白或者糖脂上的糖链通过酶解或者化学反应的方法释放，例如用PNGase F可以释放几乎所有的N-连接糖链，对于O-连接糖链，由于没有像PNGaseF一样具有普适性且留下质量标签的糖苷酶，一般通过化学方法进行切除，如β-消除反应可以释放所有的O-连接糖链。O-连接型糖链与氨基酸Ser或Thr的侧链羟基相连，初始单糖以GalNAc为主这类糖蛋白又称mucin类糖蛋白。另外还有一类O-连接糖型O-GlcNAc，其功能和研究领域与mucin类都有所区分，常独立归为一类。在现有所有基于β-消除反应原理的方法中，在进行β-消除反应之前，避免蛋白前期处理中所残留的各种盐类和杂质对β-消除反应效率的影响，都不可避免地需要对蛋白做除盐处理，这无疑增加了样品损失与操作复杂性。从糖蛋白或者糖脂上释放的糖链需要进行除盐处理，并且要将其从酶，化学反应物以及多肽或者脂类物质等非糖类物质中分离出来，现有的方法主要有特异亲和方法，反相高效液相色谱法，亲水色谱或者是多维联合分离等。这些方法的主要缺点是不能完全将糖链和其他物质分离，特别是亲水色谱法无法将亲水性多肽和盐类等物质与糖链分离。
发明内容
本发明提供了一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链的方法，以解决现有技术反应效率较低、可鉴定的糖链种类较少的问题。
为实现以上发明目的，本发明给出以下基本技术方案：
一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链的方法，包括以下步骤：
（1）蛋白样品的预处理
取蛋白样品加入超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，再加入弱碱性清洗液，再次离心从而尽可能去除杂质；另取一离心管，将8～12KD的超滤管倒置于该离心管中，然后离心，收集离出的蛋白，用Bradford方法定量，最后定容至1～5mg/ml，即得到定容的蛋白溶液。
（2）定容的蛋白溶液中糖蛋白全O-连接糖链分离
将定容的蛋白溶液加入另一8～12KD的超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，加入等体积的16M尿素溶液，振荡混合，离心；再加入8M尿素溶液至超滤管中（用以使蛋白充分变性），离心，弃去收集管中的流出液；然后加入10～100mM的DTT（二硫苏糖醇）溶液并振荡混合，56℃静置孵育，离心；再加入10～100mM的IAM(碘乙酰胺)或IAA（碘乙酸）溶液并振荡混合，暗处静置孵育，离心；再加8M尿素溶液至超滤管中，离心，至少重复1次；然后加反应缓冲液至超滤管中，离心，至少重复1次；加入1M NaBH4/0.05M NaOH溶液（即NaBH4和NaOH的混合水溶液，其中NaBH4的终浓度为1M，NaOH的终浓度为0.05M）；再经过40～50℃水浴后，离心；再加超纯水至超滤管中后离心，收集流出液，即得到已分离的糖蛋白全O-连接糖链；再用冰醋酸调节pH值至中性后，冷冻干燥备用。
基于以上基本技术方案，为取得更佳的技术效果，还可以对方案进一步改进、限定，如：
上述所有的超滤管均采用10KD滤膜，效果最佳。
上述步骤（1）所述的弱碱性清洗液采用40mM NH4HCO3或者NH4AC（醋酸铵）溶液。
上述步骤（2）中的反应缓冲液具体可以采用10～100mM NH4HCO3或NH4AC溶液。
上述步骤（2）中所述加入超纯水至超滤管中后离心并收集流出液的操作，重复一次；可以使释放的糖链进一步充分分离。
上述步骤（2）中，除最后一次离心操作是在离心机中12,000g离心外，其他的离心操作均是在离心机中14,000g离心；所述振荡混合均是在550rpm的恒温振荡孵育器中进行；如此效果最佳。
对按照上述分离方法分离得到糖蛋白全O-连接糖链样品进行鉴别的方法，包括以下步骤：
（1）糖链除盐处理
准备Sepharose4B：加Sepharose4B至离心管中，再向该离心管中加入体积比为1:1的甲醇：水溶液，摇匀，离心，弃上清，重复清洗至少1次；再向离心管中加入体积比为5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液，摇匀，离心，弃上清，重复清洗至少1次；
向糖蛋白全O-连接糖链样品中加入体积比为5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液，上样至Sepharose 4B的离心管中摇匀，25℃振荡反应；14,000g离心15min弃上清；再加入5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液摇匀，12,000g离心5min，弃上清，重复清洗至少1次；再加入1:1的甲醇：水溶液摇匀，25℃振荡，12,000g离心15min，收集上清，并冷冻干燥。经此步骤，对糖链样品进一步纯化，从而使得到的糖蛋白全O-连接糖链样品可直接用于质谱鉴定。
（2）分析样品中的全O-连接糖链结构
取50%甲醇溶液完全溶解经步骤（3）处理后的糖蛋白全O-连接糖链样品，点样于MTP Anchorchip 384点的靶板上，真空抽干；再加20mg/ml的基质DHB至样品板上，真空抽干；以反射阳性离子模式鉴定多糖，一级质谱方法参数如下：离子源1，7.50KV；离子源2，6.75KV，反射电压1，29.5KV；反射电压2，13.95KV；LIFT1，19KV；LIFT2，3.7KV；激发光源为N2激光，分子量检测范围为700-6800；检测时每个样品在多点采集图谱，每个图谱扫描1500次，最后将所有谱图叠加得到最后的多糖一级图谱。
（3）复杂糖链样品的MALDI结果分析
采用SimGlycan 4软件，选择目标离子分析其一级图谱，分析参数为：选择前体离子分子量，电荷状态，阳性离子化模式，加和Na+，离子容忍度为1，无化学衍生化，无还原端修饰；分析后得到可能的糖链结构，选择其中得分最高即最可能的糖链结构，结果用Glycanworkbench并标注于图中。
本发明具有以下优点：
本发明的滤膜辅助分离全O-连接糖链的方法利用蛋白质与糖链分子量之间的明显差异分离糖蛋白上的糖链结构。该方法具有广泛的应用性，可被应用于各种单一蛋白、复杂实验/临床样本如组织、血清、细胞、唾液等中糖蛋白O-连接糖链的快速分离。
与现有方法相比较，既省去了蛋白样品经前期处理后繁复的除盐冻干步骤，又避免了因非特异性吸附等带入副产物。使用该方法分离糖链快速效果明显、“一步式反应体系”极少糖链损失并且操作简单易实现。
附图说明
图1为滤膜辅助分离血清中糖蛋白全O-连接糖链的流程示意图。
图2为本发明的血清糖蛋白全O-连接糖链一级质谱指纹图谱。
具体实施方式
本发明利用8～12KD滤膜的分子筛效应，将从糖蛋白上释放的O-糖链与蛋白分离，如图1。蛋白质的分子量大于10KD，而目前发现的O-连接糖链均较小，糖基数目较少，其分子量一般在几千Da。在10KD分子筛上糖蛋白的O-连接糖链经β-消除反应释放，通过清洗、反复离心的方法使O-连接糖链流出，蛋白仍保留于滤膜上，从而一步实现了O-糖链的分离。
下面以血清样品为例，依照本发明实现分离糖蛋白全O-连接糖链及其鉴别的方法。其他蛋白样品（如唾液、尿液等）的主要步骤与此例完全相同。
以下实施例对本发明方案以具体实验操作过程示例详述，其中的实验条件和设定参数仅作为最佳操作方式的参考，而不应视为对本发明基本技术方案的局限。
（1）血清蛋白的预处理
血清样品用离心机12,000g离心15min，取中间液体部分。加入10KD的超滤管中，将超滤管置于配套的离心管中，12,000g离心15min，加入400
μl的40mM NH4HCO3，再次离心，重复一次。将滤膜倒置于新的离心管中，9000g离心3min，收集离出的蛋白（约50μl），用Bradford方法定量，最后分别定容至2mg/ml。
（2）血清中糖蛋白全O-连接糖链分离
取定容的蛋白溶液2mg分次（每次500μl）加入新的10KD的超滤管中并加入等体积的16mol/L尿素溶液，在550rpm的恒温振荡孵育器中振荡混合2min，离心机中14,000g离心15min。再加入200μL的8mol/L尿素溶液至超滤管中并在14,000g离心15min，弃去收集管中的流出液。加入150μL的10mM的DTT溶液并在550rpm的恒温振荡孵育器中振荡混合2min，56℃静置孵育45min，14,000g离心10min。加入150μL的20mM的IAM溶液并在550rpm的恒温振荡孵育器中振荡混合2min，暗处静置孵育20min，14,000g离心10min。加150μL的尿素溶液至超滤管中后14,000g离心15min，重复两次；加150μL的40mM NH4HCO3至超滤管中后14,000g离心10min，重复两次。加入200μl 50mM IAM溶液并在550rpm的恒温振荡孵育器中振荡混合1min，暗处静置孵育20min。加入200μl的40mMNH4HCO3，振荡混合1min，14,000g离心15min，重复一次。加入200μl 1M NaBH4/0.05M NaOH溶液。再经过45℃摄氏度水浴反应15h后，离心；再加超纯水至超滤管中后12000g离心收集流出液即为已分离的O-连接糖链，用冰醋酸调pH至中性后，冷冻干燥备用。
（3）糖链除盐处理
加100μl的Sepharose 4B分别至1.5ml的离心管中，向各离心管中加入1:1的甲醇：水溶液1ml，摇匀，12,000g离心5min，弃上清，重复清洗2次。再向各离心管中加入5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液1ml，摇匀，12,000g离心5min，弃上清，重复清洗2次。向冻干的糖链样品中加入500μl的5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液，上样至Sepharose 4B的离心管中摇匀，25℃振荡反应1h。14,000g离心15min弃上清。各加1ml 5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液摇匀，12,000g离心5min，弃上清，重复清洗3次。再各加入1ml的1:1的甲醇：水溶液摇匀，25℃振荡20min，12,000g离心15min，收集上清。重复一次，合并收集的样品并于冷冻干燥仪中冻干。
以上的步骤（3）旨在对糖链样品进一步纯化，从而使得到的糖蛋白全O-连接糖链样品可直接用于质谱鉴定。
（4）MALDI-TOF-MS分析血清样品中的全O-连接糖链结构
应用Bruker Daltonics公司的ultraFleXtreme MALDI-TOF/TOF-MS解析分离的生物样本中糖蛋白的O-连接糖链。取20μl的50%甲醇溶液完全溶解糖链，取2μl糖链溶液点样于MTPAnchorchip 384点的靶板上，真空抽干。再加1μl的20mg/ml的基质DHB至样品板上，真空抽干。以反射阳性离子模式鉴定多糖，一级质谱方法参数如下：离子源1，7.50KV；离子源2，6.75KV，反射电压1，29.5KV；反射电压2，13.95KV；LIFT1，19KV；LIFT2，3.7KV。激发光源为N2激光（337nm），分子量检测范围为700-6800。用多肽校正混合物作为外标校正质谱仪。检测时每个样品在多点采集图谱，每个图谱扫描1500次，最后将所有谱图叠加得到最后的多糖一级图谱。
（5）复杂糖链样品的MALDI结果分析
糖链的一级质谱图用Primer公司的商业分析软件SimGlycan 4分析。打开MALDI结果中的.fid文件，可以看到软件的主界面看到所有的质谱结果。选择目标离子分析其一级图谱，分析参数为：选择前体离子分子量，电荷状态，阳性离子化模式，加和Na+，离子容忍度为1，无化学衍生化，无还原端修饰。分析后得到可能的糖链结构，选择其中得分最高即最可能的糖链结构，结果用Glycanworkbench并标注于图中。
实验结果
质谱作为最灵敏的检测手段之一被广泛应用在了糖链的解析中，该方法可以获得糖链的组成，序列信息，分支情况等，并且通过串联质谱可以获得糖链连键信息，甚至在有的时候可以的糖链的同分异构体的结构信息。本实验中利用布鲁克公司的新型MALDI-TOF质谱仪ultrafleXtreme系列。该质谱仪具备1kHz smartbeam-II激光技术，是最新的离子光学技术。作为唯一的获得1kHz高通量的MALDI-TOF/TOF，且具有很高的灵敏度，可用于生物标志物发现和定量。从图2中可以看出该方法从血清总共分离得到17个糖链结构，且糖链结构峰型明显，信噪比均大于8。因此，该分离方法分离糖链快速效果明显、极少糖链损失。
经实验，当其他条件（如NaBH4/NaOH溶液的加入量、离心过程等参数）按照常规操作方式进行时，分离效果基本符合预期。
Claims (7)
1.一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链的方法，包括以下步骤：
（1）蛋白样品的预处理
取蛋白样品加入超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，再加入弱碱性清洗液，再次离心从而尽可能去除杂质；另取一离心管，将8～12KD的超滤管倒置于该离心管中，然后离心，收集离出的蛋白，用Bradford方法定量，最后定容至1～5mg/ml，即得到定容的蛋白溶液；
（2）定容的蛋白溶液中糖蛋白全O-连接糖链分离
将定容的蛋白溶液加入另一8～12KD的超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，加入等体积的16M尿素溶液，振荡混合，离心；再加入8M尿素溶液至超滤管中，离心，弃去收集管中的流出液；然后加入10～100mM的DTT（二硫苏糖醇）溶液并振荡混合，56℃静置孵育，离心；再加入10～100mM的IAM(碘乙酰胺)或IAA（碘乙酸）溶液并振荡混合，暗处静置孵育，离心；再加8M尿素溶液至超滤管中，离心，至少重复1次；然后加反应缓冲液至超滤管中，离心，至少重复1次；加入1M NaBH4/0.05M NaOH溶液（即NaBH4和NaOH的混合水溶液，其中NaBH4的终浓度为1M，NaOH的终浓度为0.05M）；再经过40～50℃水浴后，离心；再加超纯水至超滤管中后离心，收集流出液，即得到已分离的糖蛋白全O-连接糖链；再用冰醋酸调节pH值至中性后，冷冻干燥备用。
2.根据权利要求1所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链的方法，其特征在于：所有的超滤管均采用10KD滤膜。
3.根据权利要求2所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链的方法，其特征在于：步骤（1）所述的弱碱性清洗液采用40mM NH4HCO3或者NH4AC溶液。
4.根据权利要求1至3任一所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链的方法，其特征在于：步骤（2）中所述反应缓冲液采用10～100mMNH4HCO3或NH4AC溶液。
5.根据权利要求4所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链的方法，其特征在于：步骤（2）中所述加入超纯水至超滤管中后离心并收集流出液的操作，重复一次。
6.根据权利要求5所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链的方法，其特征在于：步骤（2）中，除最后一次离心操作是在离心机中12,000g离心外，其他的离心操作均是在离心机中14,000g离心；所述振荡混合均是在550rpm的恒温振荡孵育器中进行。
7.对按照权利要求1所述方法分离得到糖蛋白全O-连接糖链样品进行鉴别的方法，包括以下步骤：
（1）糖链除盐处理
准备Sepharose 4B：加Sepharose 4B至离心管中，再向该离心管中加入体积比为1:1的甲醇：水溶液，摇匀，离心，弃上清，重复清洗至少1次；再向离心管中加入体积比为5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液，摇匀，离心，弃上清，重复清洗至少1次；
向糖蛋白全O-连接糖链样品中加入体积比为5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液，上样至Sepharose 4B的离心管中摇匀，25℃振荡反应；14,000g离心15min弃上清；再加入5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液摇匀，12,000g离心5min，弃上清，重复清洗至少1次；再加入1:1的甲醇：水溶液摇匀，25℃振荡，12,000g离心15min，收集上清，并冷冻干燥；
（2）分析样品中的全O-连接糖链结构
取50%甲醇溶液完全溶解经步骤（3）处理后的糖蛋白全O-连接糖链样品，点样于MTP Anchorchip 384点的靶板上，真空抽干；再加20mg/ml的基质DHB至样品板上，真空抽干；以反射阳性离子模式鉴定多糖，一级质谱方法参数如下：离子源1，7.50KV；离子源2，6.75KV，反射电压1，29.5KV；反射电压2，13.95KV；LIFT1，19KV；LIFT2，3.7KV；激发光源为N2激光，分子量检测范围为700-6800；检测时每个样品在多点采集图谱，每个图谱扫描1500次，最后将所有谱图叠加得到最后的多糖一级图谱；
（3）复杂糖链样品的MALDI结果分析
采用SimGlycan 4软件，选择目标离子分析其一级图谱，分析参数为：选择前体离子分子量，电荷状态，阳性离子化模式，加和Na+，离子容忍度为1，无化学衍生化，无还原端修饰；分析后得到可能的糖链结构，选择其中得分最高即最可能的糖链结构，结果用Glycanworkbench并标注于图中。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20121107 |