CN107449843A - 一种石斛o‑连接糖组hplc‑ms分析方法 - Google Patents
一种石斛o‑连接糖组hplc‑ms分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107449843A CN107449843A CN201710631633.6A CN201710631633A CN107449843A CN 107449843 A CN107449843 A CN 107449843A CN 201710631633 A CN201710631633 A CN 201710631633A CN 107449843 A CN107449843 A CN 107449843A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stem
- noble dendrobium
- connections
- glycoprotein
- hplc
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明涉及一种石斛O‑连接糖组HPLC‑MS分析方法，包括以下步骤：(1)石斛糖蛋白的提取；(2)使糖链从蛋白上解离；(3)固相萃取；(4)HPLC‑MS对糖链进行色谱‑质谱解析。本发明所述方法首次鉴定了石斛12种O‑连接糖的种类。
Description
技术领域
本发明属于糖组学分析领域，涉及一种石斛糖组HPLC-MS分析方法，具体涉及通过HPLC-MS分析石斛O-连接糖组的方法。
背景技术
石斛为我国传统中药材，其药用价值为人们所共识。经研究发现，多糖是石斛属植物的主要活性成分。然而，目前针对石斛活性成分的研究方法仍主要是“提取→分离→纯化→结构鉴定”的传统方法，糖类活性成分的研究不系统，随机性大、效率低下，至今尚未明确石斛活性糖成分的具体结构。
根据基因组和蛋白质组的定义，糖组应该被定义为单一生物体中的整套聚糖系统。糖组学是继基因组学和蛋白组学后的新兴研究领域，它的研究结果直接关系到是否能够阐明基因功能及细胞功能。不同生物体中的糖组，无法统一，更无法由基因组推测。对糖组的研究最合适的做法是将糖组分解为不同的小组，平林淳和笠井献一的研究组迄今所着眼的是糖蛋白组，而且以线虫的基因组为基础。
目前糖组研究方法较少，糖蛋白为主的糖组学技术问题和发展趋势主要集中于以下四大技术难点：a.糖蛋白分离的问题；b.糖蛋白的基因识别效率较低；c.糖链的结构分析和共价键的确定仍然不是一件容易的工作；d.目前这些糖组研究方法几乎是静态的，而生物体的糖基化过程是动态的。
糖是组成生命体的四大类重要分子之一，糖蛋白质是由糖链与肽链中的特定氨基酸残基以糖苷键共价连接而成的蛋白质。糖蛋白质普遍存在于生物体内，在很多生命过程中起着重要作用，如蛋白质的折叠、细胞之间的相互识别等。同时，糖基化修饰对植物品质的鉴定、活性成分的发现和解析都具有重要意义。以基质辅助激光解吸电离质谱和电喷雾质谱为代表的生物质谱技术，因具有快速、灵敏、可提供结构信息等优点，有望成为糖蛋白质组和糖组分析的重要工具。
蛋白质的糖基化修饰主要有N-糖基化和O-糖基化两种形式。蛋白质O-糖基化是指在蛋白质的Ser/Thr上起始的黏蛋白型O-糖基化，目前已发现O-连接糖链的异常表达具有重要的生物学意义。然而，由于O-糖基化没有保守的特征修饰序列用来预测糖基化位点，并且没有能够将O-糖链从多肽链上释放下来的通用内切酶，因此目前O-连接糖组研究手段匮乏，目前在糖组学研究领域，仅有个别学者尝试建立了O-连接糖链的糖组学研究方法，并且对O-连接糖链的解析效率较低、通用性差，难以将其用于对石斛进行糖组学研究。
发明内容
针对上述现有技术中石斛O-连接糖组学研究的不足，本发明建立了石斛O-连接糖组的HPLC-MS分析方法，通过该方法解析出超过12种的石斛O-连接糖链类型，为石斛活性成分的发现和石斛品质的鉴定提供了有效的检测手段。
一方面，本发明提供一种石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法，包括以下步骤：
(1)石斛糖蛋白的提取；
(2)使糖链从蛋白上解离；
(3)固相萃取；
(4)HPLC-MS对糖链进行色谱、质谱解析。
本发明所述的石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法，其特征在于所述步骤(1)包括取石斛原料粉碎，加入10倍干重的双蒸水，匀浆，70℃浸提12h，离心取上清；沉淀加入10倍干重的双蒸水重复浸提，合并两次浸提的上清即为石斛糖蛋白；将石斛糖蛋白采用sevage法去除游离蛋白，加入无水乙醇至终浓度70％醇析沉淀糖蛋白。
本发明所述的石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法，其特征在于所述步骤(2)以10KDa滤膜超滤，取截留液加入蛋白变性剂和还原剂56℃孵育1h，再加入等体积的以28％的氨水溶解的硼烷氨络合物混匀，60℃反应24h，以10KDa滤膜超滤，取流出液即为石斛蛋白糖链。
本发明所述的石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法，其特征在于所述步骤(3)包括将步骤(2)获得的石斛蛋白糖链过Hypercarb固相萃取柱(SPE)，用含40vt％乙腈和0.05vt％的三氟乙酸的水溶液洗脱获得糖链。
本发明所述石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法，其特征在于
步骤(4)中将步骤(3)中获得的糖链上样至HPLC柱，采用连续线性梯度洗脱，其流动相A为0.05M pH 3的醋酸缓冲液，流动相B为分析纯乙腈；第0min，流动相A：流动相B为95：5；第12min，流动相A：流动相B为40:60。
本发明所述石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法，其特征在于
步骤(4)中质谱采用四极质谱仪在正离子模式下进行质谱分析。
本发明所述石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法，其特征在于
步骤(4)中质谱参数为温度240℃，碰撞能5-20V，质荷比(m/z)为500-2000，数据采集时间1s。
本发明所述石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法，其中所述的石斛为铁皮石斛、霍山石斛。
第二方面，本发明还提供所述石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法在获得石斛O-连接糖蛋白糖组图谱中的应用。进一步的，本发明还提供利用所述石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法获得的石斛O-连接糖蛋白的糖组学图谱。
第三方面，本发明还提供所述石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法寻找和发现石斛活性成分中的应用。
第四方面，本发明提供所述方法在鉴定石斛真伪中的用途，包括将待测样本的糖组图谱与石斛标准品糖组图谱进行对比。
本发明取得了以下有益的技术效果：
第一、本发明首次以O-连接糖蛋白糖组的方式研究石斛糖蛋白中的糖类组分，为研究、发现石斛活性成分提供有效的工具。
第二、本发明成功的建立了石斛O-连接糖蛋白糖组的HPLC-MS分析方法，所述方法能够解析、分析石斛O-连接糖组，通过本发明的方法首次发现了12种石斛O-连接糖。
第三、本发明所述的方法能显著提高O-糖链的色谱-质谱解析效率，步骤简单、操作方便。
附图说明
图1为石斛O-连接糖蛋白糖组的HPLC-MS图。纵坐标轴为Intensity(104)，横坐标轴为质荷比(m/z)。结果表明从石斛糖蛋白提取液中成功解析出12种O-糖链。
具体实施方式
还可进一步通过实施例来理解本发明，其中所述实施例说明了一些制备或使用方法。然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。
实施例
铁皮石斛糖蛋白的提取
取铁皮石斛干条原料粉碎，加入10倍干重的双蒸水，匀浆，70℃浸提12h，离心取上清；沉淀加入10倍干重的双蒸水重复浸提，合并两次浸提的上清即为石斛糖蛋白；将石斛糖蛋白采用sevage法去除游离蛋白，加入无水乙醇至终浓度70％醇析沉淀糖蛋白。
从糖蛋白上解离O-连接糖链
以10KDa滤膜超滤除去糖蛋白提取步骤中的多糖、寡糖、可溶性小分子杂质，弃透过液，取截留液加入蛋白变性剂和还原剂56℃孵育1h，再加入等体积的以28％的氨水溶解的硼烷氨络合物混匀，60℃反应24h，以10KDa滤膜超滤除去蛋白成分，取流出液即为石斛糖蛋白上解离下来的O-连接糖链。
固相萃取；
将含有石斛糖蛋白O-连接糖链的超滤透过液过Hypercarb固相萃取柱(SPE)，用含40％乙腈和0.05％的三氟乙酸(v/v)的水溶液洗脱获得富集后的O-连接糖链。
HPLC-MS：
将经过SPE富集后的O-连接糖链上样至HPLC柱，采用连续线性梯度洗脱，其流动相A为0.05M pH 3的醋酸缓冲液，流动相B为分析纯乙腈；第0min，流动相A：流动相B为95：5；第12min，流动相A：流动相B为40:60。
将HPLC柱与四极质谱仪串联，在正离子模式下进行质谱分析。质谱参数为温度240℃，碰撞能5-20V，质荷比(m/z)为500-2000，数据采集时间1s。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。
Claims (10)
1.一种石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法，包括以下步骤：
(1)石斛糖蛋白的提取；
(2)将糖链从蛋白上解离；
(3)固相萃取；
(4)HPLC-MS对糖链进行色谱、质谱解析。
2.如权利要求1所述的石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法，其特征在于所述步骤(1)包括取石斛原料粉碎，加入10倍干重的双蒸水，匀浆，浸提12h，离心取上清；沉淀加入10倍干重的双蒸水重复浸提，合并两次浸提的上清即为石斛糖蛋白。
3.如权利要求1所述的石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法，其特征在于所述步骤(2)以10KDa滤膜超滤，取截留液加入蛋白变性剂和还原剂56℃孵育1h，再加入等体积的以28％的氨水溶解的硼烷氨络合物混匀，60℃反应24h，以10KDa滤膜超滤，取流出液即为石斛蛋白糖链。
4.如权利要求1所述的石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法，其特征在于所述步骤(3)包括将步骤(2)获得的石斛蛋白糖链过Hypercarb固相萃取柱，用含40vt％乙腈和0.05vt％的三氟乙酸的水溶液洗脱获得糖链。
5.如权利要求1所述石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法，其特征在于步骤(4)中将步骤(3)中获得的糖链上样至HPLC柱，采用连续线性梯度洗脱，其流动相A为0.05M pH 3的醋酸缓冲液，流动相B为分析纯乙腈；第0min，流动相A：流动相B为95：5；第12min，流动相A：流动相B为40:60。
6.如权利要求1或5所述石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法，其特征在于步骤(4)中质谱采用四极质谱仪在正离子模式下进行质谱分析。
7.如权利要求6所述石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法，其特征在于步骤(4)中质谱参数为温度240℃，碰撞能5-20V，质荷比(m/z)为500-2000，数据采集时间1s。
8.如权利要求1-7所述石斛O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法，其中所述的石斛为铁皮石斛、霍山石斛。
9.如权利要求1-6所述O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法在获得石斛蛋白糖组图谱中的应用。
10.如权利要求1-6所述O-连接糖蛋白糖组HPLC-MS分析方法在鉴定石斛真伪中的用途，包括将待测样本的糖组图谱与石斛标准品糖组图谱进行对比。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710631633.6A CN107449843B (zh) | 2017-07-28 | 2017-07-28 | 一种石斛o-连接糖组hplc-ms分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710631633.6A CN107449843B (zh) | 2017-07-28 | 2017-07-28 | 一种石斛o-连接糖组hplc-ms分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107449843A true CN107449843A (zh) | 2017-12-08 |
| CN107449843B CN107449843B (zh) | 2019-10-25 |
Family
ID=60490277
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710631633.6A Active CN107449843B (zh) | 2017-07-28 | 2017-07-28 | 一种石斛o-连接糖组hplc-ms分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107449843B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1930470A (zh) * | 2004-03-19 | 2007-03-14 | 独立行政法人产业技术综合研究所 | 鉴定糖链结构的方法及其分析装置 |
| CN102768132A (zh) * | 2012-06-28 | 2012-11-07 | 西北大学 | 一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全o-连接糖链及其鉴别方法 |
| CN104133027A (zh) * | 2014-06-24 | 2014-11-05 | 江南大学 | 一种分离鉴定糖蛋白n-糖链结构的方法 |
| CN105467050A (zh) * | 2014-09-11 | 2016-04-06 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种用于o糖基化肽段及其完整糖链的鉴定方法 |
-
2017
- 2017-07-28 CN CN201710631633.6A patent/CN107449843B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1930470A (zh) * | 2004-03-19 | 2007-03-14 | 独立行政法人产业技术综合研究所 | 鉴定糖链结构的方法及其分析装置 |
| CN102768132A (zh) * | 2012-06-28 | 2012-11-07 | 西北大学 | 一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全o-连接糖链及其鉴别方法 |
| CN104133027A (zh) * | 2014-06-24 | 2014-11-05 | 江南大学 | 一种分离鉴定糖蛋白n-糖链结构的方法 |
| CN105467050A (zh) * | 2014-09-11 | 2016-04-06 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种用于o糖基化肽段及其完整糖链的鉴定方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 武艳丽 等: "基于超滤膜辅助的糖蛋白全O-连接糖链的富集和MALDI-TOF/TOF质谱结构解析", 《生物化学与生物物理进展》 * |
| 蔡自建: "甘薯糖蛋白的分离纯化及其糖链结构鉴定", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107449843B (zh) | 2019-10-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ge et al. | Identification of kinetin and kinetin riboside in coconut (Cocos nucifera L.) water using a combined approach of liquid chromatography–tandem mass spectrometry, high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis | |
| Peña-Gallego et al. | S-Cysteinylated and S-glutathionylated thiol precursors in grapes. A review | |
| CN105699478B (zh) | 一种识别糖的快速方法 | |
| CN106831596B (zh) | 一种制备麦角硫因的方法 | |
| DE102012102874A1 (de) | Gasphasenreinigung zur genauen Quantifizierung auf der Basis isobarer Tags | |
| CN103043647A (zh) | 表面修饰氨基苯硼酸的纳米碳材料及其制备方法和应用 | |
| Manning et al. | Isolation of polyketides from Prymnesium parvum (Haptophyta) and their detection by liquid chromatography/mass spectrometry metabolic fingerprint analysis | |
| CN103804507A (zh) | 马里兰烟叶多糖、提取纯化方法及其作为抗氧化剂的应用 | |
| CN107843663A (zh) | 一种巴戟天低聚糖成分的鉴别方法 | |
| Colzani et al. | The secrets of Oriental panacea: Panax ginseng | |
| Cui et al. | LC–MS–MS determination of troxerutin in plasma and its application to a pharmacokinetic study | |
| Jie et al. | Progress in the pretreatment and analysis of carbohydrates in food: An update since 2013 | |
| Wang et al. | Changes of anthocyanin and amino acid metabolites in saffron petals (Crocus sativus L.) during fermentation based on untargeted metabolomics | |
| CN104181269B (zh) | 基于山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷鉴别蜂花粉的方法 | |
| CN104764847B (zh) | 含n-乙酰化结构肝素寡糖的制备方法 | |
| CN107449843B (zh) | 一种石斛o-连接糖组hplc-ms分析方法 | |
| CN107389805A (zh) | 还原性释放糖蛋白n‑糖链及其衍生物分离和分析鉴定的方法 | |
| CN104328073B (zh) | 一株产游离葡萄糖醛酸的木糖葡糖醋杆菌 | |
| CN108484688B (zh) | 从还原性糖的肼类发色试剂衍生物中再生还原性糖的方法 | |
| Bulska et al. | Bioanalytics as a tool supporting the functional food development | |
| CN111257438A (zh) | 西洋参多肽的富集和表征方法 | |
| Kang et al. | Comparison of fluorescent tags for analysis of mannose-6-phosphate glycans | |
| CN107402272A (zh) | 一种石斛n‑连接糖组的maldi‑tof分析方法 | |
| CN109651487A (zh) | 一种植物体内源肽的提取方法 | |
| CN111337609B (zh) | 一种基于lc-ms同时测定多种神经递质的人血清测定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |