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Die
Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Massenspektrometrie.
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Tandem-Massenspektrometrie
(MS/MS) ist der Name, den man dem Verfahren der Massenspektrometrie
gegeben hat, bei dem Elternionen, die aus einer Probe erzeugt wurden,
von einem ersten Massenfilter/-Analysator ausgewählt und dann zu einer Kollisionszelle
weitergeleitet werden, in der sie fragmentiert werden durch Kollisionen
mit neutralen Gasmolekülen,
um Tochterionen (oder „Produktionen") zu bilden. Die
Tochterionen werden dann nach ihrer Masse von einem zweiten Massenfilter/-Analysator analysiert,
und die resultierenden Tochterionen-Spektren lassen sich dazu benutzen,
die Struktur des Elternions (oder „Vorläuferions") zu bestimmen. Die Tandem-Massenspektrometrie
ist besonders nützlich
für die
Analyse komplexer Gemische wie beispielsweise Biomolekülen, da
sie das Erfordernis umgeht, vor der Massenspektralanalyse eine chemische
Reinigung vorzunehmen.
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Die
EP-0 898 297-A offenbart ein Verfahren der Tandem-Massenspektrometrie,
bei dem ein Flag für
jeden Bereich von Eltern-Masse-Ladungs-Verhältnissen gesetzt wird, der
interessierende Tochterionen bildet.
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Es
ist eine spezielle Form der Tandem-Massenspektrometrie, bezeichnet
als Elternionen-Scanning,
bekannt, bei der in einem ersten Schritt der zweite Massenfilter/-Analysator
so ausgebildet ist, daß er
als Massenfilter fungiert, demzufolge er nur Tochterionen mit einem
spezifischen Masse-Ladungs-Verhältnis
durchläßt und nachweist.
Das spezifische Massen-Ladungs-Verhältnis ist so eingestellt, daß es dem
Massen-Ladungs-Verhältnis
von Tochterionen entspricht, die als charakteristische Produkte
bekannt sind, die sich aus der Fragmentierung eines speziellen Elternions
oder Typs von Elternion ergeben. Der erste Massenfilter/-Analysator stromaufwärts bezüglich der
Kollisionszelle wird dann gescannt, während der zweite Massenfilter/-Analysator
fixiert bleibt, um das Vorhandensein von Tochterionen mit dem spezifischen
Masse-Ladungs-Verhältnis
zu überwachen.
Die Masse-Ladungs-Verhältnisse
von Elternionen, die die charakteristischen Tochterionen liefern,
lassen sich dann bestimmen. In einem zweiten Schritt kann dann ein vollständiges Tochterionen-Spektrum
für jedes
der Elternionen-Massen-Ladungs-Verhältnisse, die charakteristische
Tochterionen produzieren, dadurch erhalten werden, daß der erste
Massenfilter/-Analysator derart betrieben wird, daß er Elternionen
mit einem speziellen Massen-Ladungs-Verhältnis selektiert,
und der zweite Massenfilter-/Analysator scannt, um das resultierende
vollständige
Tochterionenspektrum aufzuzeichnen. Dies läßt sich dann für weitere interessierende
Elternionen wiederholen. Das Elternionen-Scannen ist dann nützlich,
wenn es nicht möglich
ist, Elternionen in einem direkten Massenspektrum nachzuweisen,
bedingt durch das Vorhandensein von chemischem Rauschen, welches
häufig angetroffen
wird, beispielsweise in den Elektrospray-Massenspektrum von Biomolekülen.
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Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer besitzen
einen ersten Quadrupol-Massenfilter/-Analysator, eine Quadrupol-Kollisionszelle,
in die ein Kollisionsgas eingeleitet wird, und einen zweiten Quadrupol-Massenfilter/-Analysator.
Ein weiterer Typ von Massenspektrometer (ein Hybrid-Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer)
ist bekannt, bei dem der zweite Quadrupol-Massenfilter/-Analysator
durch einen orthogonalen Flugzeit-Massenanalysator ersetzt ist.
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Wie
im folgenden gezeigt werden wird, leiden beide Typen von Massenspektrometern
beim Einsatz für
herkömmliche
Verfahren der Elternionen-Scannung und anschließenden Gewinnung eines Tochterionen-Spektrums
eines Kandidaten-Elternions an geringen Tastzyklen, was sie ungeeignet macht
für den
Einsatz bei Anwendungen, die ein höheres Arbeitszyklus erfordern,
das heißt
beim Einsatz für
Online-Chromatographieanwendungen.
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Quadrupole
besitzen einen Arbeitszyklus von annähernd 100% bei Verwendung als
Massenfilter, wobei ihr Arbeitszyklus allerdings auf etwa 0,1% sinkt,
wenn sie im Scanning-Modus
als Massenanalysator verwendet werden, um beispielsweise eine Massenanalyse
in einem Bereich von 500 Masseneinheiten vorzunehmen, wobei Spitzen
mit einer Breite von einer Masseneinheit an der Basis auftreten.
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Orthogonale
Flugbeschleunigungszeit-Analysatoren besitzen typischerweise einen
Arbeitszyklus im Bereich von 1–20%,
abhängig
von den relativen m/z-Werten der unterschiedlichen Ionen innerhalb
des Spektrums. Allerdings bleibt der Arbeitszyklus ungeachtet davon
unverändert,
daß der
Flugzeitanalysator als Massenfilter verwendet wird, um Ionen mit
einem speziellen Massen-Ladungs-Verhältnis durchzulassen, oder unabhängig davon,
ob der Flugzeitanalysator dazu dient, ein vollständiges Massenspektrum aufzuzeichnen.
Dies ist bedingt durch die Natur der Arbeitsweise von Flugzeitanalysatoren. Wenn
diese dazu dienen, ein Tochterionenspektrum aufzunehmen und aufzuzeichnen,
beträgt
der Arbeitszyklus des Flugzeitanalysators typischerweise etwa 5%.
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In
einer ersten Annäherung
beträgt
der herkömmliche
Arbeitszyklus dann, wenn es darum geht, unter Verwendung eines Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometers
Kandidaten-Elternionen
zu suchen, etwa 0,1% (der erste Quadrupol-Massenfilter/-Analysator
wird mit einem Arbeitszyklus von 0,1% abgetastet, und der zweite
Quadrupol-Massenfilter/-Analysator
fungiert als Massenfilter mit einem Arbeitszyklus von 100%). Wenn
dann ein Tochterionenspektrum für
ein spezielles Kandidaten-Elternion erhalten wird, beträgt der Arbeitszyklus
ebenfalls etwa 0,1% (der erste Quadrupol-Massenfilter/-Analysator
fungiert als Massenfilter mit einem Arbeitszyklus von 100%, und
der zweite Quadrupol-Massenfilter/-Analysator
wird mit einem Arbeitszyklus von etwa 0,1% abgetastet). Der resultierende
Arbeitszyklus beträgt
daher beim Ermitteln einer Anzahl von Kandidaten-Elternionen und beim Erzeugen eines
Tochterionenspektrums für
eines der Kandidaten-Elternionen
etwa 0,1%/2 (bedingt durch den zweistufigen Prozeß, wobei
jede Stufe einen Arbeitszyklus von 0,1% hat) = 0,05%.
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Der
Arbeitszyklus eines Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometers beim
Ermitteln von Kandidaten-Elternionen beträgt ungefähr 0,005% (der Quadrupol wird
mit einem Arbeitszyklus von etwa 0,1% abgetastet, und der Flugzeitanalysator
fungiert als Massenfilter mit einem Arbeitszyklus von etwa 5%).
Nachdem Kandidaten-Elternionen aufgedeckt wurden, läßt sich
ein Tochterionenspektrum eines Kandidaten-Elternions mit einem Arbeitszyklus
von 5% erhalten (der Quadrupol wirkt als Massenfilter mit einem
Arbeitszyklus von etwa 100%, und der Flugzeitanalysator wird mit
einem Arbeitszyklus von 5% abgetastet). Der resultierende Arbeitszyklus
beim Aufdecken einer Anzahl von Kandidaten-Elternionen und beim
Erzeugen eines Tochterspektrums von einem der Kandidaten-Elternionen beträgt etwa 0,005%
(wegen 0,005% « 5%).
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Wie
man sieht, besitzt ein Dreifach-Quadrupol einen um etwa eine Größenordnung
höheren
Arbeitszyklus als ein Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer bei
der Durchführung
herkömmlicher
Verfahren zur Elternionen-Abtastung und zum Ermitteln von bestätigenden
Tochterionenspektren von ermittelten Kandidaten-Elternionen. Allerdings
sind derartige Arbeitszyklen nicht groß genug zur Verwendung in der
Praxis und zur effizienten Echtzeit-Analyse von Daten, wie sie erforderlich
ist, wenn die Ionenquelle das Eluent einer Chromatographie-Vorrichtung
ist.
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Elektrospray-
und Laserdesorptionsmethoden haben es möglich gemacht, Molekular-Ionen mit sehr hohen
Molekulargewichten zu erzeugen, wobei Flugzeit-Massenanalysatoren vorteilhaft sind
bei der Analyse derart großmassiger
Biomoleküle
aufgrund ihres hohen Wirkungsgrads beim Aufzeichnen eines vollen
Massenspektrums. Außerdem
besitzen sie hohe Auflösung
und Massengenauigkeit.
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Andere
Formen von Massenanalysatoren wie beispielsweise Quadrupol-Ionenfallen
sind in gewisser Weise den Flugzeit-Analysatoren insofern ähnlich,
als sie ähnlich
den Flugzeit-Analysatoren keine kontinuierlichen Ausgangssignale
liefern können
und damit einen geringen Wirkungsgrad besitzen, wenn sie als Massenfilter
verwendet werden, um kontinuierlich Ionen zu senden, was ein wichtiges Merkmal
herkömmlicher
Verfahren des Elternionen-Scannings ist. Sowohl Flugzeit-Masseanalysatoren
als auch Quadrupol-Ionenfallen
lassen sich als „Massenanalysatoren
mit diskontinuierlichem Ausgang" bezeichnen.
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Aus
diesem Grund ist es wünschenswert, verbesserte
Verfahren und Vorrichtungen zur Massenspektrometrie anzugeben, wobei
gemäß einer bevorzugte
Ausführungsform
verbesserte Verfahren und Vorrichtungen geschaffen werden sollen,
die Kandidaten- Elternionen
rascher als herkömmliche Verfahren
identifizieren, die zur Verwendung in Chromatographie-Anwendungen
auf Echtzeitbasis geeignet sind.
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Gemäß einem
ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Massenspektrometrie
gemäß Anspruch
1 geschaffen.
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Nach
einer bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung läßt sich
der erste Schritt des Auffindens von Kandidaten-Elternionen mit
einem Arbeitszyklus von 2,5% ausführen (das Quadrupol-Massenfilter
besitzt einen Arbeitszyklus von 100%, und der Flugzeit-Analysator besitzt
einen Arbeitszyklus von 5%, wobei allerdings zwei Versuchsläufe ausgeführt werden
müssen,
einer bei Betrieb der Kollisionszelle in einem hohen Fragmentierungsmodus,
und ein anderer mit der Kollisionszelle im niedrigen Fragmentierungsmodus,
was den resultierenden Arbeitszyklus von 5% auf 2,5% halbiert).
Der zweite Schritt des Bestätigens
der Identität
eines speziellen Elternionen-Kandidaten durch Erstellen eines vollständigen Tochterspektrums
des Kandidaten-Elternions läßt sich
mit einem Arbeitszyklus von 5% ausführen (wieder arbeitet der Quadrupol
als Massenfilter mit einem Arbeitszyklus von etwa 100%, und der
Flugzeit-Analysator fungiert als Analysator mit einem Arbeitszyklus
von etwa 5%). Folglich sind lediglich drei Versuchsläufe erforderlich,
um eine Anzahl von Elternionen-Kandidaten aufzufinden und ein Tochterionenspektrum
von einem der Kandidaten-Elternionen zu erstellen, wobei jeder Versuchslauf
einen Arbeitszyklus von 5% besitzt. Der resultierende Gesamt-Arbeitszyklus
beträgt
daher 5%/3 = 1,67%.
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Die
bevorzugte Ausführungsform
besitzt daher einen Arbeitszyklus, der um etwa das Dreißig-Fache
besser ist als derjenige des herkömmlichen Verfahrens, welches
mit einer Dreifach-Quadrupolanordnung ausgeführt wird, und zeigt eine Verbesserung von
mehr als dem 300-Fachen im Vergleich zu dem herkömmlichen Verfahren mit einem
Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer.
Eine solche Verbesserung macht es möglich, daß die Vorrichtung und das Verfahren
gemäß der bevorzugten
Ausführungsform
in effizienter Weise im Online-Chromatographie-Zeitmaßstab eingesetzt
werden.
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Wenn
die Fragmentierungseinrichtung in der ersten Betriebsart (Modus)
arbeitet, wird eine Hochspannung an die Fragmentierungseinrichtung
gelegt, die ein Fragmentieren der hindurchgehenden Ionen veranlaßt. Wenn
allerdings die Fragmentierungseinrichtung in der zweiten Betriebsart
arbeitet, so sind anschließend
die Ionen wesentlich weniger fragmentiert, und es gibt einen höheren Anteil
an molekularen Ionen, die durchgelassen werden.
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Vorzugsweise
umfaßt
der Betrieb der Fragmentierungseinrichtung in der ersten Betriebsart
das Zuführen
einer Spannung zu der Fragmentierungseinrichtung, ausgewählt aus
der Gruppe: (i) ≥ 15
V; (ii) ≥ 20
V; (iii) ≥ 25
V; (iv) ≥ 30
V; (v) ≥ 50
V; (vi) ≥ 100 V;
(vii) ≥ 150
V; und (viii) ≥ 200
V. Vorzugsweise umfaßt
der Betrieb der Fragmentierungseinrichtung in der zweiten Betriebsart
den Schritt des Zuführens
einer Spannung zu der Fragmentierungseinrichtung, die ausgewählt ist
aus der Gruppe: (i) ≤ 5
V; (ii) ≤ 4,5 V;
(iii) ≤ 4
V; (iv) ≤ 3,5
V; (v) ≤ 3
V; (vi) ≤ 2,5
V; (vii) ≤ 2
V; (viii) ≤ 1,5
V; (ix) ≤ 1
V; (x) ≤ 0,5
V; und (xi) etwa 0 V. Allerdings kann gemäß weniger bevorzugten Ausgestaltungen
für sowohl
die erste als auch die zweite Ausführungsform der Erfindung eine
Spannung zwischen 5 V und 15 V für
die erste Betriebsart und/oder die zweite Betriebsart verwendet
werden. Unter diesen Umständen
ist zu erwarten, daß ein
Anteil der Ionen im höheren
Energiemodus tatsächlich nicht
fragmentiert wird und ähnlich
im niedrigen Energiemodus ein Anteil der Ionen fragmentiert wird.
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Um
die Ionen zu filtern, ist vorzugsweise ein erstes Massenfilter stromaufwärts bezüglich einer Fragmentierungseinrichtung,
beispielsweise eine Kollisionszelle, derart angeordnet, daß nur Ionen
mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis
(im folgenden „m/z") von mehr als einem
gewissen m/z durchgelassen werden, das heißt gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
ist das erste Massefilter anfänglich so
eingerichtet, daß es
als Hochpaßfilter
fungiert. Der Eck- oder Sperrpunkt kann so eingerichtet werden, daß er etwas
höher liegt
als der m/z-Wert des charakteristischen Tochterions, welches überwacht
wird. Wenn beispielsweise von einem charakteristischen Tochterion
ein m/z-Wert von 300 bekannt ist, so läßt sich das erste Massefilter
so einrichten, daß es
ausschließlich
Ionen mit einem m/z-Wert
von mehr als beispielsweise 350 durchläßt. Wenn daher ein Ion mit einem
m/z-Wert von 300 anschließend
von dem Masseanalysator detektiert wird, folgt hieraus, daß das Ion
in Tochterion sein muß,
bedingt durch die Fragmentierung eines Elternions in der Fragmentierungseinrichtung,
weil Elternionen mit diesem m/z-Wert von dem ersten Massefilter
herausgefiltert worden wären.
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Vorzugsweise
ist der erste Bereich variabel. Der Bereich der von dem ersten Massefilter
hindurchgelassenen Ionen läßt sich
daher bei Bedarf für
jede Abtastung ändern.
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Vorzugsweise
umfaßt
der Schritt der Massenanalyse von mindestens einigen der Ionen,
die durch die im ersten Modus arbeitende Fragmentierungseinrichtung
hindurchgegangen sind, das Erhalten eines ersten Massespektrums,
wobei der Schritt der Massenanalyse mindestens einiger der Ionen, die
durch die Fragmentierungseinrichtung im zweiten Modus hindurchgegangen
sind, das Erhalten eines zweiten Massenspektrums enthält.
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Nach
dem Schritt der Massenanalyse bei mindestens einigen der Ionen,
die durch die Fragmentierungseinrichtung im zweiten Modus hindurchgegangen
sind, enthält
das Verfahren vorzugsweise weiterhin den Schritt des Identifizierens
mindestens eines Kandidaten-Elternions. Dieses mindestens eine Kandidaten-Elternion
(oder Elternionen-Kandidaten)
wird vorzugsweise dadurch identifiziert, daß die Intensität von Ionen
mit einem gewissen Masse-Ladungs-Verhältnis in dem ersten Massenspektrum
verglichen wird mit der Intensität
von Ionen mit gleichem Masse-Ladungs-Verhältnis im zweiten Massenspektrum.
Wenn eine hohe Intensitätsspitze in
dem Niedrigenergiespektrum gefunden wird, nicht jedoch in dem Hochenergiespektrum,
so ist es wahrscheinlich, daß die
Spitze ein Kandidaten-Elternion repräsentiert.
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Vorzugsweise
enthält
das Verfahren außerdem
die Schritte: Filtern der Ionen stromaufwärts bezüglich der Fragmentierungseinrichtung,
so daß Ionen
mit einem Massen-Ladungs-Verhältnis in
einem zweiten Bereich, der mindestens einen Elternionen-Kandidaten enthält, im wesentlichen
zu der Fragmentierungseinrichtung durchgelassen werden, und das
Durchlassen von Ionen mit einem Massen-Ladungs-Verhältnis außerhalb
des zweiten Bereichs wesentlich reduziert wird; Betreiben der Fragmentierungseinrich tung
derart, daß wesentlich
mehr Ionen fragmentiert werden als in der zweiten Betriebsart; und – anschließend – Massen-Analysieren zumindest
einige der Ionen, die durch die Fragmentierungseinrichtung hindurchgelangt
sind. In anderen Worten: nachdem erst einmal ein Elternionen-Kandidat
identifiziert wurde, wird das erste Massenfilter so eingestellt,
daß es
als schmalbandiges Bandpaßfilter arbeitet,
welches im wesentlichen nur Ionen mit einem m/z-Wert eines speziellen
Elternionen-Kandidaten durchläßt. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
ist der zweite Bereich derart gewählt, daß nur Ionen mit einem Massen-Ladungs-Verhältnis innerhalb
von ±x
Massen-Ladungs-Einheiten eines Elternionen-Kandidaten im wesentlichen
zu der Fragmentierungseinrichtung (4) durchgelassen werden, wobei
x ausgewählt
ist aus der Gruppe: (i) 0,5; (ii) 1,0; (iii) 2,0; (iv) 5,0; (v)
10,0; (vi) 15,0; und (vii) 20,0. Das Massenspektrometer arbeitet
folglich in einem Tandem-MS-Modus.
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Vorzugsweise
ist die Ionenquelle ausgewählt aus
folgender Gruppe: (i) eine Elektrospray-Ionenquelle; (ii) eine Ionenquelle für chemische
Ionisation unter Atmosphärendruck;
und (iii) eine matrix-unterstützte
Laser-Desorptions-Ionenquelle. Solche Ionenquellen, insbesondere
die beiden zuerst erwähnten,
können
mit einem Eluent über
eine Zeitspanne bereitgestellt werden, wobei das Eluent mit Hilfe
von Flüssig-Chromatographie
aus einem Gemisch separiert wurde.
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Vorzugsweise
ist die Ionenquelle aus folgender Gruppe ausgewählt: (i) eine Elektronen-Aufprall-Ionenquelle;
(ii) eine Ionenquelle mit chemischer Ionisierung; und (iii) eine
Ionenquelle mit Feldionisation. Solche Ionenquellen können mit
einem Eluent über
eine Zeitspanne bereitgestellt werden, wobei das Eluent mit Hilfe
von Gaschromatographie aus einem Gemisch separiert wurde.
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Vorzugsweise
werden die Massenanalyseschritte von einem Analysator ausgeführt, der
aus folgender Gruppe ausgewählt
ist: (i) ein Quadrupol-Massenfilter; (ii) ein Flugzeit-Massenspektrometer;
(iii) eine Ionenfalle; (iv) ein Magnet-Sektorfeld-Analysator; und
(v) ein Fouriertransformations-Ionen-Cyclotron-Resonanz-(„FTICR"-)Massenanalysator.
Ein Flugzeit-Massenanalysator ist besonders bevorzugt.
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Vorzugsweise
werden der oder die Filterungsschritte mit Hilfe einer optischen
Mehrelement-Ionenlinse, vorzugsweise mit einem Quadrupol-Stabsatz
durchgeführt,
der weiterhin vorzugsweise mit einem elektrischen HF- und Gleichstromfeld versehen
ist. Vorzugsweise ist die optische Mehrelement-Ionenlinse so ausgestaltet,
daß sie
im wesentlichen nur Ionen durchläßt, deren
Massen-Ladungs-Verhältnisse
größer als
ein erster Wert sind. Weiterhin wird der erste Wert bevorzugt ausgewählt aus
folgender Gruppe: (i) 100; (ii) 150; (iii) 200); (iv) 250; (v) 300;
(vi) 350; (vii) 400; (viii) 450); und (ix) 500. Der Schritt des
Identifizierens von Tochterionen beinhaltet vorzugsweise das Identifizieren
zumindest einiger Ionen, von denen festgestellt wird, daß ihr Massen-Ladungs-Verhältnis kleiner
als der erste Wert ist.
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Die
Fragmentierungseinrichtung enthält
vorzugsweise eine Kollisionszelle, ausgewählt aus folgender Gruppe: (i)
einen Quadrupol-Stabsatz; (ii) einen Hexapol-Stabsatz; (iii) einen
Oktopol-Stabsatz; und (iv) einen Elektrodenrin-Satz. Weiterhin wird
die Kollisionszelle vorzugsweise in einem ausschließlichen
HF-Modus betrieben und ist vorzugsweise mit einem Kollisionsgas
bei einem Druck im Bereich von 10–4 bis
10–1 mbar,
vorzugsweise 10–3 bis 10–4 mbar versehen.
Außerdem
bildet die Kollisionszelle vorzugsweise eine im wesentlichen gasdichte
Umschließung.
Das Kollisionsgas kann vorzugsweise Helium, Argon, Stickstoff, Luft
oder Methan enthalten.
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Vorzugsweise
enthalten die vorbestimmten Tochterionen Ionen aus folgender Gruppe:
(i) Immoniumionen aus Peptiden; (ii) funktionelle Gruppen einschließlich der
Phosphatgruppe-PO3-Ionen aus phosphorylierten
Peptiden; und (iii) Masse-Tags, die von einem spezifischen Molekül oder einer
spezifischen Klasse von Molekülen
abgeteilt werden sollen zwecks anschließender Identifizierung zum
Nachweis des Vorhandenseins des spezifischen Moleküls oder
der spezifischen Klasse von Molekülen, um anschließend identifiziert
zu werden, so daß das
Vorhandensein des spezifischen Moleküls oder der Klasse von Molekülen ermittelt
wird.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform ist
es möglich,
nach Elternionen-Kandidaten dadurch zu suchen, daß man das
Hochenergiekollisions-MS-Spektrum (das ist das Toch terionenspektrum)
nach mehr als einem charakteristischen Tochterion absucht. Dies
kann insbesondere dann relevant sein, wenn die Elternionen mit einem
spezifischen Massen-Tag „etikettiert" wurden. Ein Gemisch aus
zwei oder mehr Elternionen kann jeweils mit einem anderen Massen-Tag
etikettiert werden und kann durch gleichzeitiges Überwachen
von zwei oder mehr charakteristischen Tochterionen aufgefunden werden.
Damit könnten
Elternionen aus zwei oder mehr verschiedenen Klassen von Verbindungen
mit dem gleichen Satz von Experimenten aufgefunden werden.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Massenspektrometer gemäß Anspruch
25 geschaffen. Die Implementierung der verschiedenen Schritte durch
ein automatisches Steuersystem ist lediglich ein bevorzugtes Merkmal.
In einer weniger bevorzugten Ausführungsform können einige
der Verfahrensschritte die menschliche Interaktion seitens einer
Bedienungsperson beinhalten.
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Gemäß einem
dritten Aspekt der Erfindung wird eine Vorrichtung geschaffen, die
dazu angeordnet und ausgebildet ist, das Verfahren nach einem der
Ansprüche
1 bis 24 auszuführen.
In einer weniger bevorzugten Ausführungsform können einige
der Verfahrensschritte die menschliche Interaktion durch eine Bedienungsperson
beinhalten.
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Während bei
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung die Fragmentierungseinrichtung in der
zweiten Betriebsart betrieben wird (wenn es einen geringeren Grad
an Fragmentierung gab), wurde lediglich einmal ein interessierendes
Tochterion identifiziert, gemäß einer
alternativen Ausgestaltung schaltet die Fragmentierungseinrichtung
zwischen Hochenergie- und Niederenergie-Betriebsarten um, das heißt man kann
ein Elternionen-Spektrum erhalten, ohne daß zunächst bestimmt wird (oder unabhängig davon),
daß beispielsweise
ein vorbestimmtes Tochterion als vorhanden ermittelt wurde.
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Es
kommen drei unterschiedliche Betriebsarbeiten bei dieser Ausgestaltung
in Betracht. In einer ersten Betriebsart ist es lediglich notwendig,
festzustellen, wann ein vorbestimmtes Tochterion in dem Tochterionen-Spektrum
vorhanden ist. In dieser speziellen Betriebsart ist es nicht unbedingt
erforderlich, daß ein
Elternionen-Kandidat vorab identifiziert wird, wenngleich dies bevorzugt
wird. In einer zweiten Betriebsart wird ermittelt, ob es eine gewisse
Verbindung zwischen mindestens einem Tochterion und mindestens einem
Elternionen-Kandidaten aufgrund des Verlustes eines vorbestimmten
Ions (zum Beispiel einer Funktionsgruppe) oder des Verlustes eines
neutralen Partikels geben könnte.
Eine dritte Betriebsart sieht vor, daß die vorbestimmten Schritte
sowohl der ersten als auch der zweiten Betriebsart ausgeführt werden
können.
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Obschon
es bevorzugt ist, wenn bei Ausführungsformen
der Erfindung das Quadrupol-Massenfilter
am Anfang eine Hochpaßcharakteristik
besitzt, kann in weniger bevorzugten Ausführungsformen das Massenfilter
eine Bandpaßcharakteristik
haben. Außerdem
kommt bei weniger bevorzugten Ausführungsformen in Betracht, daß das Massenfilter
ein „V-Kerb"-Durchlaßprofil
besitzt, das heißt
hohe Transmissionsfähigkeit
bei niedrigen und hohen Massen-Ladungs-Verhältnissen und vorzugsweise eine
lineare oder anderweitig rasch abnehmende/zunehmende Transmission
auf jeder Seite eines Mittelpunkts.
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Die
Implementierung abwechselnder Niederenergie- und Hochenergiekollision
ermöglicht
es (Kandidaten-)Elternionen, basierend auf dem Auftreten eines spezifischen
Tochterionen-m/z-Werts, entweder als Nennwert oder exakter Wert,
in dem Hochenergiekollisions-„MS-Überwachungs"-Spektrum ausgewählt zu werden.
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Nachdem
ein oder mehrere Elternionen aufgefunden wurden, kann anschließend eine
Anzahl weiterer Kriterien dazu benutzt werden, eine weitere Auswahl
und/oder Abweisung von Elternionen-Kandidaten vorzunehmen, das heißt die Liste
möglicher Kandidaten-Elternionen bis hinunter
zu einer kurzen Liste stärker
definierter Kandidaten-Elternionen zu verfeinern. Diese Kriterien
beinhalten:
- (a) eine Auswahl basierend auf
dem geforderten Ladungszustand (typischerweise Z > 1 für Peptide,
Z = 1 für
Arznei-Abbauzwischenprodukte);
- (b) Auswahl anhand der relativen oder absoluten Intensität;
- (c) Auswahl anhand des Befindens innerhalb eines bevorzugten
m/z-Bereichs;
- (d) Auswahl aufgrund einer Liste bevorzugter m/z-Werte, entweder
als Nennwerte oder exakte Werte;
- (e) Abweisung basierend auf einer Liste auszuschließender m/z-Werte,
entweder als Nennwerte oder exakte Werte (typische bekannte Hintergrundionen
oder matrix-bezogene
Verunreinigungen);
- (f) Zurückweisung
basierend auf einer Zwischen-(dynamischen) Liste von ausgeschlossenen
m/z-Werten (typische Vorläufer-Ionen,
die in jüngerer
Zeit analysiert wurden, um eine Duplizierung zu verhindern).
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Gemäß einem
weniger bevorzugten Merkmal lassen sich Tochterionen, die durch
die Fragmentierung mehrfach geladener Elternionen gebildet wurden,
nachweisen durch das Vorhandensein von Ionen mit Massen-Ladungs-Verhältnissen,
die größer sind
als diejenigen von Kandidaten-Elternionen. Dies kann besonders geeignet
sein, wenn Elternionen durch Elektrospray erzeugt werden.
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Gemäß Ausführungsformen
der Erfindung läßt sich
das Ereignis von mehrfachen gemeinsam eluierenden Komponenten das
Vorläuferion
dadurch auffinden, daß man
das erste Massenfilter, MS1, dazu benutzt, jedes Kandidaten-Vorläuferion
auszuwählen,
um dessen MS-MS-Fragmentspektrum aufzuzeichnen. Allerdings wird
die Anzahl von aufzunehmenden Spektren nur durch eine Anzahl erhöht, die
der Anzahl von Kandidaten-Vorläuferionen
entspricht. Dies ist immer noch viel weniger als die zahlreichen
hundert Spektren, die durch traditionelle Elternionen-Abtastverfahren
erforderlich sind.
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Im
Falle von mehrfach eluierenden Komponenten gibt es Raum für die Reduzierung
der Anzahl von Kandidaten-Vorläuferionen
durch Verwendung zusätzlicher
Filterungskriterien. Beispielsweise läßt sich das anvisierte Vorläuferion
auffinden, wenn das Hochenergie-Kollisions-Spektrum
auch bezüglich des
Vorhandenseins von einem oder mehreren charakteristischen neutralen
Verlustionen entsprechend jedem der Kandidaten-Vorläuferionen,
die im Niederenergie-Kollisions-Spektrum beobachtet werden, untersucht
wird. Dies reduziert möglicherweise
die Anzahl von aufzuzeichnenden MS/MS-Fragmentspektren, in vielen Fällen auf
genau ein Spektrum.
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Wenn
die Anzahl von Kandidaten-Vorläuferionen
vier oder mehr beträgt,
sollte grundsätzlich die
Anzahl von aufzunehmenden MS/MS-Spektren dadurch weiter verringert
werden, daß man
wiederholt die Kandidaten-Vorläufer
in zwei gleiche oder nahezu gleiche Untergruppen abhängig von
ihren Massen unterteilt. Das Hochenergie-Kollisions-Spektrum für sämtliche
Vorläuferionen
innerhalb jeder Gruppe würde
dann dadurch aufgezeichnet, daß der
Niedrigmassen-Grenzwert für
MS1 auf einen m/z-Wert eingestellt würde, der die beiden Gruppen
unterteilt. Durch einen Eliminationsprozeß würde diese Prozedur dann das
Erreichen des anvisierten Vorläuferions in
weniger Stufen ermöglichen.
In der Praxis wird diese Vorgehensweise nur dann bevorzugt, wenn
die Anzahl von Kandidaten-Vorläuferionen
sechs oder mehr beträgt.
Nichtsdestoweniger kann, um den potentiellen Wert dieses Verfahrens
zu veranschaulichen, ein Gemisch aus 16 Komponenten 16 MS/MS-Spektren
erfordern, um das anvisierte Vorläuferion aufzufinden, wohingegen
dieses Verfahren die erforderliche Anzahl von MS/MS-Spektren auf fünf reduzieren
könnte.
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Das
Auffinden von Vorläuferionen
basierend auf dem Vorhandensein eines spezifischen m/z-Wert eines
Produktions erfordert das anfängliche
Ermitteln von ausschließlich
Hochenergie-CID-(CID: Collision Induced Decomposition; durch Kollision
verursachte Zersetzung) „MS"-Überwachungs-Spektren. Falls geeignet,
kann der m/z-Durchlaßbereich
des Quadrupol-Massenfilters so eingestellt werden, daß das Filter
den m/z-Wert des spezifizierten Produktions nicht durchläßt und somit
jegliche Hintergrundionen aus der Quelle bei diesem m/z-Wert beseitigt.
Mögliche
Ionen bei dem spezifizierten m/z-Wert können nur Produktionen sein.
Wenn ein interessierendes Tochterion eluiert, liefert das niederenergetische CID-„MS-Überwachungs"-Spektrum nun eine
kurze Liste von (Kandidaten-)Elternionen. Diese Liste läßt sich
optional zusätzlich
filtern oder verfeinern durch verschiedene Auswahl- und/oder Zurückweisungskriterien,
so zum Beispiel den Ladungszustand, ausgeschlossene m/z-Werte etc.
Bestätigung
und Identifizierung des anvisierten Vorläuferions erfordert nun lediglich
das Aufnehmen von MS/MS-Spektren für die (optional zusätzlich gefilterte)
kurze Kandidatenliste. Dies erreicht das gleiche Ziel wie die traditionelle
Elternionen-Abtastung ohne das Erfordernis, das erste Massenfilter,
MS1, abzutasten, zuzüglich
des Bonus, das vollständige
Tochterionen-Spektrum bei dem anvi sierten Vorläuferion aufgenommen zu haben.
Die Spezifikation der exakten Produktionen-m/z-Werte erhöht die Selektivität zusätzlich.
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Die
Auffindung von Vorläuferionen
basierend auf dem Vorhandensein eines spezifischen neutralen oder
Verlustions erfordert das Abfragen von sowohl Niederenergie als
auch Hochenergie-CID-„MS-Überwachungs"-Spektren. Die Niederenergiespektren
liefern eine kurze Kandidatenliste von Vorläuferionen. Auch hier kann diese
kurze Liste weiter durch unterschiedliche Kriterien gefiltert werden,
das heißt
Ladungszustand, ausgeschlossene m/z-Werte etc. Eine kurze Liste
von m/z-Werten kann nun mit dem spezifizierten neutralen oder Ionenverlust
erzeugt werden. Diese m/z-Werte werden nun gegenüber dem Hochenergie-CID-„MS-Überwachungs"-Spektrum recherchiert.
Das Vorläuferion
für mögliche Treffer
läßt sich
bestätigen
und identifizieren durch Aufnehmen von dessen MS/MS-Spektrum. Dies
führt zu dem
gleichen Ziel wie die herkömmliche
Neutralverlust-Abtastung,
ohne daß das
MS1 und MS2 abgetastet werden müssen,
auch hier wiederum mit dem zusätzlichen
Vorteil, daß das
vollständige
Produktion-Spektrum des anvisierten Vorläuferions aufgenommen wird.
Auch hier können
exakte m/z-Werte spezifiziert werden.
-
Die
verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen
bieten zahlreiche Vorteile gegenüber herkömmlichen
Methoden des Elternionen-Scannings, einschließlich der Möglichkeit, die Massen-Ladungs-Verhältnisse
von Elternionen aufzufinden und deren zugehörige Tochterionenspektren innerhalb von
Online-Zeitmaßstäben, beispielsweise
Chromatographie-Zeitmaßstäben, zu
erhalten. Außerdem besitzen
die bevorzugten Ausführungsformen
höhere Empfindlichkeiten
als die herkömmlichen
Elternionen-Scanningverfahren und eröffnen die Möglichkeit, Mehrfach-Kriterien
in ein und dasselbe Experiment zur Auswahl von Elternionen-m/z-Werten
einzubeziehen. Es ist ebenfalls möglich, mehrere Klassen von
Elternionen innerhalb des gleichen Experiments aufzufinden, wobei
die Verfahren in Verbindung mit Massen-Etikettierung verwendet werden
können.
-
Verschiedene
Ausführungsformen
der Erfindung werden im folgenden lediglich beispielhaft und unter
Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:
-
1 eine
schematische Darstellung einer bevorzugten Anordnung;
-
2(a) und 2(b) typische
Tochterionen- und Elternionen-Spektren;
-
3 eine
schematische Darstellung einer Ventilumschaltanordnung während des
Ladens und Entsalzens einer Probe, wobei der Ausschnitt die Desorption
einer Probe aus einer Analysekolonne darstellt;
-
4 ein
Q-TOF2-Massenspektrometer, welches vorzugsweise in Intervallen von
einer Sekunde umschaltet zwischen Niedrigenergie und Hochenergie-Kollision
mit Argongas in der Kollisionszelle. Der Niederenergie-Datensatz
zeigt die Pseudo-Molekularionen, der Hochenergie-Datensatz zeigt außerdem deren
Fragmentionen;
-
5 ein
Flußdiagramm
eines exakten Neutralverlust-Experiments;
-
6 Ergebnisse
eines exakten Neutralverlust-Experiments bezüglich 100 fmol eines in einer Kolonne
eingebrachten α-Casein-Extrakts;
-
7 Niederenergie-
und Hochenergie-Spektren zur Zeit der Eluierung des 976,46-(2+)-Ions nach 6;
-
8 eine
auseinandergezogene Ansicht der Niederenergie- und Hochenergie-Spektren
für m/z
910–995;
-
9 die
Bestätigung
des Neutralverlusts aus 976,46 (2+) im Produktionenmodus;
-
10 ein
kommentiertes Produktionenspektrum von 976,46 (2+);
-
11 den
Neutralverlust von H3PO4 von
einem Extrakt-Peptid von β-Casein
bei in eine Kolonne injizierten 10 fmol;
-
12 ein
Gesamt-Ionenchromatogramm eines ADH-Verdauungsextrakts;
-
13 ein
Massenchromatogramm von 87,04 (Asparagin-Immoniumion);
-
14 ein
Fragment T5 von einer ADH-Sequenz ANELLINVK MW 1012,59;
-
15 ein
Massenspektrum für
die Niederenergie-Spektren eines Verdauungsextrakts von β-Casein;
-
16 ein
Massenspektrum für
die Hochenergie-Spektren eines Verdauungsextrakts von β-Casein;
-
17 eine
verarbeitete und ausgedehnte Ansicht des gleichen Spektrums wie
in 16;
-
18 Chromatogramme
für α-Casein;
und
-
19 Massenspektren
für α-Casein.
-
Im
folgenden wird eine bevorzugte Ausführungsform anhand der 1 erläutert. Ein
Massenspektrometer 6 enthält eine Ionenquelle 1,
vorzugsweise eine Elektrospray-Ionisierungsquelle,
eine optionale Ionenführung 2,
ein erstes Quadrupol-Massenfilter 3, eine Kollisionszelle 4 und
einen orthogonalen Beschleunigungsflugzeit-Massenanalysator mit
einem Reflectron 5. Das Massenspektrometer 6 kann
mit einem Chromatographen in Verbindung stehen, beispielsweise einem
(nicht gezeigten.) Flüssigchromatographen,
so daß die
in die Ionenquelle 1 eintretende Probe aus dem Eluent des
Flüssigchromatographen
entnommen werden kann.
-
Das
Quadrupol-Massenfilter 3 befindet sich in einer evakuierten
Kammer, die auf einem relativ niedrigen Druck von zum Beispiel weniger
als 10–5 mbar
gehalten wird. Die Elektroden des Massenfilters 3 sind
mit einer Energiequelle verbunden, die sowohl HF- als auch Gleichstrompotentiale
liefert, die den Bereich von Massen-Ladungs-Werten bestimmen, die
von dem Filter 3 durchgelassen werden. Eine Fragmentierungseinrichtung 4,
vorzugsweise eine Kollisionszelle, befindet sich an einer Stelle,
an der sie Ionen empfängt,
die durch das Massenfilter 3 durchgelassen werden. In besonders
bevorzugten Ausführungsformen
kann die Kollisionszelle einen Quadrupol- oder Hexapol-Stabsatz
enthalten, der eingeschlossen sein kann von einem im wesentlichen
gasdichten Gehäuse,
in welches während
des Betriebs ein Kollisionsgas wie beispielsweise Helium, Argon,
Stickstoff, Luft oder Methan, unter einem Druck von 10–4 und
10–1 mbar,
bevorzugt 10–3 bis
10–2 mbar,
eingeleitet wird. Geeignete HF-Potentiale für die die Fragmentierungseinrichtung 4 bildenden Elektroden
werden von einer (nicht gezeigten) Energieversorgung bereitgestellt.
-
Von
der Ionenquelle 1 erzeugte Ionen laufen durch die Ionenführung 2 in
das Massenfilter 3 und in die Fragmentierungseinrichtung 4.
Aus der Fragmentierungseinrichtung 4 austretende Ionen
laufen in einen Flugzeit-Massenanalysator 5. Andere optische Ionenbauteile,
wie zum Beispiel Ionenführungen
oder elektrostatische Linsen, können
vorhanden sein, sind aber in den Figuren nicht dargestellt oder
hier beschrieben, wobei diese Teile die Aufgabe haben, den Ionendurchlauf
zwischen verschiedenen Teilen der Vorrichtung zu maximieren. Verschiedene
(nicht gezeigte) Vakuumpumpen können
vorgesehen sein, um innerhalb des Geräts optimale Vakuumbedingungen aufrecht
zu erhalten. Der Flugzeit-Massenanalysator 5 arbeite
in bekannter Weise, indem er die Transit-Zeit der in einem Ionenpaket
enthaltenen Ionen mißt,
so daß sich
deren Massen-Ladungs-Verhältnisse
bestimmen lassen.
-
Eine
(nicht gezeigte) Steuereinrichtung sorgt für Steuersignale für die verschiedenen
(nicht dargestellten) Energieversorgungen, die die notwendigen Betriebspotentiale
für die
Ionenquelle 1, die Ionenführung 2, das Quadrupol-Massenfilter 3,
die Fragmentierungseinrichtung 4 und den Flugzeit-Massenanalysator 5 liefern.
Diese Steuersignale bestimmen die Betriebsparameter für das Gerät, beispielsweise die
Massen-Ladungs-Verhältnisse,
die durch das Massenfilter 3 hindurchgelassen werden, und
den Betrieb des Analysators 5. Die Steuereinrichtung wird
typischerweise ihrerseits durch Signale von einem (nicht gezeigten)
Computer gesteuert, der auch zum Verarbeiten der aufgenommenen Massenspektraldaten
benutzt werden kann. Der Computer kann außerdem von dem Analysator 5 erzeugte
Massenspektren anzeigen und speichern, außerdem Befehle von einem Bediener
empfangen und verarbeiten. Die Steuereinrichtung kann automatisch
so eingestellt sein, daß sie
verschiedene Verfahren ausführt
und verschiedene Bestimmungen vornimmt, ohne daß hierzu ein Eingriff seitens
der Bedienungsperson erfolgt, oder sie kann optional in verschiedenen
Stadien den Eingriff der Bedienungsperson anfordern.
-
2(a) und 2(b) zeigen
Tochter- bzw. Elternionen-Spektren eines Verdauungsextrakts von ADH,
bekannt als Alkoholdehydrogenase. Das in 2(a) dargestellte
Tochterionen-Spektrum wurde ermittelt, während die Kollisionszellenspannung
(das ist die an die Fragmentierungseinrichtung 4 angelegte
Spannung) einen hohen Wert von beispielsweise 30 V hatte, was zu
einer signifikanten Fragmentierung von hindurchlaufenden Ionen führte. Das
Elternionen-Spektrum, das in 2(b) gezeigt
ist, wurde bei geringer Kollisionsenergie von zum Beispiel ≤ 5 V gewonnen.
Die Massenspektren in diesem speziellen Beispiel wurden aus einer
Proben-Eluierung aus einem Flüssigchromatographen
gewonnen, und die Spektren wurden ausreichend schnell und zeitlich nahe
erhalten, so daß sie
im wesentlichen der gleichen Komponente oder den gleichen Komponenten entsprachen,
die aus dem Flüssigchromatographen eluierten.
-
Gemäß eine Ausführungsform
der Erfindung läßt sich
bestimmen, daß ein
vorbestimmtes interessierendes Tochterion, beispielsweise Tochterionen mit
einem m/z-Wert von 136,1099 gemäß 2(a) vorhanden sind. Diese Feststellung kann entweder durch
eine Bedienungsperson oder durch automatische Ermittlung unter Einsatz
eines Computers erfolgen. Nach dieser Ausführungsform wird, wenn diese Feststellung
getroffen wurde, die an die Kollisionszelle angelegte Spannung auf
einen niedrigen Wert eingestellt, und es wird ein Elternionen-Spektrum
(entsprechend 2(b)) aufgenommen.
-
In
der Ausführungsform
kann das Elternionen-Spektrum anschließend analysiert werden, um festzustellen,
welche Peaks den Kandidaten-Elternionen entsprechen. In 2(b) gibt es mehrere Peaks hoher Intensität in dem
Elternionen-Spektrum, beispielsweise die Peaks bei 418,7724 und 568,7813,
die in dem zugehörigen
Tochterionen-Spektrum nicht nennenswert vorhanden sind. Deshalb
lassen sich diese Peaks vorzugsweise als Indikator für Kandidaten-Elternionen
betrachten.
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Nach
der Ausführungsform
wird, nachdem erst einmal ein vorbestimmtes interessierendes Tochterion
nachgewiesen wurde, beispielsweise Ionen mit einem m/z-Wert von
136,1099, und ein oder mehrere entsprechende Kandidaten-Elternionen identifiziert
wurden, beispielsweise Ionen mit m/z-Werten von 418,7724 und 568,7813,
das Massenfilter 3 so eingestellt, daß es als schmalbandiges Bandpaßfilter
fungiert und somit im wesentlichen zu der Fragmentierungseinrichtung 4 nur
eines der Kandidaten-Elternionen durchläßt, beispielsweise Ionen mit
einem m/z-Wert von 418,7224. Die Fragmentierungseinrichtung 4 wird
auf hohe Kollisionsenergie eingestellt, so daß ein volles Tochterspektrum
für jenes
besondere Kandidaten-Elternion erhalten werden kann. Wenn das vorbestimmte
interessierende Tochterion in dem vollen Tochterspektrum vorhanden ist,
muß es
sich um ein Produkt des ausgewählten Kandidaten-Elternions
handeln. Ist das vorbestimmte Tochterion nicht vorhanden, so wird
ein anderes Kandidaten-Elternion ausgewählt.
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Selbst
dann, wenn ein Tochterionen-Scan für sämtliche Kandidaten-Elternionen-Peaks
durchgeführt
werden muß,
sind viel weniger Abtastungen erforderlich als bei den herkömmlichen
Verfahren zur Elternionen-Abtastung.
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Variable,
die beim Bestimmen, ob spezielle Peaks signifikant sind, berücksichtigt
werden können,
enthalten zum Beispiel die Intensität des betrachteten Peaks oder
den Ladungszustand des Ions (was durch eine Vielfalt bekannter Verfahren
abgeleitet werden kann). Außerdem
können
basierend auf gewissen Kriterien Ionen von der Betrachtung ausgeschlossen
werden.
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In
Verbindung mit einer Ausführungsform
der Erfindung kann es angemessen sein, nach Kandidaten-Elternionen
zu suchen, indem man das Tochterionen-Spektrum nach mehre als einem
charakteristischen Tochterion absucht. Dies kann besonders dann
relevant sein, wenn die Elternionen mit einem spezifischen Massen-Tag „etikettiert" wurden. Eine Mi schung
aus zwei oder mehr Elternionen kann jeweils mit einem verschiedenen
Massen-Tag etikettiert
sein, was durch gleichzeitiges Überwachen
von zwei oder mehr charakteristischen Tochterionen aufgedeckt werden
kann. Folglich können
Elternionen von zwei oder mehr verschiedenen Klassen von Verbindungen
im gleichen Satz von Experimenten aufgefunden werden.
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Eine
besonders bevorzugte Anordnung besteht darin, Spektren abwechselnd
bei hohen und niedrigen Kollisionsspannungen aufzunehmen. Wenn das
Verfahren dazu benutzt wird, den Ausgang eines Online-Prozesses,
beispielsweise der Flüssigkeitschromatographie,
zu analysieren, so ist dieses Verfahren besonders nützlich,
da abwechselnde Spektren im wesentlichen der gleichen Zusammensetzung
der aus dem Chromatographen eluierenden Probe entsprechen.
-
Im
folgenden wird eine Anzahl von Beispielen angegeben, um die verschiedenen
Aspekte bevorzugter Ausführungsformen
der Erfindung weiter zu veranschaulichen.
-
Beispiel 1 – Neutralverlust
-
Die
starke Zunahme der verfügbaren
Genom-Sequenz-Information, einhergehend mit der erhöhten Empfindlichkeit
und Selektivität,
die durch Massenspektrometrie ermöglicht wird, hat eine im Großmaßstab erfolgende
Protein-Identifizierung ermöglicht.
Die Analyse von Nachübergangsmodifikationen
bei identifizierten Proteinen ist allerdings ein erschwertes Problem.
Derzeit ist das die am meisten spezifische Lösung mittels Massespektrometrie
liefernde Vorgehensweise das Vorläuferionen-Scanning. Bei der
Durchführung
eines Vorläuferionen-Scanning-Versuchs
sucht das Massenspektrometer nach sämtlichen Ionen des Fragments,
um ein gemeinsames Diagnose-Produktion zu bilden. Eine typische
Anwendung ist die Analyse durch ein Proteinextraktgemisch, bei dem
nur nach solchen Peptiden geforscht wird, die möglicherweise phosphoryliert
sind. Derzeitige Verfahren zum Durchführen von Vorläufer-Ionen-Experimenten
mit einem bekannten Massenspektrometer (Q-TOF2, beziehbar von MicromassTM) mit einem ersten Quadrupol-Massenfilter (MS1),
einer Quadrupol-Kollisionszelle und einem orthogonalen Flugzeit- Massenanalysator
(MS2) beinhalten das Scannen des Quadrupols des Geräts, MS1, über dem
m/z-Bereich innerhalb dessen Vorläufer gesucht werden, wobei
ein vollständiges
Produktionen-Spektrum mit Hilfe des Flugzeitanalysators aufgezeichnet
wird. Diese Vorgehensweise kann allerdings die Empfindlichkeit des
Vorläuferionen-Experiments
einschränken
aufgrund des relativ geringen Arbeitszyklus eines Abtast-Quadrupols.
-
Eine
experimentelle Methodik, die es ermöglicht, spezifische post-translatorisch
modifizierte Peptide zu identifizieren und zu sequenzieren während des
Verlaufs eines HPLC-Experiments
an einem bekannten Massenspektrometer, wird im folgenden erläutert. Während dieses
Experiments wurde der Quadrupol im Breitbandmodus betrieben.
-
Die
Proben wurden mit Hilfe eines Micromass(TM)-Modular-CapLC-Systems
in das Massenspektrometer eingeleitet. Proben wurden auf einer C18-Patrone
(0,3 mm × 5
mm) aufgebracht und mit 0,1% HCOOH 3 Minuten lang bei einem Strömungsdurchsatz
von 30 μL
pro Minute entsalzen (3). Das zehn Öffnungen
aufweisende Ventil wurde anschließend derart umgeschaltet, daß die Peptide
auf die Separier-Analysekolonne eluierten, vergleiche den Ausschnitt
in 3. Der Strom von den Pumpen A und B wurde aufgetrennt,
um in der Kolonne einen Strömungsdurchsatz
von etwa 200 nL/min zu bilden.
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Die
Analysekolonne wurde als PicoFritTM-Kolonne
(www.newobjektive.com), beladen mit Waters Symmetry(TM) C18 (www.waters.com)
verwendet. Eingerichtet wurde die Anordnung zum direkten Einsprühen in das
Massenspektrometer. Das Elektrospray-Potential (circa 3 kV) wurde über eine
Edelstahlanordnung mit geringem Totvolumen an die Flüssigkeit
gelegt. Eine geringe Menge (circa 5 psi (3,4 × 104 Nm–2)
eines Nebelgases wurde um die Sprühspitze eingeleitet, um den
Elektrospray-Prozeß zu
unterstützen.
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Sämtliche
Daten wurden mit Hilfe eines orthogonalen Q-TOF2-Quadrupol-Beschleunigungsflugzeit-Hybridmassenspektrometers
(www.micromass.co.uk), ausgestattet mit einer Z-Spray-Nanoflow-Elektrospray-Ionenquelle,
aufgenommen. Betrieben wur de das Massenspektrometer in einem Positivionen-Modus
mit einer Quellentemperatur von 80°C und einer kegelförmigen Gasströmungsgeschwindigkeit
von 40 L/h.
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Kalibriert
wurde das Gerät
durch Mehrpunkt-Eichung unter Verwendung ausgewählter Fragment-Ionen, die sich
aus der durch Kollision hervorgerufenen Zersetzung (CID) von Glufibrinopeptid b.
ergaben. Sämtliche
Daten wurden mit Hilfe von MassLynx-Software verarbeitet.
-
Während des
HPLC-Gradienten wurde das Instrument im MS-Modus betrieben und abwechselnd
bei Ein-Sekunden-Intervallen umgeschaltet zwischen geringer und
hoher Kollisionsenergie mit in der Kollisionszelle befindlichem
Argon. Der Quadrupol MS1 wurde im ausschließlichen HF-Modus betrieben,
so daß der
volle Massenbereich zu dem Flugzeit-Analysator gelangen konnte.
Der erste Datensatz bei geringer Energie (4 eV) zeigt nur die normalen
pseudomolekularen Ionen. Der zweite Datensatz bei höherer Energie
enthält
außerdem
deren Produktionen (vergleiche 4). Wann
immer ein interessierendes Produktion in den Hochenergiedaten auftrat,
waren seine sämtlichen
möglichen
Vorläufer in
den entsprechenden Niederenergiedaten enthalten. Das Massenspektrometer
wurde dann unter Auswahl des potentiellen Vorläufers zur Entdeckung des wahren
Elternteils sequentiell auf einen MS/MS-Modus umgeschaltet.
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Im
Fall von Phosphopeptiden lassen sich sowohl Phosphoserin als auch
Phosphothreonin mit Vorläufern
identifizieren, da sie einen Neutralverlust von 98 Da (H3PO4) unter Hochenergiebedingungen anzeigen.
Dementsprechend kann die Software eine Liste von Neutralverlusten
aus den im Niederenergie-Spektrum identifizierten Vorläufern erstellen. Dies
beinhaltet das Messen der Massen der Vorläuferionen, das Bestimmen von
deren Ladungszuständen
und das Subtrahieren des Neutralverlusts, das heißt 97,9769
(1+), 49,9885 (2+). Das Erscheinen des Neutralverlusts im Hochenergie-Spektrum
veranlaßt
ein Umschalten des Instruments in den Produktionen-Modus, um den
Neutralverlust zu bestätigen
und zusätzliche
Sequenzinformation zu erhalten. Die exakte Massenfähigkeit
des Q-TOF2 steigert die Spezifität
des Neutralverlusts insbesondere im Fall eines Mas senverlusts, wie
er bei Phosphat beobachtet werden kann. 5 zeigt
eine schematische Darstellung eines exakten Neutralverlust-Experiments.
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6 zeigt
die Ergebnisse eines exakten Neutralverlust-Experiments, welches
mit 100 fmol eines α-Casein-Extrakts
in einer Kolonne durchgeführt wurde.
Wie man aus dem MS/MS-Chromatogramm ersehen kann, schaltete das
Gerät während des
Experiments zweimal auf den Produktionen-Modus um, was nahelegt,
daß 830,02
(2+)- und 976,46 (2+)-Ionen einen Neutralverlust erlitten hatten.
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7 zeigt
die Nieder- und Hochenergie-Spektren zur Zeit des Eluierens für das 976,46 (+2)-Ion.
Das Niederenergie-Spektrum enthält
ein Minimum von acht mehrfach geladenen Ionen. Das Hochenergie-Spektrum
zeigt das komplizierte Gemisch aus Fragmentionen, die von den acht
Peptiden abgeleitet wurden. Eine ausgedehnte Ansicht von m/z 910–995 ist
in 8 dargestellt. Sie zeigt, daß das Peptid bei 976,46 (2+)
fragmentiert wurde, um ein Ion zu erzeugen, welches als Neutralverlust
innerhalb des exakten Massenfensters von ±20 mDa (20 mu) liegt. Sämtliche
anderen Produktionen innerhalb des Spektrums haben nicht die Kriterien
erfüllt, die
als Neutralverlust erfüllt
sein müssen.
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Nachdem
das 976,46 (2+)-Ion als solches mit Neutralverlust registriert wurde,
schaltet das Instrument auf den MS/MS-Modus um. Dies bestätigt, daß das als
Neutralverlust zugeordnete Ion aus dem 976,46 (2+)-Ion entstanden
ist und nicht ein Zufalls-Fragment-Ion ist, welches aus einem der
anderen Peptide entstanden ist, welches in der Quelle enthalten
ist (siehe 9). Das Produktionen-Spektrum liefert
außerdem
Sequenzinformation aus dem phosphorylierten Peptid (siehe 10).
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11 zeigt
den Neutralverlust von H3PO4 von
einem Beta-Caseinextrakt-Peptid, welches bei einer Konzentration
von 10 fmol, die in eine Kolonne injiziert wurden, nachgewiesen
wurde.
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Im
Fall von Phosphotyrosin erfolgt keine Fragmentierung unter Bildung
eines Neutralverlusts von H3PO4.
Allerdings kommt es zu einer Zersetzung unter Entstehung eines phosphorylierten
Immonium-Ions bei m/z 216 in positiver ESI. Die Software kann dazu
dienen, dieses Ion zu überwachen,
um auf einen MS/MS-Modus umzuschalten, wenn es in dem Hochenergie-Spektrum
auftaucht.
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Beispiel 2 – Automatisches
Auffinden eines Peptids, das die Aminosäure Asparagin enthält
-
Das
gesamte Ionenchromatogramm für
die HPLC-Separierung und Massenanalyse des Verdauungsextraktes des
Proteins ADH (Alkoholdehydrogenase) ist in 12 gezeigt.
Dieses Chromatogramm wurde sämtlichen
Niederenergie-Spektren entnommen, die in dem Q-TOF-Tandem-MS/MS-System aufgezeichnet
wurden. Für
diese Daten wurde der Q-TOF im MS-Modus betrieben und abgewechselt zwischen
Nieder- und Hochenergiekollision innerhalb der Gaskollisionszelle
für aufeinanderfolgende
Spektren.
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13 zeigt
das Massenchromatogramm für
m/z 87,04, extrahiert aus der gleichen HPLC-Separierung und Massenanalyse,
wie sie oben in Verbindung mit 12 erläutert wurde.
Das Immonium-Ion für
die Aminosäure
Asparagin besaß einen m/z-Wert
von 87,04. Dieses Chromatogramm wurde aus sämtlichen auf dem Q-TOF aufgezeichneten Hochenergiespektren
extrahiert.
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14 zeigt
das der Abtastzahl 604 entsprechende volle Massenspektrum. Es handelt
sich hierbei um ein Niederenergie-Massenspektrum, welches auf dem
Q-TOF aufgezeichnet wurde, und es ist das Niederenergie-Spektrum,
welches dem Hochenergie-Spektrum bei Abtastung 605 am nächsten liegt, welche
dem größten Peak
innerhalb des Massenchromatogramms von m/z 87,04 entspricht. Dies zeigt,
daß das
Elternion für
das Asparagin-Immonium-Ion
bei m/z 87,04 eine Masse von 1012,54 besitzt, da es ein einzelnes
geladenes (M + H)+-Ion bei m/z 1013,54 und
ein doppelt geladenes (M + 2H)++-Ion bei
m/z 507,27 zeigt.
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Beispiel 3 – Automatisches
Auffinden der Phosphorylierung eines Proteins durch Neutralverlust
-
15 zeigt
ein Massenspektrum aus den Niederenergie-Spektren, die auf einem
Q-TOF-Tandem-MS/MS-System
eines Verdauungsextrakts des Proteins β-Casein aufgezeichnet wurden.
Die Protein-Extraktprodukte wurden durch HPLC separiert und einer
Massenanalyse unterzogen. Die Massenspektren wurden auf dem im MS-Modus
arbeitenden Q-TOF aufgezeichnet, und es erfolgte ein Umschalten
zwischen Nieder- und Hochenergiekollision in der Gaskollisionszelle
für aufeinanderfolgende
Spektren.
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16 zeigt
das Massenspektrum aus den Hochenergie-Spektren, die während der
gleichen Zeitspanne der HPLC-Separierung aufgezeichnet wurden wie
die oben erwähnten
Spektren nach 15.
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17 zeigt
eine verarbeitete und erweiterte Ansicht desselben Spektrums wie
in 16. Aus diesem Spektrum wurden die Continuum-Daten
derart verarbeitet, daß die
Spitzen identifizierbar wurden und dargestellt werden konnten als
Linien mit Höhen proportional
zu der Spitzenfläche,
wobei die den Schwerpunkt-Massen entsprechenden Massen angemerkt
sind. Die Spitze (Peak) bei m/z 1031,4395 ist das doppelt geladene
(M + 2H)++-Ion eines Peptids, und der Peak bei
m/z 982,4515 ist ein doppelt geladenes Fragment-Ion. Es muß deshalb
ein Fragment-Ion sein, weil es im Niederenergie-Spektrum nicht vorhanden
ist. Die Massendifferenz zwischen diesen Ionen beträgt 48,9880.
Die theoretische Masse für
H3PO4 beträgt 97,9769,
und der m/z-Wert für das
doppelt geladene H3PO4++-Ion beträgt 48,9884, was einen Unterschied
von lediglich 8 ppm gegenüber
dem betrachteten Wert ausmacht.
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Beispiel 4 – Auffinden
eines Elternions eines phosphorylierten Peptids durch Erkennen eines
charakteristischen Neutralverlusts
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Es
wurde ein Q-TOF2-Massenspektrometer eingerichtet, um Massenspektren
durch Kollisionsgas in der Kollisionszelle, in Verbindung mit der
Aufnahmeeinrichtung zum Auf nehmen von abwechselnd Hoch- und Niederenergie-Spektren.
Wenn ein Tochterion mit einer Massendifferenz gegenüber einem Kandidaten-Elternion
entsprechend dem Verlust des H3PO4-Ions identifiziert wurde, schaltete das
System automatisch um, um das MS/MS-Spektrum dieses Kandidaten-Elternions
aufzunehmen.
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Im
folgenden wird ein Beispiel für
eine solche Aufnahme beschrieben. Es wurde das Protein α-Casein extrahiert,
und 100 fmol des Extrakts wurden zur Separierung durch Flüssigchromatographie
injiziert, bevor ein Einsprühen
in die Elektrospray-Quelle des Q-TOF2
erfolgte.
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18 zeigt
von unten nach oben die folgenden Chromatogramme: (1) das TIC-Chromatogramm (TIC
steht für
Gesamt-Ionenstrom) für
den Niederenergie-MS-Modus; (2) das TIC-Chromatogramm für den Hochenergie-MS-Modus;
und (3) das TIC-Chromatogramm
für den
MS-MS-Modus.
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Die
bei 20.9; 23.5 und 25.5 Minuten eluierenden Chromatogramm-Peaks
werden in den in den Spuren (1) und (2) angezeigten Chromatogramme zerhakt.
Dies deshalb, weil für
diese drei Peaks das System in den MS/MS-Modus durch das Eluieren
der Peaks umschaltete. Angedeutet ist dies in der Spur (3), welche
die Zeitpunkte darstellt, zu denen die MS/MS-Spektren aufgenommen
wurden.
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19 zeigt
von unten nach oben die folgenden Massenspektren: (1) das Niederenergie-Massenspektrum bei
25,335 Minuten in dem Durchgang; (2) das Hochenergie-Massenspektrum bei
25,315 Minuten in dem Durchgang; und (3) das volle MS/MS-Spektrum für den m/z-Bereich
976–978
bei 25,478 Minuten in dem Durchgang.
-
Das
Spektrum in Spur (1) zeigt das Niederenergie-Massenspektrum bei
25.335 Minuten. Es zeigt vornehmlich das doppelt geladene Ion (m/z 976.4)
und das dreifach geladene Ion (m/z 651.6) für ein Peptid mit einer Masse
von 1952 Dalton (1952 u). Das Spektrum in der Spur (2) zeigt das
Hochenergie-Spektrum zur Zeit von 25.315 Minuten und zeigt einen
neuen (nicht markierten) Peak bei m/z 927. Dies muß ein Tochterion
sein, da es in dem Niederenergie-Spektrum nicht vorhanden ist, und
es besitzt eine Differenz von 49 im m/z gegenüber dem Elternion von m/z 976.
Diese Masse entspricht derjenigen des doppelt geladenen H3PO4 ++-Ion.
Das System hat automatisch diese Massendifferenz erkannt und ist umgeschaltet
zur Aufzeichnung des MS/MS-Spektrums von dem m/z-Bereich 976–978. Das MS/MS-Spektum
bestätigt,
daß der
Peak bei m/z 927, der dem Verlust des doppelt geladenen H3PO4 ++-Ion
entspricht, von dem Elternion bei m/z 976 stammt. Es zeigt außerdem weitere
Fragment-Ionen aus jenen Elternionen, so daß dies einer Bestätigung der
Identität
des Peptids entspricht.