CN1930470A

CN1930470A - 鉴定糖链结构的方法及其分析装置

Info

Publication number: CN1930470A
Application number: CNA2005800080274A
Authority: CN
Inventors: 龟山昭彦; 成松久; 菊池纪广; 中家修一
Original assignee: Shimadzu Corp; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Mitsui Knowledge Industry Co Ltd
Current assignee: Shimadzu Corp; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Mitsui Knowledge Industry Co Ltd
Priority date: 2004-03-19
Filing date: 2005-03-18
Publication date: 2007-03-14
Anticipated expiration: 2025-03-18
Also published as: US20080139396A1; DE112005000598B8; DE112005000598T5; JP4025850B2; CN100495016C; DE112005000598B4; TW200532194A; WO2005090963A1; JP2005265697A; CA2560355A1

Abstract

本发明的目的是提供一个分析糖链结构的系统，其能够用少量样品简单而快速地确定糖链的完整一级结构。在鉴定一个分析目标糖链结构的方法中，用质谱仪通过比较测量的MS3碎片图谱和数据库中所存参考MS3碎片图谱，这里测量的MS3碎片图谱是包含在测量的MS2碎片图谱中的每一个MS2碎片离子的碎裂图谱，其通过将分析目标糖链进行碎裂质谱分析而获得，本发明的特征在于，包含在测量的MS2碎片图谱中的多个MS2碎片离子中，只有对选定的MS2碎片离子进行碎裂质谱分析，这里每一个选定的MS2碎片离子具有存储于数据库中的多个参考MS3碎片图谱，其相互的相似指数小于一个预定值，其中多个参考MS3碎片图谱和选定的MS2碎片离子具有同样的先驱离子质荷比。

Description

鉴定糖链结构的方法及其分析装置

技术领域

本发明涉及用质谱仪分析糖链结构的系统。

背景技术

随着人类基因组草图序列数据的公布，作为后基因组研究，研究与开发阶段已经转移到蛋白质功能与结构分析以及相互作用分析。另一方面，活体中约一半蛋白质在翻译后经历糖链修饰，正在表明，通过经历这样的修饰，优先发挥其正确功能。因此，阐明糖蛋白的功能对于实现基因组药物创制和医疗实践再发展是一个不可缺少的途径。因此，作为下一代后基因组研究，有必要从“糖蛋白质组”的观点来进行研究与开发，目标是以糖链和蛋白质为整体进行全面分析并阐明其功能，特别是，需要开发能够快速分析糖链的新技术，目前难以分析糖链的功能和结构。

糖链深深涉及蛋白质的稳定性和定位，对于细胞的更高生命功能表现发挥着重要作用，例如作为细胞表面识别分子起作用。然而，由于成分糖的多样性、结合成分糖的顺序和结合形式的差异以及成分糖之间的端基异构体结构的差异，糖链具有非常高的多样性。例如，在成分糖中，葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)和甘露糖(Man)是具有相同分子量的同分异构体。尽管认为成分糖的种类不是很多，但是大多数糖链是结合了数十种成分糖而形成的，以致结合的组合数非常大。除此之外，还有许多由于分支结构导致的异构体，和同分异构体如α和β端基异构体，和一些硫酸化和磷酸化修饰的同分异构体。

除了这些多样性外，糖链量非常小的事实使它们的分析更加困难，鉴于此，目前还没有开发出扩增糖链的方法。

至今，已经开发出多种分析糖链结构的方法，包括一种使用水解酶和HPLC的方法以及一种利用凝集素亲和层析、甲基化分析、质谱分析和NMR的方法(Okura和Kameyama“Current Situation and Future of SugarChain Structure Analysis“，Bioindustry，CMC出版社，2003年1月，18-24)。然而，糖链的完全结构信息不能通过任何单独的方法获得，有必要将多种方法结合起来进行分析。为此，为了分析一个糖链，需要麻烦的操作和长时间，不能实现高通量的分析。

从高速和易操作的观点看，前述的各种分析方法中，那些使用质谱分析的方法有望在将来成为糖链结构分析的主流。

然而，常规的MS/MS(MS²)质谱分析法中，端基同分异构体和结构同分异构体不能被区别。

于是，希望通过重复糖链离子(MSⁿ)的[(i)碎裂]—[(ii)质量测定和碎片离子选择]—[(iii)进一步碎裂]的步骤而获得糖链的复杂结构信息(Y.Takegawa等，“Structural assignment of isomeric 2-aminopyridin-derivatizedoligosaccharides using MSn spectral matching”，Rapid Commun.MassSpectrum，2004；18：385-391)。然而，因为每次碎裂产生了数十或甚至数百的碎片离子，所以在全部这些碎片离子上进行进一步碎裂和全部碎片离子的比较(模式匹配)是不可行的。即使当进一步碎裂只限于主要的碎片离子，如果用反复试验法进行碎裂，则需要大量的样品。

发明内容

本发明要解决的目标是提供一个分析糖链的系统，其能够用少量的样品简单而快速地确定糖链完整的一级结构。

只用质谱分析通过集中工作快速地确定糖链结构，本发明人发现了一种快速而精确地获得糖链完整一级结构信息的方法，包括同分异构体的信息和单糖结合位置的信息，该方法通过从产生的碎裂(碎片)离子中选择适当的离子(或多种离子)并在其(或它们)上进行下一级碎裂。

就是说，为了解决前述目标而作出的本发明是一种用质谱仪鉴定分析-目标糖链结构的方法，该方法通过将测量的MS3碎片图谱(pattern)与数据库中参考MS3碎片图谱相比较实现，这里测量的MS3碎片图谱是包含在一个测量的MS2碎片图谱中每一个MS2碎片离子的碎片图谱，MS2碎片图谱是将分析-目标糖链进行碎裂质谱分析而获得，其特征在于，在多个包含在测量的MS2碎片图谱中的MS2碎片离子中，只对所选MS2碎片离子进行碎片质谱分析，这里每一个所选MS2碎片离子有多个储存于数据库中的参考MS3碎片图谱，其相互相似指数与预定值相同或小于预定值，其中多个参考MS3碎片图谱与被选择的MS2碎片离子有相同的先驱离子质荷比。

如上所述，由于糖链中有各种各样的同分异构体，认为难以通过质谱分析来区别它们。然而，碎片图谱的差异是通过反复碎裂产生的，这一点已经明确。目前认为，通过测定碎片图谱直到MS3，大多数糖链的结构能够被鉴定。

然而，为了获得一个MS3碎片图谱，必须从初始糖链进行两阶段的碎裂，由此，从一个糖链获得的MS3碎片图谱的数目是巨大的。从一个未知糖链获得的MS3碎片图谱(称为“测量的MS3碎片图谱”)和数据库中存储的MS3碎片图谱(称为“参考MS3碎片图谱”)的无条理图谱匹配不仅费时，而且可妨碍正确的图谱匹配(或鉴定)。

于是，本发明中，如上所述，在包含于一种测量的MS2碎片图谱内的多个MS2碎片离子中，碎裂质谱分析只在所选MS2碎片离子中进行，这里每一个所选MS2碎片离子有多个参考MS3碎裂图谱，其相互相似指数是一个预定值(第一测定值)或更小，其中多个参考MS3碎片图谱具有和所选MS2碎片离子相同的先驱离子质荷比。

在这里，有三个或更多这样的MS3碎片图谱的情况下，任何两个MS3碎片图谱组合的相似指数最高的一个能够作为上述相似指数而被采用。

数据库中存储的参考MS3碎片图谱相互相似指数高的情况下，以及通过对一个未知样品进行MS3分析以测量MS3碎片图谱的情况下，很难确定测量的MS3碎片图谱和它们中的任何一种相匹配。依本发明的方法，测定可以更快地进行，首先通过在MS3碎片图谱相互相似指数低的MS2碎片离子上进行碎裂质谱分析(或者以相似指数从低到高的顺序)，和进行MS3碎片图谱的比较(匹配)。

期望通过与先驱离子的质荷比联系在一起，预先在数据库中存储前述MS3碎片图谱的相互相似指数。因此，可进行更快速的图谱匹配。

关于前述所选MS2碎片离子，期望把它们以一个预定标准分级(ranking)。分级可基于前述MS3碎片图谱的相互相似指数而完成。备选地，数据库中参考MS3碎片图谱的数目可以在进行分级中被考虑。当一个通过分析而获得的未知样品MS3碎片图谱与数据库中存储的参考MS3碎片图谱之间的相似指数不小于预定值(第二预定值)时，按照分级继续进行碎裂质谱分析，在那里完成分析，基于匹配图谱鉴定糖链结构。

期望只采用这样的MS2碎片离子，其具有在测量的MS2碎片图谱中峰强度不低于为此处理目标而预定的值。

依照前述程序鉴定之前，期望从测量的MS2碎片图谱(包括先驱离子的峰)计算糖链的理论组成，基于此，在存储于数据库中的MS2碎片图谱和MS2碎片离子之中，预选和限制到将要和测量的MS2碎片图谱和碎片离子相比的那些。

前述方法表示了一个在MS2碎片离子上进行进一步碎裂质谱分析的准则。本发明的方法能够被类似地用在进一步碎裂阶段，以测定产生的碎片离子(MSn碎片离子)中哪些碎片离子应该优先做进一步的碎裂质谱。如前所述，认为大多数糖链结构能够通过比较MS3碎片图谱被鉴定。但有时需要对一些复杂的或者具有细微同分异构结构差异的糖链进行MS4碎裂或更进一步的碎裂。在此情况下，用本发明的方法作为准则，能够提高效率。

当碎裂质谱分析按照上述每一阶段进行时，期望设定先驱离子的碎裂能量不低于预定值，其由相应的先驱离子而测定。通过将能量近似地设定在一个值，在此值下先驱离子几乎完全碎裂，碎裂产生的碎片图谱的再现性变好，糖链结构的鉴定变得更可靠。期望通过与先驱离子相关联，在数据库中存储预定的碎裂能量值。

质谱分析有望成为一种能够对复杂和多样的糖链进行快速结构分析的方法。但是，为了进行正确鉴定，需要重复糖链离子的[(i)碎裂]—[(ii)碎片离子的质量测定和选择]—[(iii)进一步碎裂]，至少对直至MS3碎片图谱进行图谱匹配。然而，因为数十或数百的碎片离子在每个碎裂过程中产生，对所有这些碎片离子进行进一步碎裂和比较(图谱匹配)不太实际的。即使当进一步碎裂只限于主要的碎片离子，如果碎裂要进行反复试验，那么需要大量的样品。

本发明的分析糖链结构的方法为进行进一步碎裂提出了有用的准则，因此，能够快速地达到目标鉴定。另外，由于避免了不必要的分析，所以能够控制样品消耗，即使少量样品也能被充分地鉴定。

附图简述

图1是实现本发明的装置的示意结构图。

图2是本发明的一个实例所得的测量的MS2碎片图谱。

图3是存储于数据库中对应于前述测量的MS2碎片图谱的参考MS2碎片图谱及其结构模型。

图4是具有同一MS2碎片离子先驱离子的MS3碎裂图谱比较。

图5是MS2碎片离子在m/z＝1280条件下的测量的MS3碎片图谱。

图6是存储于对应于前述测量的MS3碎片图谱的数据库中参考MS3碎片图谱及其结构模型。

图7是用于检验算法的两种样品的糖链结构式，算法用于计算两个碎片图谱(波谱)的相似指数(相异指数)。

图8是样品相异指数的计算结果表。

图9是用于检验前述算法的另外两种样品的糖链结构式。

图10是样品相异指数的计算结果表。

图11是用于检验前述算法的其他另外两种样品的糖链结构式。

图12是样品相异指数的计算结果表。

图13是用于检验前述算法的其他另外三种样品的糖链结构式。

图14是样品相异指数的计算结果表。

图15是本发明方法一个实施例的流程图。

实施本发明的最佳方式

本发明将通过一个实例详细地解释如下。图1表示了实现本发明的糖链结构分析器的示意结构。分析器包括一个质谱仪MS部分和一个分析部分ANL。质谱仪MS装备有一个基质辅助激光解吸离子化(MALDI)的离子发生器、一个四极离子阱(QIT)和一个飞行时间(TOF)质谱仪，分析部分ANL包括一个数据库DB。许多结构已知的糖链离子的质谱分析图谱(碎片图谱)以及它们的一级和二级(MS2和MS3)碎片离子质谱分析图谱(碎片图谱)被存储在数据库中。另外，为分析部分ANL提供了一个图谱匹配程序(pattern matcher，PM)用于比较质谱仪MS发送的碎片图谱(数据)和数据库DB中存储的碎片图谱(数据)，并计算它们的相似指数。为质谱仪MS部分提供了一个控制部分CNTL，用于控制整个分析器。

使用这个分析器，一种进行未知糖链结构分析的方法将在所用流程图15中加以解释。首先，用适当的切割酶或使用一个适当的化学裂解反应将一种待鉴定的未知糖链从含有糖蛋白或糖脂的生物学样品中释放出来。如果需要，标记所得的糖链样品，与一种基质试剂混合，将其送到质谱仪MS。在质谱仪部分MS中，用MALDI将样品离子化，用TOF进行质谱分析。从而，测量了糖链离子(先驱离子)的质荷比([质量m]/[电荷z])。此外，通过在离子阱QIT中进行碎裂，产生其碎片离子，测量了每一个碎片离子的质荷比和强度。因而，获得了一个MS/MS碎片图谱(测量的MS2碎片图谱，MS2FPm)(步骤S1)。MS2碎片图谱的一个实例表示在图2中。在这个实例中，先驱离子(未知糖链样品的离子)的质荷比m/z是2147.8。MS2碎片图谱的数据从质谱仪MS发送到分析部分ANL。

分析部分ANL中，从MS2碎片图谱的数据中得到，

(1)先驱离子的质荷比，

(2)每一个碎片离子的质荷比，和

(3)每一个碎片离子的强度。

基于这些数据，以及在制备样品中用到的标记试剂、切割酶和试剂的信息，分析部分ANL计算糖链的理论组成(步骤S2)。标记试剂等的信息可通过一个操作者输入至质谱仪MS或分析部分ANL。

在图2的实例情况下，从质荷比为2147.8的先驱离子确定该糖链的理论组成是(Hex)5(HexNAc)6。

然后，在分析部分ANL中，计算了每一个具有计算的理论组成的所有糖链异构体(参考MS2碎片图谱，MS2FPd)的MS2碎片图谱和从质谱仪MS发送的MS2碎片图谱(MS2FPm)之间的相似指数S。计算两个碎片图谱的相似指数S(或相异指数D)的方法将在稍后详细解释。于是，只有与测量的MS2碎片图谱的相似指数S不小于预定值S21的这样的参考MS2碎片图谱被预选(步骤3)。

当理论组分是(Hex)5(HexNAc)6时，图3所示的糖链同分异构体的四种MS2碎片图谱被存储于分析部分ANL的数据库DB中。相应于每一个碎片图谱的糖链结构模型表示在图3的图谱上。只有碎片图谱(c)和(d)与图2的测量的碎片图谱的相似指数S大于预定值S21。

这样预选的参考MS2碎片图谱中，以从高到低的强度顺序选择一个预定数目的碎片峰(步骤S4)。这里，选择MS2碎片峰中，峰数目也可被预先确定，或者，可以选择具有预定强度水平(相对于最大峰)或更高水平的峰。

从图3(c)和(d)的两个参考MS2碎片图谱，选择了如下六个碎片峰。

m/z＝2129

m/z＝1848

m/z＝1782

m/z＝1645

m/z＝1483

m/z＝1280

这样选择的碎片峰中，选择了碎片离子(MS2碎片离子)，然后碎裂质谱分析应该在质谱仪MS中进行。这里，用到了本发明的方法。

读出存储于数据库DB中的MS3碎片图谱，其先驱离子是相应于预选碎片峰的碎片离子(通常，与一个先驱离子有关系的多个MS3碎片图谱被存储)，计算了它们之间的相似指数(不是后面描述的相异指数D，而是当两个图谱相似时呈更高值的相似指数)S。以及，只有相似指数不大于预定值S22的MS2碎片离子进行质谱仪MS中的碎裂质谱分析(步骤S5)。同时，这些MS2碎片离子以相似指数从小到大的顺序被分级(步骤S6)。

关于前述所选的六个碎片峰，对应于各个峰的MS3碎片图谱表示在图4中。其中，源自m/z＝1483的先驱离子的两个MS3碎片图谱和源自m/z＝1280的先驱离子的两个MS3碎片图谱比源自其他先驱离子的MS3碎片图谱有较低的相互相似指数。当这些存储于数据库DB中的参考MS3碎片图谱与未知样品的测量的MS3碎片图谱相比(图谱匹配)时，在两个参考MS3碎片图谱的相似指数小的情况下(即，这两个图谱远距离)，比这两个图谱互相相似的情况更容易确定测量的MS3碎片图谱与参考MS3碎片图谱之一相匹配。

图4表示了每一个先驱离子的两个MS3碎片图谱。对于一个先驱离子可能有三个或更多MS3碎片图谱被存储在数据库DB中。在那种情况下，任意两个MS3碎片图谱间的相似指数也可用作该指数。但是，期望在任何两个MS3碎片图谱间用最大的相似指数，因为，在此情况下，其他MS3碎片图谱间的相似指数比它较小。这使测量的/参考图谱的匹配可靠。

在图4的情况下，MS3碎片图谱之间的相似指数小于m/z＝1280的情况。这样，MS2碎片离子被优先采用，其次采用m/z＝1483的MS2碎片离子。

基于这样选择和分级的结果，分析部分ANL将随后应该进行碎裂质谱分析的先驱离子的质荷比数据发送到质谱仪MS。在质谱仪MS中，根据从分析部分ANL发送的数据，只有产生于离子阱QIT的MS2碎片离子中指定的碎片离子(在上述实例的情况下，m/z＝1280的碎片离子)留在离子阱QIT中，并用预定能量将它们碎裂而进行MS3质谱分析(步骤S7)。由此获得的m/z＝1280(校正的m/z＝1280.4)的测量的MS3碎片图谱表示在图5中。

测量的MS3碎片图谱的数据从质谱仪MS发送到分析部分ANL，图4中第二阶段的两个参考MS3碎片图谱之间的相似指数在那里分别计算，并和预定阈值S31进行比较(步骤S8)。在此情况下，如图6(a)所示，和测量的MS3碎片图谱有较高的相似指数。

因而，此时分析样品的糖链被确定为(Hex)5(HexNAc)6，具有如图6(a)上部分所示的结构(步骤S9)。

然后，解释了计算未知样品的测量的碎片图谱和存储于数据库中参考碎片图谱之间的相似指数的算法，在前述鉴定程序中曾经用到。在如下算法解释中，前述“碎片图谱”是指“谱图(spectrum)”。

(1)关于每一个测量的谱图和参考谱图，在某一m/z(质荷比)值的范围内的峰归为一组(或合并)。在这些峰中，具有最高强度的峰被认为是合并后的峰。

(2)假设合并后测量的谱图的n个峰(P1，P2，…，Pn)强度是xi(i＝1-n)，测量的谱图的向量X生成为，

X＝(x1，x2，…，xn)。

(3)关于参考谱图，确定对应于测量的谱图的峰Pi的一个参考谱图峰，并从峰的强度中产生参考谱图的向量Y，为

Y＝(y1，y2，…，yn)。

(4)从两个向量X和Y间的欧几里得距离(Euclidean distance)获得两个谱图的相异指数D1，如下。

D1＝∑(i＝1～n)(xi-yi)²

由于当两个谱图完全相同时这里计算的值D1是0(零)，当两个谱图的差异更大时，值D1更大，值D1被称为“相异指数”。自然地，该值能够成为两个谱图间相似度的量度。为了表示两个谱图由于变近而变大的相似度，可以用相异指数的倒数。

(5)在上面计算的相异指数D1中，一个已知糖链结构(参考谱图)具有未知样品谱图(测量的谱图)中未出现的峰，呈一个小的相异指数(大相似指数)。这样，通过交换测量的谱图和参考谱图的向量再次计算相异指数D2。即，对于具有相异指数D1不高于预定阈值的参考谱图，前述向量X从参考谱图计算出，前述向量Y从测量的谱图计算出，并获得了相异指数D2。

用实际数据校验前述计算相异指数(相似指数)方法的效果。用于校验的样品是通过将标记有PA的糖链进行质谱分析而获得的谱图。让合并后m/z值范围为0.8，并让认为是相同峰的m/z值范围为0.5，进行计算。通过质谱仪AXIMA/QIT(AXIMA是岛津公司的注册商标)的峰列表输出的％AREA值(预定范围中的峰面积值)获得强度值。

(1)0NA-00001a(100.1)和0NA/00001b(100.2)的比较

它们的结构式表示在图7(a)和(b)中。关于这两种同分异构结构，计算了两个具有相同结构但是采集自不同实验的样品的谱图间相异指数，以及两个同分异构体样品谱图的相异指数。结果表示在图8的表中。

图8表的第一行是0NA-00001a(100.1)(先驱离子质荷比是1214)的MS2谱图相异指数计算结果。中间两个单元格中的数据表示两个不同时间将同一样品进行质谱分析所得的平均相异指数计算值，右边两个单元格中数据是它们与同分异构体0NA-00001b(100.2)的MS2谱图的相异指数值。在MS2谱图中，同一样品间相异指数和同分异构体样品间相异指数并不是很不同。

图8表的第二行是关于质谱谱图(MS3谱图)相异指数计算结果，其中m/z＝915的0NA-00001a(100.1)碎片离子被进一步碎裂。同样，中间两个单元格中数据表示两个不同时间将同一样品进行质谱分析所得的平均相异指数，右边两个单元格中数据是它们与同分异构体0NA-0001b(100.2)在同样m/z＝915的MS3谱图的相异指数。当分析直到MS3谱图时，同分异构体样品的相异指数大于同样样品间的相异指数。图8表的第三行是关于先驱离子在m/z＝1196的结果，显示了同样的结果。

图8表第四到第六行是关于0NA-00001b(100.2)的相似计算结果。使用m/z＝1214条件下先驱离子的MS2谱图和使用m/z＝915条件下先驱离子的MS3谱图测量结果中，同一样品间相异指数值和同分异构体间相异指数值看不出差别，但是在使用m/z＝1196条件下先驱离子的MS3谱图结果中，同一样品间相异指数比同分异构体间小。

(2)ONG-00001c(100.3)和ONG-00001d(100.4)的比较

它们两者的结构式表示在图9(c)和(d)中。相异指数的相似计算结果表示在图10的表中。在这些样品中，任何情况下，同一样品间相异指数远比同分异构体样品之间的相异指数小。

(3)ONG-00001e(310.2)和ONG-00001f(310.3)的比较

它们两个的结构式表示在图11(e)和(f)中，相异指数计算结果表示在图12的表中。对于这些样品，在不同于用到m/z＝1280的先驱离子的情况下，同一样品的相异指数比同分异构体样品之间的相异指数大。这是因为二者样品的峰呈现细微差异，由于合并(merging)程序而使该差异增强。在用m/z＝1280的先驱离子的MS3谱图中，同一样品之间的相异指数比同分异构体样品之间的相异指数小。因此，这能够区别两个同分异构体。

(4)ONG-000020(400.2)、ONG-000021(400.3)和ONG-000022(400.5)的比较

各自的结构式表示在图13中。从MS2谱图，这三种同分异构体不能被区别。然而，当通过选择特殊峰进行MS3时，那些同分异构体能够被区别。特别是，在作为峰使用m/z＝1686、1764和1967的先驱离子的MS3谱图情况下，具有最小相异指数(或最相似样品)的结构对应于正确的糖链结构。

从前述实验结果，首先，确认前述计算方法对于确定两个谱图间的相似指数(相异指数)是有效的。另外，清楚地表明，即使当同分异构体间结构差异不能被MS2阶段谱图的相似指数(相异指数)所反映时，通过进行碎裂质谱分析直到MS3，同分异构体结构的差异能够通过计算谱图相似指数(相异指数)而区别。

Claims

1.用质谱仪鉴定分析-目标糖链结构的方法中，通过比较测量的MS3碎片图谱和数据库中存储的参考MS3碎片图谱，其中所述测量的MS3碎片图谱是包含在测量的MS2碎片图谱中的每一个MS2碎片离子的碎裂图谱，其通过将所述分析-目标糖链进行碎裂质谱分析而获得，

所述鉴定糖结构的方法的特征在于，在包含在测量的MS2碎片图谱中的多个MS2碎片离子中，只对选定的MS2碎片离子进行碎裂质谱分析，其中每一个选定的MS2碎片离子具有存储于数据库中的多个参考MS3碎片图谱，其相互相似指数等于或小于一个预定值，其中所述多个参考MS3碎片图谱和所述选定的MS2碎片离子具有同样的先驱离子质荷比。

2.权利要求1所述的鉴定糖链结构的方法，其中参考MS4碎片图谱或由进一步碎裂产生的MSn参考碎片图谱被进一步存储于数据库中，通过将它们和测量的MS4碎片图谱或由进一步碎裂而来的MSn测量的碎片图谱相比较来进行糖链结构的鉴定，并且，以与上述同样的方式，只有多个参考MSn+1碎片图谱之间相互的相似指数不高于预定值的测量的MSn碎片离子进行进一步的碎裂质谱分析。

3.用质谱仪鉴定分析-目标糖链结构的方法中，通过比较测量的MS3碎片图谱和数据库中存储的参考MS3碎片图谱，其中所述测量的MS3碎片图谱是包含在测量的MS2碎片图谱中的每一个MS2碎片离子的碎裂图谱，其通过将所述分析-目标糖链进行碎裂质谱分析而获得，

所述鉴定糖结构的方法的特征在于，在包含在测量的MS2碎片图谱中的多个MS2碎片离子中，以从小到大的存储于数据库中的多个MS3碎片图谱的相互相似指数的顺序进行碎裂质谱分析，其中所述多个参考MS3碎片图谱和所述选定的MS2碎片离子具有同样的先驱离子质荷比。

4.权利要求3的鉴定糖链结构的方法，其中参考MS4碎片图谱或由进一步碎裂产生的MSn参考碎片图谱被进一步存储于数据库中，通过和测量的MS4碎片图谱或由进一步碎裂而来的MSn测量的碎片图谱相比较来进行糖链结构的鉴定，并且，以与上述同样的方式，只有多个参考MSn+1碎片图谱之间相互相似指数不高于预定值的测量的MS4碎片离子进行进一步的碎裂质谱分析。

5.根据权利要求1到4中任何一项的鉴定糖链结构的方法，其中前述参考MSn+1碎片图谱之间的相互相似指数被存储于数据库中，与所述先驱离子的质荷比相联系。

6.根据权利要求1到5中任何一项的鉴定糖链结构的方法，其中只有在测量的MSn碎片图谱中峰强度不低于预定值的MSn碎片离子进行鉴定方法。

7.根据权利要求1到6中任何一项的鉴定糖链结构的方法，其中糖链的理论组成从测量的MSn碎片图谱中计算出，并基于此，在存储于数据库中的参考MSn+1碎片图谱中，将要比较的图谱被预先限制。

8.根据权利要求1到7中任何一项的鉴定糖链结构的方法，其中所述碎裂质谱分析的碎裂能量被设定为不小于依赖于所述先驱离子的预定值。

9.权利要求8的鉴定糖链结构的方法，其中所述碎裂能量的预定值被存储于数据库中。

10.根据权利要求1到9中任何一项的鉴定糖链结构的方法，其中两个碎片图谱间的相似指数通过如下方法确定：

a)第一个碎片图谱中，质荷比在预定范围内的峰被分组在一起，在那些峰中，具有最高强度的峰被用作代表该范围的峰。

b)第二个碎片图谱中，通过与上述相同的排列(ranging)选定代表峰。

c)使两个碎片图谱在各自范围中代表峰的强度要素所组成的两个向量之间的欧几里得距离作为相异指数，并且相似指数基于相异指数而确定。

11.权利要求10的鉴定糖链结构的方法，其中关于第二碎片图谱，其相对于第一碎片图谱的相异指数不超过预定值，通过交换第一和第二图谱重复前述步骤以计算第二相异指数，并且所述相似指数基于第二相异指数而定。

12.分析糖链的质谱仪，包含：

质谱分析部分，其装备有用于容纳和碎裂离子的工具，

数据库部分，其中存储有已知糖链的MSn碎片图谱，和

数据处理部分，用于控制基于权利要求1到11中任何一项所述方法的质谱仪，并鉴定分析-目标糖链。

13.用于执行权利要求1到11中任何一项所述的方法的程序。