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TECHNISCHES GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein System für die Analyse
einer Zuckerkettenstruktur unter Verwendung eines Massenspektrometers.
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STAND DER TECHNIK
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Durch
die Veröffentlichung
von Rohsequenzdaten des menschlichen Genoms ist eine Forschungs-
und Entwicklungsphase in eine Funktions- und Strukturanalyse eines
Proteins und in eine Wechselwirkungsanalyse als eine Nach-Genom-Forschung übergegangen.
Andererseits machen ungefähr
die Hälfte
der Proteine in einem lebenden Körper eine
Modifikation mit einer Zuckerkette nach der Translation durch und
es ist klar, dass durch Durchmachen einer solchen Modifkation ihre
echte Funktion erstmals zur Geltung gebracht wird. Daher ist die Aufklärung der
Funktion eines Glykoproteins ein unerlässlicher Ansatz für die Realisierung
der Herstellung eines Genommedikaments und für eine medizinische Regenerationsanwendung.
Daher ist es für eine
nächste
Generation der Postgenomforschung notwendig, die Forschung und Entwicklung
von einem Standpunkt der "Glykoproteomics" mit dem Ziel einer
umfassenden Analyse einer Zuckerkette und eines Proteins als Ganzes
und mit der Klärung
deren Funktion durchzuführen,
und besonders wird die Entwicklung neuer Techniken gefordert, die
eine Zuckerkette, deren Funktion und Struktur gegenwärtig schwer
ist zu analysieren, schnell analysieren können.
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Eine
Zuckerkette ist bei der Stabilisierung und Lokalisation eines Proteins
stark involviert und spielt eine große Rolle für die Manifestation einer höheren Lebensfunktion
einer Zelle, wie zum Beispiel das Wirken als erkennendes Molekül auf einer
Zellenoberfläche.
Jedoch hat eine Zuckerkette eine sehr große Vielfältigkeit aufgrund der Vielfalt
der einzelnen Zuckerarten, der Wertigkeit der Bindung der einzelnen
Zuckerarten und der Unterschiede bei dem Bindungsformat und des
Unterschiedes in der anomeren Struktur zwischen einzelnen Zuckerarten. Zum
Beispiel sind unter einzelnen Zuckerarten Gluckose (Glc), Galaktose
(Gal) und Manose (Man) Isomere, die das gleiche Molekulargewicht
haben. Obwohl man denkt, dass die Arten der einzelnen Zuckerarten
nicht so viele sind, sind die meisten Zuckerketten durch die Bindung
Dutzender einzelner Zuckerarten gemacht, so dass die Anzahl von
Kombinationen von Bindungen extrem groß ist. Zusätzlich dazu gibt es viele Isomere
aufgrund von Aststrukturen sowie Isomere, wie zum Beispiel α- und β-Isomere, und einige
Isomere sind durch Sulfatation und Phosporylierung modifiziert worden.
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Zusätzlich zu
diesen Vielfältigkeiten
macht die Tatsache, dass die Menge von Zuckerketten extrem klein,
ist deren Analysen weiter schwierig, wobei gegenwärtig kein
Verfahren für
die Erweiterung von Zuckerketten entwickelt worden ist.
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Bis
jetzt sind verschiedene Verfahren für die Strukturanalyse von Zuckerketten
entwickelt worden, unter denen eines mit Verwendung einer Hydrolase und
einer HPLC und eines mit Verwendung einer Lectinaffinitätschromatographie,
einer Methylierungssanalyse, einer Massenspektroskopie und einer
NMR enthalten sind (Okura und Kameyama „Current Situation and Future
of Sugar Chain Structure Analysis", Bioindustry, CMC Publisher, January 2003,
18–24).
Jedoch wird die gesamte Strukturinformation einer Zuckerkette nicht
durch einen Prozess allein gewonnen und es ist notwendig, eine Analyse unter
Kombinierung einer Mehrzahl von Prozeduren durchzuführen. Aus
diesem Grund sind ein mühsamer
Arbeitsablauf und ein langer Zeitraum notwendig, um eine Zuckerkette
zu analysieren und eine Analyse mit hohem Durchsatz kann nicht durchgeführt werden.
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Unter
dem Gesichtspunkt einer hohen Geschwindigkeit und Einfachheit eines
Arbeitsablaufes wird erwartet, dass unter den vorerwähnten verschiedenen
Analyseverfahren diejenigen unter Verwendung der Massenspektroskopie
die Hauptrichtung der Zuckerkettenstrukturanalyse in der Zukunft
sein werden.
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Jedoch
können
in einer konventionellen Massenspektroskopie durch MS/MS (MS2) anomere Isomere und strukturelle Isomere
nicht unterschieden werden.
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Dann
wird erwartet, dass die Information einer komplizierten Struktur
einer Zuckerkette durch Wiederholung der Schritte von [(i) Fragmentierung]-[(ii)
Massenmessung und Auswahl des Fragmentions]-[(iii) weitere Fragmentierung]
eines Zuckerkettenions (MSn) gewonnen wird.
(Y. Takegawa et al., „Structural
assignment of isomeric 2-aminopyridin-derivatized oligosaccharides
using MSn spectral matchin",
Rapid Commun. Mass Spectrum, 2004; 18:385–391). Da jedoch Dutzende oder
auch Hunderte von fragmentierten Ionen bei jeder Fragmentierung
erzeugt werden, ist es nicht praktikabel, eine weitere Fragmentierung
mit allen diesen Fragmentionen durchzuführen und einen Vergleich (Musterabgleich)
von allen Fragmentionen durchzuführen.
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Auch
wenn weitere Fragmentierungen auf größere fragmentierte Ionen begrenzt
werden, ist eine große
Menge an Probe notwendig, wenn die Fragmentierungen durch Ausprobieren
durchgeführt werden.
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Zum
Beispiel ist es aus der
WO
02/09144 A2 bekannt, ein dreifaches Quadrupol-Masenspektrometer
für eine
Massenanalyse in mehreren Schritten zu verwenden.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Eine
Aufgabe, die durch die vorliegende Erfindung gelöst werden soll, ist ein System
für die
Analyse einer Zuckerkette zu schaffen, das die gesamte Primärstruktur
einer Zuckerkette einfach und schnell mit einer kleinen Probenmenge
bestimmen kann.
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Durch
intensive Arbeit, eine Zuckerkettenstruktur schnell allein durch
Massenspektroskopie zu bestimmen, haben die Erfinder ein Verfahren
für eine schnelle
und präzise
Gewinnung der gesamten Primärstrukturinformation
einer Zuckerkette, die die Information der Isomere und die Information
der Bindungsposition der Monosaccharide beinhaltet, durch Auswahl
eines geeigneten Ions (oder Ionen) unter produzierten Fragmentionen
und Durchführen
einer weiteren Fragmentierung desselben (oder derselben) aufgefunden.
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Das
heißt
die vorliegende Erfindung, die für die
Lösung
der oben erwähnten
Aufgabe gemacht worden ist, ist ein Verfahren zur Identifikation
einer ein Analyseobjekt bildenden Zuckerkettenstruktur unter Verwendung
eines Massenspektrometers durch Vergleich eines gemessenen MS3-Fragmentmusters
mit einem in einer Datenbank gespeicherten Referenz-MS3-Fragmentmuster,
wobei das gemessene MS3-Fragmentmuster
ein Fragmentierungsmuster eines jeden MS2-Fragmentions ist, das in einem gemessenen
MS2-Fragmentmuster enthalten ist, das durch Ausführen einer Fragmentierungsmassenspektroskopie
auf der das Analyseobjekt bildenden Zuckerkette gewonnen wurde,
dadurch gekennzeichnet, dass unter einer Mehrzahl von MS2-Fragmentionen, die
in einem gemessenen MS2-Fragmentmuster enthalten sind, eine Fragmentierungsmassenspektroskopie
nur mit den ausgewählten MS2-Fragmentionen
durchgeführt
wird, wobei jedes der ausgewählten
MS2-Fragmentionen eine Mehrzahl von in einer Datenbank gespeicherten
Referenz-MS3-Fragmentmustern hat, deren gegenseitiger Ähnlichkeitsindex
gleich oder kleiner ist als ein vorbestimmter Wert, wobei die Mehrzahl
der Referenz-MS3-Fragmentmuster das gleiche Vorläuferion-Masse-zu-Ladung-Verhältnis haben
wie das des ausgewählten
MS2 Fragmentions.
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Weil,
wie oben beschrieben, es eine Vielzahl von Isomeren bei einer Zuckerkette
gibt, hatte man geglaubt, dass es schwer sei, diese durch die Massenspektroskopie
zu unterscheiden. Jedoch wurde es klar, dass ein Unterschied in
einem Fragmentmuster durch eine wiederholende Fragmentierung erzeugt
wird. Gegenwärtig
glaubt man, dass durch die Messung der Fragmentmuster bis zu MS3
die Struktur der meisten Zuckerketten identifiziert werden kann.
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Jedoch
muss, um ein MS3-Fragmentmuster zu gewinnen, eine Zweiphasenfragmentierung
von einer ursprünglichen
Zuckerkette durchgeführt
werden, wobei die Anzahl von MS3-Fragmentmustern, die von einer
Zuckerkette gewonnen wurden, groß ist. Der unorganisierte Musterabgleich
von einem von einer unbekannten Zuckerkette gewonnenen MS3-Fragmentmuster
(das als das „gemessene MS3-Fragmentmuster" bezeichnet wird)
und einem in einer Datenbank gespeicherten MS3-Fragmentmuster (das
als das „Referenz-MS3-Fragmentmuster" bezeichnet wird)
ist nicht nur zeitaufwändig,
sondern könnte
auch den richtigen Musterabgleich (oder Identifikation) behindern.
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Dann
wird in der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, unter
einer Mehrzahl von MS2-Fragmentionen, die in einem gemessenen MS2-Fragmentmuster
enthalten sind, eine Fragmentierungsmassenspektroskopie auf nur
ausgewählten MS2-Fragmentionen
durchgeführt,
wobei jedes der ausgewählten
MS2-Fragmentionen eine Vielzahl von Referenz-MS3-Fragmentmustern
hat, deren gegenseitiger Ähnlichkeitsindex
ein vorher bestimmter Wert (erster bestimmter Wert) oder kleiner
ist, worbei die Vielzahl von Referenz-MS3-Fragmentmustern das gleiche
Vorläuferion-Masse-zu-Ladungsverhältnis hat,
wie das des ausgewählten
MS2-Fragmenions.
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Hierin
kann in einem Fall, in dem es drei oder mehr solcher MS3-Fragmentmuster gibt,
der höchste der Ähnlichkeitsindizes
irgendeiner Kombination zweier MS3-Fragmentmustern als der oben
erwähnte Ähnlichkeitsindex
angenommen werden.
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In
dem Fall, in dem der gegenseitige Ähnlichkeitsindex eines in der
Datenbank gespeicherten Referenz-MS3-Fragmentmusters groß ist und
ein MS3-Fragmentmuster durch die Durchführung einer MS3 Analyse einer
unbekannten Probe gemessen wird, ist es schwierig zu bestimmen,
dass das gemessene MS3-Fragmentmuster mit irgendeinem von diesen übereinstimmt.
Gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung kann die Bestimmung durch die Durchführung einer
Fragmentierungsmassenspektroskopie eines MS2-Fragmentions, das als
erstes einen kleinen gegenseitigen Ähnlichkeitsindex von MS3-Fragmentmustern
(oder in der Reihenfolge von einem kleineren zu einem höheren Ähnlichkeitsindex)
hat, und durch die Durchführung
eines Vergleiches der MS3 Fragmentmuster (Abgleich) schneller durchgeführt werden.
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Es
ist wünschenswert,
den vorerwähnten
gegenseitigen Ähnlichkeitsindex
der MS3-Fragmentmuster in der Datenbank in Verknüpfung mit dem Masse-zu-Ladungsverhältnis des
Vorläuferions
vorab zu speichern. Dadurch kann ein schnellerer Musterabgleich
durchgeführt
werden.
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Unter
Beachtung des vorerwähnten
ausgewählten
MS2-Fragmentions,
ist es wünschenswert, diese
nach einem vorbestimmten Standard einzuordnen. Die Einordnung kann
basierend auf dem vorerwähnten
gegenseitigen Ähnlichkeitsindex
der MS3 Fragmentmuster durchgeführt
werden. Alternativ könnte
die Anzahl der in der Datenbank gespeicherten MS3-Fragmentmuster
bei der Erstellung der Einordnung berücksichtigt werden. Die Fragmentierungsmassenspektroskopien
wer den sukzessive gemäß dieser
Einordnung durchgeführt,
und wenn der Ähnlichkeitsindex
zwischen dem durch eine Analyse gewonnenen MS3-Fragmentmuster einer unbekannten Probe
und einem in der Datenbank gespeicherten MS3-Fragmentmuster nicht
kleiner ist als ein vorbestimmter Wert (zweiter bestimmter Wert),
ist die Analyse hier vervollständigt
und die Zuckerkettenstruktur basierend auf dem abgeglichenen Muster
identifiziert.
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Es
ist wünschenswert
nur solche MS2-Fragmentionen anzunehmen, die eine nicht kleinere
Peakintensität
in einem gemessenen MS2 Fragmentmuster haben als ein vorher bestimmter
Wert für
die Aufgabe solcher Bearbeitungen.
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Vor
der Identifikation gemäß der vorher
erwähnten
Prozedur ist es wünschenswert,
eine theoretische Zusammensetzung der Zuckerkette aus dem gemessenen
MS2-Fragmentmuster zu berechnen (eingeschlossen der Peak des Vorläuferions) und
hierauf beruhend diejenigen auszuwählen und auf sie zu beschränken, die
mit dem gemessenen MS2-Fragmentmuster
unter den MS2-Fragmentmustern und dem gemessenen Fragmention und
den in der Datenbank gespeicherten MS2-Fragmentionen verglichen werden sollen.
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Das
oben erwähnte
Verfahren zeigt einen Leitfaden für die Durchführung einer
weiteren Fragmentierungsmassenspektroskopie der MS2-Fragmentionen. Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung kann gleichzeitig in weiteren
Fragementierungsphasen verwendet werden, um zu bestimmen, unter
welchen erzeugten Fragmentionen (MSn-Fragmentionen) eine weitere Fragmentierungsmassenspektroskopie
als erstes durchgeführt
werden soll. Wie vorher beschrieben, glaubt man, dass die meisten
Zuckerkettenstrukturen durch den Vergleich von MS3-Fragmentmustern identifiziert
werden können. Aber
es ist manchmal notwendig, für
einige Zuckerketten, die kompliziert sind oder einen feinen Unterschied
in den isomeren Strukturen aufweisen, eine MS4- Fragmentierung oder weitere durchzuführen. In diesem
Fall kann dessen Effizienz unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden
Erfindung als Leitfaden verbessert werden.
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Wenn
eine Fragmentierungsmassenspektroskopie in jeder Phase wie oben
beschrieben durchgeführt
wird, ist es wünschenswert,
die Fragmentierungsenergie des Vorläuferions nicht kleiner als
einen vorher bestimmten Wert einzustellen, der gemäß dem Vorläuferion
bestimmt worden ist. Durch Einstellung der Energie nahe dem Wert,
bei welchem das Vorläuferion
fast vollständig
fragmentiert wird, wird die Reproduzierbarkeit eines durch eine
Fragmentierung erzeugten Fragmentmusters besser und die Identifikation
einer Zuckerkettenstruktur verlässlicher.
Es ist wünschenswert
die vorbestimmte Fragmentierungsenergiewerte in der Datenbank in
Zuordnung zu den Vorläuferinnen
zu speichern.
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Von
der Massenspektroskopie wird erwartet, dass sie ein Verfahren ist,
das eine Strukturanalyse von komplizierten und verschiedenen Zuckerketten schnell
durchführen
kann. Um aber eine richtige Identifikation durchzuführen, ist
es notwendig eine [(i) Fragmentierung]-[(ii) Massenmessung und Auswahl von
fragmentierten Ionen]-[(iii) weitere Fragmentierung] eines Zuckerkettenions
zu wiederholen und einen Musterabgleich bis hin zu wenigstens MS3
Fragmentmustern durchzuführen.
Weil jedoch Dutzende oder Hunderte von Fragmentionen bei jeder Fragmentierung
erzeugt werden, ist es nicht praktikabel, eine weitere Fragmentierung
aller dieser fragmentierten Ionen durchzuführen und einen Vergleich (Musterabgleich)
durchzuführen.
Auch wenn die weitere Fragmentierung auf größere fragmentierte Ionen limitiert
ist, wird eine große
Menge der Probe notwendig, wenn die Fragmentierungen durch Ausprobieren durchgeführt werden.
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Das
Verfahren einer Analyse einer Zuckerkettenstruktur gemäß der vorliegenden
Erfindung gibt einen nützlichen
Leitfaden beim Durch führen
einer weiteren Fragmentierung, wodurch man die objektive Identifikation
schnell erreichen kann. Weil unnötige
Analysen verhindert werden können,
kann außerdem
der Verbrauch einer Probe unterdrückt und auch eine Probe in
einer kleinen Menge adäquat identifiziert
werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
ein schematischer Aufbau einer Vorrichtung für die Durchführung der
vorliegenden Erfindung.
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2 ist
ein gemessenes MS2-Fragmentmuster, das in einem Beispiel der vorliegenden
Erfindung aufgenommen wurde.
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3 sind
in einer Datenbank gespeicherte Referenz MS2-Fragmentmuster, die dem vorerwähnten gemessenen
MS2-Fragmentmuster
und deren Strukturmodellen entsprechen.
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4 ist
der Vergleich vom MS3-Fragmentmustern, die das gleiche Vorläuferion
des MS2-Fragmentions haben.
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5 ist
ein gemessenen MS3-Fragmentmuster eines MS2-Fragmentions bei m/z = 1280.
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6 sind
in der Datenbank gespeicherte MS3-Fragmentmuster, die dem vorerwähnten gemessenen
MS3-Fragmentmuster und deren Strukturformel entsprechen.
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7 sind
Zuckerkettenstrukturformeln von zwei Arten von Proben, die für die Verifizierung
des Berechnungsalgorithmus eines Ähnlichkeitsindexes (Unähnlichkeitsindex)
von zwei Fragmentmustern (Spektren) verwendet wurden.
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8 ist
eine Tabelle der Berechnungsergebnisse des Unähnlichkeitsindexes der Proben.
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9 sind
Zuckerkettenstrukturformeln für weitere
zwei Arten von Proben, die für
die Verifizierung des vorerwähnten
Algorithmus verwendet werden.
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10 ist
eine Tabelle der Berechnungsergebnisse des Unähnlichkeitsindexes der Proben.
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11 sind
Zuckerkettenstrukturformeln von noch weiteren zwei Arten von Proben,
die für
die Verifizierung des vorerwähnten
Algorithmus verwendet wurden.
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12 ist
eine Tabelle von Berechnungsergebnissen des Unähnlichkeitsindexes der Proben.
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13 sind
Zuckerkettenstrukturformeln von noch weiteren drei Arten von Proben,
die für
die Verifizierung des vorher erwähnten
Algorithmus verwendet wurden.
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14 ist
eine Tabelle der Berechnungsergebnisse des Unähnlichkeitsindexes der Proben.
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15 ist
ein Flussdiagramm, das den Ablauf eines Beispiels des Verfahrens
der gegenwärtigen
Erfindung zeigt.
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BESTE WEISE FÜR DIE AUSFÜHRUNG DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung wird nachstehend im Einzelnen im Wege eines
Beispieles beschrieben. 1 zeigt einen schematischen
Aufbau eines Zuckerkettenstrukturanalysators zur Durchführung der vorliegenden
Erfindung. Der Analysator beinhaltet einen Massenspektrometerteil
MS und einen Analysatorteil ANL. Das Massenspektrometer MS ist mit
einem matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) Ionisator,
einer Quatropolionenfalle (QIT) und einem time of flight (TOF) Massenspektrometer ausgerüstet und
der Analysatorteil ANL beinhaltet eine Datenbank DB. Viele Massenspektrometermuster
(Fragmentuster) von Zuckerkettenionen, die eine bekannte Struktur
haben, sowie deren ers te und zweite (MS2 und MS3) fragmentierte
Ionen sind in der Datenbank gespeichert. Außerdem ist der Analysatorteil
ANL mit einem Musterabgleicher (PM) für den Vergleich von einem von
dem Massenspektrometer MS gesendeten Fragmentmuster (Daten) mit einem
in der Datenbank gespeicherten Fragmentmuster (Daten) und für die Berechnung
deren Ähnlichkeitsindizes
versehen. Der Massenspektrometerteil MS ist mit einem Steuerungsteil
CNTL für
die Steuerung des gesamten Analysators ausgerüstet.
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Unter
Verwendung dieses Analysators wird nun ein Verfahren für die Durchführung einer
Strukturanalyse von unbekannten Zuckerketten unter Verwendung des
Flussdiagramms in 15 erklärt. Als erstes wird eine zu
identifizierende unbekannte Zuckerkette von einer biologischen Probe,
die Glykoproteine oder Glykolipide enthält, freigesetzt unter Verwendung
eines geeigneten Nickenzyms oder unter Ausnutzung einer geeigneten
chemischen Spaltungsreaktion gelöst.
Die resultierende Zuckerkettenprobe wird wenn nötig gelabelt, mit einem Matrixmittel
gemischt und dem Massenspektrometer MS unterworfen. In dem Massenspektrometerteil
MS wird die Probe mit dem MALDI ionisiert und eine Massenspektroskopie
mit dem TOF durchgeführt.
Dadurch wird das Masse-zu-Ladung-Verhältnis ([Masse m]/[Ladung z])
des Ions (Vorläuferions)
der Zuckerkette gemessen. Weiterhin werden dessen Fragmentionen
durch die Durchführung
einer Fragmentierung in der Ionenfalle QIT erzeugt und das Masse-zu-Ladung-Verhältnis und
die Intensität
eines jeden Fragmentions gemessen. Dadurch wird ein MS/MS Fragmentmuster
(gemessenes MS2-Fragmentmuster, MS2FPm) gewonnen (Schritt S1). Ein
Beispiel des MS2-Fragmentmusters wird in 2 gezeigt.
In diesem Beispiel ist das Masse-zu-Ladung-Verhältnis m/z des Vorläuferions
(Ion der unbekannten Zuckerkettenprobe) 2147,8. Daten des MS2-Fragmentmusters
werden von dem Massenspektrometer MS zu dem Analysatorteil ANL übermittelt.
In dem Analysatorteil ANL werden von den Daten des MS2 Fragmentmusters,
- 1. das Masse zu Ladung-Verhältnis des Vorläuferions,
- 2. das Masse zu Ladung-Verhältnis
eines jeden Fragmentions, und
- 3. die Intensität
jedes Fragmentions entnommen.
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Der
Analysatorteil ANL berechnet theoretische Zusammensetzungen der
Zuckerkette, basierend auf diesen Daten zusammen mit den Informationen
des Labelmittels, des Nickenzyms und des Reagens, die bei der Vorbereitung
der Probe verwendet wurden (Schritt S2). Die Informationen des Labelmittels
und Ähnliches
könnte
in das Massenspektrometer MS oder in den Analysatorteil ANL durch
einen Benutzer eigegeben werden.
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In
dem Fall des Beispiels in 2 wird von dem
Masse-zu-Ladung-Verhältnis 2147,
8 des Vorläuferions
eine theoretische Zusammensetzung der Zuckerkette als (Hex)5(HexNAc)6
bestimmt.
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Danach
wird in dem Analsysatorteil ANL ein Ähnlichkeitsindex zwi schen
jedem der MS2-Fragmentmuster aller Zuckerkettenisomere (Referenz MS2-Fragmentmuster,
MS2FPd), die die berechnete theoretische Zusammensetzung haben,
und dem von dem Massenspektrometer MS gesendeten MS2-Fragmentmuster
(MS2FPm) berechnet. Das Verfahren der Berechnung des Ähnlichkeitsindexes S
(oder des Unähnlichkeitsindex
D) von zwei Fragmentmustern wird später im Detail erklärt. Danach werden
nur solche Referenz MS2-Fragmenttmuster, die einen Ähnlichkeitsindex
S mit dem gemessenen MS2-Fragmentmuster haben, der nicht kleiner
ist als ein vorher bestimmter Wert S21, vorläufig ausgewählt (Schritt S3).
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Wenn
die theoretische Zusammensetzung (Hex)5(HexNAc)6 ist, sind 4 MS2-Fragmentmuster von
Zuckerkettenisomeren, wie in 3 gezeigt,
in der Datenbank DB des Analysatorteils ANL gespeichert. Ein Zuckerkettenstrukturmodell,
das dem jeweiligen Fragmentmuster ent spricht, ist über dem Muster
in 3 gezeigt. Nur die Fragmentmuster c und d haben
einen größeren Ähnlichkeitsindex
mit dem gemessenen Fragmentmuster aus 2 als der vorher
bestimmte Wert S21.
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Von
so vorläufig
ausgewählten
MS2 Referenzfragmentmustern wird eine vorher bestimmte Anzahl von
Fragmentpeaks in der Reihenfolge von hoher zu niedriger Intensität ausgewählt (Schritt
S4). Hierbei können
beim Auswählen
der MS2-Fragmentpeaks die Anzahl der Peaks vorher bestimmt werden oder
Peaks, die ein vorher bestimmtes Intensitätsniveau (relativ zum Maximumpeak)
oder höher
haben, ausgewählt
werden. Von den zwei MS2-Referenzfragmentmustern aus 3c und d werden die folgenden sechs Fragmentpeaks
ausgewählt.
m/z
= 2129
m/z = 1848
m/z = 1782
m/z = 1645
m/z
= 1483
m/z = 1280
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Unter
so ausgewählten
Fragmentpeaks werden Fragmentionen (MS2-Fragmentionen), für welche
eine Fragmentierungsmassenspektroskopie in dem Massenspektrometer
MS dann durchgeführt werden
soll, ausgewählt.
Hierin wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet.
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In
der Datenbank DB gespeicherte MS3-Fragmentmuster, deren Vorläuferion
das dem vorläufig
ausgewählten
Fragmentpeak entsprechende Fragmention ist, werden ausgelesen (normalerweise
werden eine Mehrzahl von MS3-Fragmentmustern bezüglich eines Vorläuferions
gespeichert), und ein Ähnlichkeitsindex
(nicht ein später
beschriebener Unähnlichkeitsindex
D, sondern ein Ähnlichkeitsindex,
der einen höheren
Wert zeigt, wenn zwei Muster ähnlich
sind) S wird zwischen ihnen berechnet. Und nur MS2 Fragmentionen,
die einen nicht größeren Ähn lichkeitsindex
als einen vorher bestimmten Wert S22 haben, werden der Fragmentierungsmassenspektroskopie
in dem Massenspektrometer MS (Schritt S5) unterworfen. Zu diesem
Zeitpunkt werden diese MS2 Fragmentionen in der Reihenfolge von
kleineren zu größeren Ähnlichkeitsindizes
(Schritt S6) aufgelistet.
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Hinsichtlich
der vorerwähnten
ausgewählten sechs
Fragmentpeaks werden den zugehörigen Peaks
entsprechende MS3-Fragmentmuster in 4 gezeigt.
Unter diesen haben zwei von dem Vorläuferion m/z = 1483 abgeleitete
MS3 Fragmentmuster und zwei von dem Vorläuferion m/z = 1280 abgeleitete
MS3 Fragmentmuster einen gegenseitigen niedrigeren Ähnlichkeitsindex
als der von MS3 Fragmentmustern, die von einem anderen Vorläuferion
abgeleitet worden. Wenn diese in der Datenbank gespeicherten MS3-Fragmentmuster
mit dem gemessenen MS3-Fragmentmuster einer unbekannten Probe verglichen
werden (Musterabgleich), ist es leichter zu bestimmen, dass das
gemessene MS3-Fragmentmuster mit einem der MS3-Referenzfragmentmuster übereinstimmt
in dem Fall, in dem der Ähnlichkeitsindex
der zwei MS3 Referenzfragmentmuster klein ist (das heißt, die
Fragmentmuster sind entfernt voneinander) als in dem Fall, in dem zwei
Muster gegenseitig ähnlich
sind.
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4 zeigt
zwei MS3-Fragmentmuster für jedes
Vorläuferion.
Es ist möglich,
dass drei oder mehr MS3-Fragmentmuster in der Datenbank DB für ein Vorläuferion
gespeichert sind. In diesem Fall könnte ein Ähnlichkeitsindex zwischen beliebigen zwei
MS3-Fragmentmustern als der Index verwendet werden. Es ist aber
wünschenswert,
den größten Ähnlichkeitsindex
zwischen irgendwelchen zwei MS3 Fragmentmustern zu verwenden, weil
in diesem Fall die Ähnlichkeitsindizes
zwischen anderen MS3 Fragmentmustern kleiner sind als dieser. Das
ermöglicht einen
sicheren Mess/Referenzmusterabgleich.
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In
dem Fall von 4 ist der Ähnlichkeitsindex zwischen den
MS3-Fragmentmustern kleiner in dem Fall von m/z = 1280. Daher wird
das MS3-Fragmention als erstes festgesetzt und das MS2-Fragmention
m/z = 1483 als zweites festgesetzt. Basierend auf den Ergebnissen
einer solchen Auswahl und Rangordnung sendet der Analysatorteil
ANL Daten des Masse-zu-Ladung-Verhältnisses des Vorläuferions,
das dann der Fragmentierungsmassenspektroskopie unterworfen werden
soll, an das Massenspektrometer MS. In dem Massenspektrometer werden gemäß den von
dem Analysatorteil ANL gesendeten Daten nur die bestimmten Fragmentionen
(in dem Fall des obigen Beispiels das Fragmention m/z = 1280) unter
den MS2 Fragmentionen, die in der Ionenfalle QIT erzeugt worden
sind, in der Ionenfalle QIT belassen, und eine MS3-Massenspektroskopie wird
mit deren Fragmentierung mit einer vorher bestimmen Energie (Schritt
S7) durchgeführt.
Ein damit gewonnenes gemessenes MS3-Fragmentmuster von m/z = 1280
(korrekt m/z = 1280,4) ist in 5 gezeigt.
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Daten
von gemessenen MS3 Fragmentmuster werden aus dem Massenspektrometer
MS an den Analysatorteil ANL geschickt bzw. Ähnlichkeitsindizes zwischen
zwei Referenz-MS3-Fragmentmustern der zweiten Stufe aus 4 werden
berechnet und mit einem vorher bestimmten Schwellwert S31 verglichen
(Schritt S8). In diesem Fall hat, wie in 6 gezeigt,
(a) einen höheren Ähnlichkeitsindex
mit dem gemessenen MS3 Fragmentmuster.
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Daher
wird die Zuckerkette der Analyseprobe zu diesem Zeitpunkt als (Hex)5(HexNAc)6
bestimmt, das die Struktur, wie in dem oberen Abschnitt von 6(a) gezeigt, hat (Schritt S9). Hiernach
wird der Algorithmus für
die Berechnung des Ähnlichkeitsindexes
zwischen einem gemessenen Fragmentmuster einer unbekannten Probe
und einem in der Datenbank gespeicherten Referenzfragmentmuster, das
in dem vorerwähnten
Identifikationsprozess verwendet wurde, erklärt. In der fol genden Erklärung des
Algorithmus wird das vorerwähnte „Fragmentmuster" als „Spektrum" bezeichnet.
- (1) Hinsichtlich aller gemessener Spektren
und Referenzspektren werden Peaks in einem bestimmten Bereich von
m/z Werten in einen gruppiert (oder verschmolzen). Der Peak, der
die höchste
Intensität
unter diesen Peaks hat, wird als der Peak nach dem Zusammenfassen
betrachtet.
- (2) Angenommen die Intensitäten
von n Peaks (P1, P2, ..., Pn) des gemessenen Spektrums nach dem
Zusammenfassen sind xi (i = 1 – n),
wird der Vektor X des gemessenen Spektrums als
X = (x1, x2,
..., xn) erzeugt.
- (3) Hinsichtlich des Referenzspektrums wird ein Peak des Referenzspektrums,
der dem Peak Pi des gemessenen Spektrums entspricht, bestimmt und
der Vektor Y des Referenzspektrums aus den Intensitäten der
Peaks als
Y = (y1, y2, ..., yn) erzeugt.
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Der
Unähnlichkeitsindex
D1 zwischen zwei Spektren wird durch die euklidische Distanz zwischen
zwei Vektoren X und Y wie folgt gewonnen. D1
= Σ(i =
1 – n)(xi – yi)2
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Weil
der hier berechnete Wert D1 null ist, wenn beide Spektren vollständig übereinstimmen und
der Wert D1 größer wird,
wenn die Differenz der zwei Spektren größer wird, wird der Wert D1
als ein „Unähnlichkeitsindex" ausgedrückt. Selbstverständlich kann
der Wert ein Maß der Ähnlichkeit
zwischen den zwei Spektren sein. Um die Ähnlichkeit von zwei Spektren
auszudrücken,
die größer wird,
wenn sie sich annähern,
kann der reziproke Wert des Unähnlichkeitsindex
verwendet werden.
- (5) In dem wie oben berechneten
Unähnlichkeitsindex
D1 trifft eine bekannte Zuckerkettenstruktur (Referenzspektrum)
mit einem Peak, der in dem Spektrum einer unbekannten Probe nicht
vorhanden ist (gemessenes Spektrum), einen kleinen Unähnlichkeitsindex
(großer Ähnlichkeitsindex). Daher
wird ein Unähnlichkeitsindex
D2 durch den Austausch der Vektoren des gemessenen Spektrums und
des Referenzspektrums erneut berechnet. D. h. hinsichtlich von Referenzspektren,
die einen nicht größeren Unähnlichkeitsindex
D1 als einen vorher bestimmten Schwellwert haben, wird der vorerwähnte Vektor
X aus dem Referenzspektrum und der vorher erwähnte Vektor Y aus dem gemessenen
Spektrum berechnet und der Unähnlichkeitsindex
D2 wird gewonnen.
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Die
Effektivität
des vorerwähnten
Verfahrens der Berechnung des Unähnlichkeitsindexes
(Ähnlichkeitsindexes)
wurde durch tatsächliche
Daten verifiziert. Eine für
die Verifikation verwendete Probe ist ein Spektrum, das durch eine
der Massenspektroskopie unterworfene mit Pa gelabelten Zuckerkette gewonnen
wurde. Unter Zulassung, dass der Bereich des m/z Wertes beim Zusammenfassen
0,8 ist und unter Zulassung, dass der Bereich des m/z Wertes, bei
welchem die Peaks als der gleiche betrachtet wird 0,5 ist, wurde
die Berechnung durchgeführt.
Der Intensitätswert
wird durch den Prozentflächenwert
eines Peaklistenoutputs durch ein Massenspektrometer AXIMA/QIT erhalten.
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(1) Vergleich zwischen 0NA-00001a(100.1)
und 0NA/00001b(100.2)
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Ihre
Strukturformeln werden in 7a und 7b gezeigt. Hinsichtlich dieser zwei isomeren
Strukturen werden der Unähnlichkeitsindex
zwischen Spektren von zwei Proben, die die gleiche Struktur haben,
aber in verschiedenen Experimenten aufgenommen wurden, und der Unähnlichkeitsindex
zwischen zwei Spektren von zwei isomeren Proben berechnet. Die Ergebnisse
werden in der Tabelle von 8 gezeigt.
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Die
erste Zeile der Tabelle in 8 ist das Ergebnis
der Berechnung des Unähnlichkeitsindexes eines
MS2 Spektrums von 0NA- 00001a(100.1)
(Masse-zu-Ladung-Verhältnis
des Vorläuferions
1214). Die Daten in den zentralen zwei Zellen stellen Werte von
Durchschnittsunähnlichkeitsindizes
dar, die durch Massenspektroskopieren der gleichen Probe der Massenpektroskopie
zu zwei verschiedenen Zeitpunkten gewonnen wurden, und die Daten
in den zwei rechten Zellen sind Werte ihrer Unähnlichkeitsindizes mit einem
MS2-Spektrum eines Isomers 0NA-00001b(100.2). In einem MS2-Spektrum
sind der Unähnlichkeitsindex
zwischen den gleichen Proben und der Unähnlichkeitsindex zwischen den
Isomerenproben nicht so unterschiedlich.
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Die
zweite Zeile der Tabelle in 8 ist das Ergebnis
der Berechnung eines Unähnlichkeitsindexes
bei Betrachtung eines Massenspektroskopiespektrums (MS3 Spektrum),
bei welchem ein Fragmention von 0NA-00001a(100.1) bei m/z = 915
weiter fragmentiert wurde. Ebenso sind die Daten in den zwei zentralen
Zellen Durchschnittähnlichkeitsindizes,
die durch Massenspektroskopieren der gleichen Probe zu zwei verschiedenen
Zeitpunkten gewonnen wurden, und die Daten der Zellen auf der rechten
Seite sind deren Unähnlichkeitsindizes
mit einem MS3-Spektrum
eines Isomers 0NA-0001b(100.2) bei dem gleichen m/z = 915. Wenn
bis zu dem MS3-Spektrum analysiert wird, ist der Unähnlichkeitsindex
zwischen isomeren Proben größer als
der Unähnlichkeitsindex
zwischen den gleichen Proben. Die dritte Zeile der Tabelle in 8 ist
das Ergebnis hinsichtlich des Vorläuferions m/z = 1196, die das
gleiche Ergebnis zeigt.
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Die
vierte bis sechste Zeile der Tabelle in 8 zeigt
die Ergebnisse der gleichen Berechnung bei Betrachtung von 0NA-00001b(100.2). Bei
dem Ergebnis der Messung des MS2-Spektrums unter Verwendung des
Vorläuferions
bei m/z = 1214 und eines MS3-Spektrums
unter Verwendung des Vorläuferions
bei m/z = 915 wird kein Unterschied zwischen dem Wert des Unähnlichkeitsindexes
zwischen den gleichen Proben und dem Wert des Unähnlichkeitsindexes zwischen Isomeren
gesehen, aber in den Ergebnissen des MS3-Spektrums unter Verwendung des
Vorläuferions
bei m/z = 1196 ist der Unähnlichkeitsindex
zwischen den gleichen Proben kleiner als der zwischen den Isomeren.
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(2) Vergleich zwischen ONG-00001c(100.3)
und ONG-00001d(100.4)
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Strukturformeln
von beiden sind in 9c und 9d gezeigt. Die Ergebnisse von ähnlichen
Berechnungen der Unähnlichkeitsindizes
sind in der Tabelle in 10 gezeigt. Bei diesen Proben
ist der Unähnlichkeitsindex
zwischen den gleichen Proben sehr viel kleiner als in jedem Fall
zwischen den Isomerproben.
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(3) Vergleich zwischen ONG-00001e(310.2)
und ONG-00001f(310.3)
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Strukturformeln
von beiden sind in 11e und f gezeigt,
und Berechnungsergebnisse der Unähnlichkeitsindizes
sind in der Tabelle in 12 gezeigt. Hinsichtlich dieser
Proben ist in jedem anderen Fall als dem Fall, in dem das Vorläuferion
von m/z = 1280 verwendet worden ist, der Unähnlichkeitsindex zwischen den
gleichen Proben größer als
der zwischen Isomerproben. Das ist so, weil Peaks beider Proben
leicht unterschiedlich erscheinen und der Unterschied durch den
Zusammenfügungsprozess
verstärkt
wird. In dem MS3-Spektrum, unter Verwendung des Vorläuferions
m/z = 1280, ist der Unähnlichkeitsindex
zwischen den gleichen Proben kleiner als der Unähnlichkeitsindex zwischen den
Isomerproben. Daher kann dies die zwei Isomere unterscheiden.
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(4) Vergleich der drei Proben von ONG-000020(400.2),
ONG-000021(400.3)
und ONG-000022(400.5)
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Entsprechende
Strukturformeln sind in 13 gezeigt.
Aus dem MS2-Spektrum können
diese drei Arten von Isomeren nicht unterschieden werden. Dennoch
können,
wenn eine MS3-Messung durch Auswahl besonderer Peaks durchgeführt wird, diese
drei Isomere unterschieden werden. Besonders in dem Fall eines MS3
Spektrums unter Verwendung, als Peak, von Vorläuferinnen von m/z = 1686, 1764
und 1967 entspricht die Struktur, die den kleinsten Unähnlichkeitsindex
(oder die am meisten ähnliche
Probe) hat, der richtigen Zuckerkettenstruktur.
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Aus
den vorerwähnten
experimentellen Ergebnissen wurde es als erstes bestätigt, dass
das vorerwähnte
Berechnungsverfahren für
die Bestimmung eines Ähnlichkeitsindexes
(Unähnlichkeitsindexes)
zwischen zwei Spektren effektiv ist. Zusätzlich wurde klar gemacht,
dass auch dann, wenn ein Strukturunterschied zwischen Isomeren nicht
durch einen Unterschied in dem Ähnlichkeitsindex
(Unähnlichkeitsindex)
von Spektren in einer MS2-Phase wiedergegeben wird, der Unterschied
in der Isomerstruktur durch Berechnung des spektralen Ähnlichkeitsindexes
(Unähnlichkeitsindexes)
mit der Durchführung
der Fragmentierungsmassenspektroskopie bis MS3 unterschieden werden
kann.