JP5008564B2 - 混合物中のタンパク質を同定する方法および装置 - Google Patents

Description

本出願は、本明細書にその全体が参照によって組み込まれる、２００４年５月２０日出願の米国特許仮出願第６０／５７２５３２号の利益を主張するものである。

本出願は、「選択されたイオンクロマトグラムを用いて、前駆体およびフラグメントイオンをグループ化するシステムおよび方法」と題された、代理人文書番号ＷＡＡ−３９３号を有する同時係属出願第ＰＣＴ／ＵＳ０５／ 号に関連する。

本発明は、一般にプロテオミクスに関する。より具体的には、本発明は、質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィを用いて、タンパク質および複合混合物中のペプチドを同定および定量することに加え、質量分析計において前駆体およびフラグメントイオンを生成する複合混合物中の分子を同定および定量することに関する。また、本発明は、質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィを用いて、混合複合物中のペプチドの保持時間を追跡することにも関する。さらに重要なことは、本発明は、前駆イオンの質量の存在を必要としないペプチド同定の方法を提供する。これによって、方法は、化学的に修飾されたペプチドおよび翻訳後に修飾されたペプチドの両方、対立遺伝子の違い、点突然変異体を含んだペプチドの他、照会されるデータベースに蓄積された配列の他のあらゆる修飾を同定することが可能となる。

プロテオミクスは、一般に、タンパク質の複合混合物に係わる研究に関する。プロテオミクスの分野には、生物系におけるタンパク質を研究することおよびカタログ化することを含む。プロテオミクス研究は、典型的には、タンパク質の同定、異なる条件間の相対存在量の差の決定、またはその両方に目を向けている。複合生体試料中のタンパク質を同定および定量することは、プロテオミクスにおいては基本的な問題である。

質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィ（ＬＣ／ＭＳ）は、プロテオミクス研究において基本的なツールになっている。液体クロマトグラフィ（ＬＣ）により未処理のタンパク質またはそのプロテオライズされた（ｐｒｏｔｅｏｌｙｚｅｄ）ペプチド産物を分離し、次に質量分析（ＭＳ）により分析することは、多くの共通のプロテオミクスの方法論の基礎となる。タンパク質の発現レベルの変化を測定する方法は、バイオマーカーを見出すことおよび臨床診断法の基礎を成しうるので非常に関心がある。

従来のプロテオミクス研究では、典型的には、未処理のタンパク質を直接研究するよりもむしろ、対象のタンパク質をまず消化して、タンパク質分解性のペプチドの特定のセットを生成する。次いで、得られたペプチドを、プロテオミクス分析中に特徴付けする。そのような消化に用いる共通の酵素はトリプシンである。トリプシン消化では、複合混合物中に存在するタンパク質は、開裂されてタンパク質分解酵素の切断特異性によって決定されるようにペプチドを生成する。観察されたペプチドの正体および濃度から、当技術分野では知られているアルゴリズムが、親タンパク質の正体および濃度を推定することができる。

ＬＣ／ＭＳ分析では、このペプチド消化は、オンライン液体クロマトグラフィ（ＬＣ）分離に続いて、オンライン質量分析（ＭＳ）によって分離および分析される。理想的には、十分な精度で測定される単一のペプチドの質量は、ペプチドを一意的に同定するのに十分である。しかし実際には、達成される質量精度は、典型的には約１０ｐｐｍ以上である。一般に、そのような質量精度は、質量測定だけに基づいてペプチドを一意的に同定するのには十分でない。例えば、１０ｐｐｍの質量精度では、約１０個のペプチド配列は、典型的なデータベース検索で同定される。質量精度に関する検索の制限を下げて、化学的修飾または翻訳後修飾、Ｈ_２ＯまたはＮＨ_３の損失、点突然変異等を考慮すれば、この配列数は著しく増大するであろう。配列のリポジトリは、典型的には、ホモロジーによって知られている基質へ注釈付けされた翻訳されたＤＮＡ配列を含む。したがって、ペプチドの配列を、欠失または置換のいずれかによって修飾する場合、前駆体質量のみによってそのペプチドに仮同定することは誤りになるはずである。

さらに、２個のペプチドは、同じアミノ酸組成を有するが、配列は異なり得る。質量精度だけで、組成ではなく配列の異なるペプチドを区別するのに十分ではない。ペプチドをフラグメントイオンに破壊するフラグメント化法が知られている。これらのフラグメントは、元のペプチドのサブ配列に相当し得るが、他のタイプのフラグメントイオンが観察されるかもしれない。このデータのフラグメント質量を用いて、前駆体配列を確認または推定することができる。

ペプチド前駆体の場合、サブ配列は、前駆体の単一ペプチド結合においてフラグメント化することにより生じ得る。このようなフラグメント化によって、２個のサブ配列が得られる。ペプチドＣ末端を含んだフラグメントがイオン化されると、Ｙイオンと呼ばれ、ペプチドＮ末端を含んだフラグメントがイオン化されると、Ｂイオンと呼ばれる。

知られているタンパク質同定法は、ＬＣ／ＭＳ試験から得られた前駆体およびフラグメントの正確な質量保持時間（ＡＭＲＴ）データを用いてデータベースを検索する。例えば、そのようなデータを取得する方法は、Ｂａｔｅｍａｎへの米国特許第６７１７１３０号（以下「Ｂａｔｅｍａｎ」）に記載されており、その全体を本明細書に参照によって組み込む。Ｂａｔｅｍａｎでは、ペプチド混合物の１回の注入のＬＣ／ＭＳ分析の一部として適用される、高エネルギーおよび低エネルギー切り換えプロトコルを用いて、そのようなデータを取得することができる。このようなデータでは、低エネルギースペクトルは、主にフラグメント化されていない前駆体からのイオンを含み、高エネルギースペクトルは、主にフラグメント化された前駆体からのイオンを含む。

そのようなデータにおいてタンパク質の存在を同定するために、（ペプチドまたはフラグメントからのそれらのイオンを実験的に記載する）ＡＭＲＴが、低エネルギーデータから選択される。トリプシンが消化に用いられる場合、このＡＭＲＴは、トリプシン前駆体であると仮定される。このＡＭＲＴデータを用いて、知られている方法が、ペプチド質量のデータベースを検索して、質量が質量検索窓または閾値内にあるトリプシンペプチドを求める。

データベースからの理論的なペプチド質量が、データ内で測定されたある前駆体の質量の質量検索窓内にある場合、ヒットしたとみなされる。すなわち、データの前駆体が、データベースのペプチドによってヒットした、または別法として、データベースのペプチドが、データの前駆体によってヒットした。

この検索によって、データベースから一致する可能性のあるペプチドのヒットリストが得られる。これらの一致する可能性のあるデータベースのペプチドを、統計学的要因によって重み付けしてもよいし、しなくてもよい。このような検索の考えられる結果としては、一致する可能性のあるデータベースペプチドは、同定されないか、一致する可能性のある１つのデータベースペプチドが、同定されるか、あるいは一致する可能性のある２つ以上のデータベースペプチドが、同定されるということである。ＭＳの分解能が高くなるほど、適した器具較正が想定され、ｐｐｍ閾値が小さくなるほど、したがって同定の誤りは少なくなる。

データベース中の理論上のペプチドに対して１つ以上のヒットがある場合、従来の検索は、高エネルギーのＡＭＲＴからのデータを用いて、可能性のある一致するデータベースのペプチドを検証する。高エネルギーのＡＭＲＴが、最初に検索されて、検証中の低エネルギーのＡＭＲＴと同じ保持時間にて生じる高エネルギーのＡＭＲＴを分離する。典型的には、分離された高エネルギーのＡＭＲＴは、保持時間が検証中の低エネルギーのＡＭＲＴと実質的に同じであるＡＭＲＴである。

ヒットリストのデータベースのペプチド各々について、そのアルゴリズムは、前駆体の衝突誘起解離を通して取得され得る可能性のあるすべてのＹイオンおよびＢイオンの質量を決定する。対で、この分離された高エネルギーのＡＭＲＴデータが、これらのＹイオンおよびＢイオン各々について検索される。最大のヒット数を有するかまたは他の基準を満たすペプチド配列が、正確にヒットしたもの、すなわち標的前駆体の同定として戻される。この結果は、保存および表示され得る。

消化混合物中の低エネルギーの各ＡＭＲＴについて、この工程を繰り返すことができる。結果を格納し、結果を表示し、結果を定量し、他の注入の結果と結果を組み合わせることを含むさらなる分析を、結果に対して行うことができる。

検索中、複数の電荷状態および複数の同位体を、検索することができる。また、イオン、すなわち電荷が減少されたＡＭＲＴを検索してもよい。さらに、実験的に生成された信頼規則を適用して、有効なヒットを同定することを支援し、より高い数の高エネルギーヒットを用いれば、さらに良い信頼が得られる。

要約すると、ＬＣ／ＭＳシステムによって取得されたデータのセットを考えると、知られたタンパク質同定法は、理論上のタンパク質配列のデータベースを検索して、そのデータ中のタンパク質を同定する。すなわち、知られたタンパク質同定法は、そのデータとともに開始され、データベースを検索する。対照的に、以下に記載の本発明は、データベースとともに開始され、データを検索する。

従来のタンパク質同定法とは対照的に、本発明の実施形態は、（常にではないが一般に、タンパク質データベースから取得される）理論上のペプチド配列とともに開始され、該理論上のペプチド配列に相当する前駆体およびフラグメントイオンの証拠がないかどうかデータを検索する。十分な数のそのような質量が、共通の保持時間でデータ中に見付かれば、データ中でペプチド配列が同定される。この方法が、データ中に所与のタンパク質に関連する１つ以上のペプチド配列を見付けた場合、そのタンパク質は、試料中で同定されるとみなされる。

本発明の実施形態は、事前に選択されたデータベースを利用してＬＣ／ＭＳシステムを用いて取得されたデータを検索する。例えば、本発明の一実施形態では、液体クロマトグラフ（ＬＣ）によって出力される溶離液が、ＥＳＩインターフェースを介して質量分析計（ＭＳ）に導入される。ＭＳの第１の四重極（Ｑｌ）は、単にイオンガイドとして機能する。交流電圧が、衝突セルに印加される。スペクトルは、Ｂａｔｅｍａｎに記載されたような交流様式で、すべての前駆体およびそのフラグメントのすべてにおいて収集される。

より具体的には、本発明の実施形態は、スペクトル低エネルギーモードと高エネルギーモードとの間で時間において均一に交番するスペクトルを収集する。高エネルギーのフラグメント化の前に適用されるＭＳスペクトルの選択はない。該高エネルギーモードスペクトルは、すべての前駆イオンのフラグメントイオンを含む。この交番するモードのデータ取得のデューティサイクルは高いので、検出された前駆体およびフラグメントすべてのクロマトグラフプロファイルが保存される。このデータ取得モードは、保持時間の決定または測定の他、低エネルギーモードおよび高エネルギーモードにおいて見られるすべてのイオンのｍ／ｚおよび強度決定または測定を可能にする。

低エネルギーモードは、従来のＬＣ／ＭＳ取得に相当する。高エネルギーモードは、本明細書では代替的に上昇エネルギーモードと呼ぶ。高エネルギーまたは上昇エネルギーモードは、ＬＣ／ＭＳ^Ｅ取得に相当する。低エネルギーモードは、一次前駆イオンのスペクトルを含む。高エネルギーモードは、一次フラグメントイオンのスペクトルを含む。

用語
本明細書で用いられるように、以下の用語は指定された意味を有する。
タンパク質：単一ポリペプチドとしてまとめられたアミノ酸の特異的な一次配列。
ペプチド：タンパク質の一次配列内に含まれる、単一ポリペプチドとしてまとめられたアミノ酸の特異的配列。
トリプシンペプチド：トリプシンによるタンパク質の酵素学的切断から得られる、タンパク質配列から生成されるペプチド。これに続く説明では、消化ペプチドは、便宜上トリプシンペプチドと呼ぶ。しかし、本発明の実施形態は、ペプチド消化のための他の方法に適用されることを理解されたい。
前駆体ペプチド：タンパク質切断プロトコルを用いて直接生成される、トリプシンペプチド（または他のタンパク質切断産物）。試料からの前駆体ペプチドは、クロマトグラフで分離され、質量分析計に送られる。質量分析計では、イオン源が、これらの前駆体ペプチドをイオン化して、正電荷のタンパク化合された前駆体の形態を生成する。このような正電荷のタンパク化合された形態の質量は、前駆体のｍｗＨＰｌｕｓまたはＭＨ＋と呼ぶことができる。以下では、「前駆体質量」という用語を使用し、これは一般にイオン化されたペプチド前駆体のタンパク化合されたｍｗＨＰｌｕｓまたはＭＨ＋質量を指す。
フラグメント：複数のタイプのフラグメントが、ＭＳ^Ｅスペクトルで生じ得る。トリプシンペプチド前駆体の場合、フラグメントは、未処理のペプチド前駆体の衝突フラグメント化から生成され、そのアミノ酸一次配列が元の前駆体ペプチド内に含まれた、ポリペプチドイオンを含み得る。ＹイオンおよびＢイオンは、そのようなペプチドフラグメントの例である。トリプシンペプチドのフラグメントは、アンモニウムイオン、リン酸イオン（ＰＯ_３）などの官能基、特定の分子または分子のクラスから切断された質量標識、または前駆体からの水（Ｈ_２Ｏ）分子またはアンモニア（ＮＨ_３）分子「ニュートラルロス」も含み得る。

ＹイオンおよびＢイオン：ペプチドがペプチド結合においてフラグメント化する場合、また電荷がＮ末端フラグメントに保持される場合、そのフラグメントイオンは、Ｂイオンと呼ばれる。電荷がＣ末端フラグメントに保持される場合、そのフラグメントイオンは、Ｙイオンと呼ばれる。可能性のあるフラグメントおよびその命名のよりわかりやすいリストは、ＲｏｅｐｓｔｏｒｆｆとＦｏｈｌｍａｎ、Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、１９８４年、１１（１１）：６０１、およびＪｏｈｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ１９８７年、５９（２１）：２６２１：２６２５に提供されており、本明細書にともに参照によって組み込まれる。

クロマトグラフプロファイル：ＬＣ／ＭＳ分析において、単一の前駆体またはフラグメントイオンに相当する単一の質量におけるクロマトグラフピークの強度対時間である。質量クロマトグラムは、そのような１つ以上のイオンのクロマトグラフプロファイルを含み得る。

頂点保持時間またはクロマトグラフ保持時間：ＬＣ／ＭＳ分析中に、エンティティがその最大強度に達するときのクロマトグラフプロファイルのポイントである。

イオン：各ペプチドは、構成要素の同位体の天然存在度に起因するイオンの集団として出現する。イオンは、保持時間およびｍ／ｚ値を有する。質量分析計（ＭＳ）は、イオンのみを検出する。このＬＣ／ＭＳ法は、検出されたどのイオンについても種々の観察された測定値を生成する。これには、電荷対質量比（ｍ／ｚ）ｍ、保持時間、およびそのイオンの信号強度を含む。

ｍｗＨＰｌｕｓ：ペプチドの中性のモノアイソトピック質量＋１つのプロトンの重量１．００７８２５ａｍｕ。

ＡＭＲＴ：正確な質量保持時間である。ＡＭＲＴは、その質量、保持時間、および総強度の点のペプチドの経験的記載である。ペプチドがクロマトグラフカラムから溶出するとき、ペプチドは、特定の保持時間間隔にわたって溶出し、単一の保持時間（頂点保持時間）においてその最大信号に達する。イオン化および（場合によっては）フラグメント化の後に、ペプチドは、関連するイオンのセットとして出現する。このセット中の異なるイオンは、共通のペプチドの異なる同位体組成および電荷に相当する。この関連するイオンのセット内の各イオンは、単一の頂点保持時間およびピーク形状を生成する。これらのイオンは、共通のペプチドから生じるので、各イオンの頂点保持時間およびピーク形状は、ある程度の測定許容値内で同一である。各ペプチドのＭＳ取得は、ある程度の測定許容値内ですべて同じ頂点保持時間およびピーク形状を共有する、すべての同位体および電荷状態に対して複数のイオン検出を生成する。

ＬＣ／ＭＳ分離では、単一ペプチド（前駆体またはフラグメント）は、多数のイオン検出を生成し、複数の電荷状態ではイオンのクラスタとして出現する。そのようなクラスタからのこれらのイオン検出のデコンボリューションは、特定の保持時間においては、ＡＭＲＴを生じながら、電荷状態の測定された信号強度の固有のモノアイソトピック質量の単一体が存在することを示唆する。

その配列が、何であるのかは言うまでもなく、それが前駆体であるのか、フラグメントであるのか、または化学修飾されたペプチドであるのかを、ＡＭＲＴから直接推定することはできない。ペプチド以外の分子を、ＡＭＲＴを用いて記載することができる。

タンパク質データベース：本発明の実施形態では、ユーザは、タンパク質のデータベースを選択するか、または供給する。あるいは、デフォルトのデータベースまたは他の所定のデータベースを用いてよい。各タンパク質は、アミノ酸のその一次配列によって記載される。どのデータベース（またはデータベースサブセット）を選択して、データと比較するのかはユーザの責任である。ユーザは、研究中のタンパク質と密接に一致することが意図されるデータベースを選択してもよい。例えば、大腸菌データベースは、大腸菌の細胞溶解物から得られたデータと比較されよう。同様に、ヒト血清データベースは、ヒト血清から得られたデータと比較されよう。ユーザは、サブセットデータベースを選択してよい。ユーザは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔに記載の全タンパク質などのスーパーセットデータベースを選択してよい。ユーザは、アミノ酸の無作為な配列によって記載された、シミュレートしたタンパク質を含むデータベースを選択してよい。このような無作為のデータベースを対照試験に用いて、タンパク質同定システムを評価および較正し、アルゴリズムを検索する。ユーザは、自然に存在する配列または人工配列の両方を組み合わせたデータベースを使用してよい。

タンパク質データベースから、ソフトウェアが、その前駆体から生じるであろう、トリプシン前駆イオン、ＹおよびＢイオン、ならびに可能性のある他のフラグメントイオンの配列および質量を各配列から推定することができる。

図１は、本発明の一実施形態による、生体学的な複合混合物中のタンパク質を同定および定量するシステムの略図である。試料１０２が、インジェクタ１０６を介して液体クロマトグラフ１０４に注入される。ポンプ１０８は、カラム１１０を介して試料を圧送して、カラムを通る保持時間に従って混合物を構成要素に分解する。

カラムからの出力は、質量分析計１１２に入力されて分析に供される。最初に、試料は、脱溶媒和／イオン化装置１１４によって脱溶媒和およびイオン化される。脱溶媒和は、例えば、ヒータ、ガス、ガスと組み合わせたヒータ、または他の脱溶媒和法を含む、脱溶媒和のための任意の方法であってよい。イオン化は、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、マトリックス支援レーザ脱離（ＭＡＬＤＩ）または、他のイオン化法を含む任意のイオン化であってよい。イオン化から得られるイオンは、イオンガイド１１６に印加されている電圧勾配によって衝突セル１１８に供給される。衝突セル１１８を用いて、イオン（低エネルギー）を通すことができるか、またはイオン（高エネルギー）をフラグメント化することができる。例えば、Ｂａｔｅｍａｎに記載されているように、交流電圧を衝突セル１１８に印加して、フラグメント化を生じさせる。スペクトルが、低エネルギー（衝突なし）の前駆体および高エネルギー（衝突の結果）のフラグメントについて収集される。

衝突セル１１８の出力は、質量分析器１２０に入力される。質量分析器１２０は、四重極型、飛行時間型（ＴＯＦ）、イオントラップ型、磁場型の質量分析器の他、これらを組み合わせたものを含む、任意の質量分析器であってよい。検出器１２２は、質量分析器１２２から出てくるイオンを検出する。検出器１２２は、質量分析器１２０と一体であり得る。例えば、ＴＯＦ型質量分析器の場合、検出器１２２は、イオンの強度を計数する、すなわち検出器に衝突するイオン数を計数する、マイクロチャネルプレート検出器であり得る。

記憶媒体１２４は、分析のためにイオン計数値を格納するための永久記録装置を提供する。例えば、記憶媒体１２４は、内蔵または外付けコンピュータディスクであってよい。分析コンピュータ１２６は、その格納されたデータを分析する。記憶媒体１２４に格納しなくても、データをリアルタイムに分析することもできる。実時間解析では、検出器１２２は、被分析データを、最初にそれを永久記録装置に格納せずに直接コンピュータ１２６に送る。

衝突セル１１８は、前駆イオンのフラグメント化を実行する。フラグメント化を用いて、あるペプチドの一次配列を決定し、続いてその元のタンパク質を同定することができる。

衝突セル１１８は、ヘリウム、アルゴン、窒素、空気、またはメタンなどのガスを含む。帯電したペプチドが、ガス原子と相互作用すると、その結果生じる衝突が、１つ以上の特徴的結合に該ペプチドを破壊することによって、該ペプチドをフラグメント化し得る。得られる最も共通するフラグメントが、ＹイオンまたはＢイオンと記載される。このようなフラグメント化は、ペプチド前駆体のＭＳスペクトルを取得する低電圧状態（低エネルギー＜５Ｖ）と、衝突で誘起される前駆体のフラグメントのＭＳスペクトルを取得する高電圧状態（高エネルギー＞１５Ｖ）との間で、衝突セル内の電圧を切り換えることによってオンラインフラグメント化として達成することができる。高電圧または低電圧をそれぞれ用いて、イオンに運動エネルギーを付与するので、高電圧および低電圧を高エネルギーおよび低エネルギーと呼ぶ。

種々のプロトコルを用いて、そのようなＭＳ／ＭＳ取得を取得するために、いつおよびどのように電圧を切り換えるのかを決定することができる。例えば、従来の方法は、標的モードかデータ依存モード（データ依存性解析、ＤＤＡ）かのいずれかで、電圧をトリガする。これらの方法は、結合された、標的の前駆体の気相分離（または事前選択）も含む。低エネルギースペクトルを取得し、ソフトウェアによってリアルタイムで検証する。所望の質量が、低エネルギースペクトルにおいて指定の強度値に達すると、衝突セル内の電圧が、高エネルギー状態に切り換えられる。次いで、高エネルギースペクトルが、事前に選択された前駆イオンのために取得される。これらのスペクトルは、低エネルギーにて見られた前駆体ペプチドのフラグメントを含む。十分な高エネルギースペクトルが収集された後、高エネルギー衝突分析に適した強度で前駆体質量を継続して検索するために、そのデータ取得は低エネルギーに戻る。

従来の切り換え法を用いることができるが、本発明の実施形態は、電圧が、単純な交番周期で切り換えられる新規なフラグメント化プロトコルを用いることが好ましい。この切り換えは、複数の高エネルギースペクトルおよび複数の低エネルギースペクトルが、単一のクロマトグラフピークに含まれるように、十分に高い頻度で行われる。従来の切り換えプロトコルと違い、この周期は、データの内容とは無関係である。

要約すると、各試料１０２が、ＬＣ／ＭＳシステムに注入される。ＬＣ／ＭＳシステムは、スペクトルの２つのセット、つまり低エネルギースペクトルのセットおよび高エネルギースペクトルのセットを生成する。低エネルギースペクトルのセットは、前駆体に関連するイオンを主に含む。高エネルギースペクトルのセットは、フラグメントに関連するイオンを主に含む。これらのスペクトルは、記憶媒体１２４に格納される。データ取得後、これらのスペクトルを記憶媒体から引き出し、表示し、分析コンピュータ１２６で取得後アルゴリズムによって処理することができる。

高低プロトコルによって取得されたデータは、低エネルギーモードおよび高エネルギーモードで収集されたすべてのイオンおよびＡＭＲＴの保持時間、質量対電荷比、および強度を、正確に決定することを可能にする。一般に、異なるイオンは、２つの異なるモードで見られ、次いで、各モードで取得されたスペクトルを、別個に分析して、それぞれのモードで観察されたイオンの保持時間、質量電荷比、および強度が決定される。

１つのモードまたは両モードで見られるような共通の前駆体からのイオンは、同じ保持時間およびピーク形状を共有する。高低プロトコルは、モード内またはモード間でイオンの保持時間およびピーク形状の意味のある比較を可能にする。次いで、この比較を用いて、低エネルギースペクトルおよび高エネルギースペクトルの両方で見られたイオンを、それらの共通の保持時間およびピーク形状によってグループ化することができる。図２、図８、および図９、ならびに以下の考察は、低エネルギースペクトルおよび高エネルギースペクトルを用いて、共通の保持時間およびピーク形状を有するイオンをどのように見付け出すことができるかを示す。

図２は、本発明の一実施形態による、交番に低エネルギーモードおよび高エネルギーモードを印加することにより得られるピークの溶出中にスペクトルが得られた時間を示している。図２は、クロマトグラフプロファイルおよび前駆体に関連するイオンの保持時間を、高エネルギーおよび低エネルギー両方のスペクトルデータに再構築することができることを示す。

ピーク２０２は、単一の前駆体のクロマトグラフの溶出プロファイルを表す。横軸は溶出時間である。縦軸は任意であり、クロマトグラフカラムから溶出するときの前駆体の時間で変わる濃度、クロマトグラフプロファイルを表す。

図２のプロット２０４ａ（低エネルギー）および２０４ｂ（高エネルギー）は、同じクロマトグラフピーク２０２を表しており、横軸は時間を表し、縦軸はイオンの強度を表す。

質量分析計に通される溶出分子は、低および高の両方のエネルギーモードでイオンを生成する。低エネルギーモードで生成されたイオンは、主に、可能性のある異なった同位体状態および電荷状態にある前駆イオンのイオンである。プロテオミクス研究では、前駆イオンは、未処理のタンパク質の酵素消化（典型的にはトリプシン消化）から生成されたペプチドである。高エネルギーモードでは、イオンは、主に異なった同位体およびそれら前駆体のフラグメントイオンの電荷状態である。高エネルギーモードは、上昇エネルギーモードと呼ぶこともできる。

ピーク２０２のプロットでは、交番の異なる密度のグラフは、示したクロマトグラフピークの溶出中に、低エネルギー電圧および高エネルギー電圧を用いてスペクトルを収集したときの時間を表す。このバーは、時間毎に均一に交番に入れ替わっている。プロット２０４ａは、低エネルギー電圧を衝突セルに印加して、その結果低エネルギースペクトルが得られたときの時間を例示的に示している。プロット２０４ｂは、高エネルギー電圧を衝突セルに印加して、その結果、高エネルギースペクトルが得られたときの時間を示している。図において２０４ａおよび２０４ｂに示すように、クロマトグラフピークは、高エネルギーモードおよび低エネルギーモードによって複数回サンプリングされる。これらの複数の試料から、ピークに関連し、高エネルギースペクトルおよび低エネルギースペクトルにおいて観察されるイオンすべての正確な保持時間を、推定することができる。これらの正確な保持時間は、個々のスペクトルによってサンプリングされた強度を内挿することによって得られる。

ある保持時間ｔ_ｒにて溶出する分子の場合、関連するすべてのイオンは、ある程度の測定精度内で正確に同じ保持時間で溶出するのが観察されよう。この現象を、図８Ａ〜図８Ｂおよび図９Ａ〜図９Ｃに示す。共通の前駆体に関連するイオンは、同一のクロマトグラフピーク形状を有する。図８Ａ〜図８Ｂは、Ｚ＝＋２イオンである同位体を含んだ７２．５分で抽出した例示的なスペクトルを示す。図８Ａ〜図８Ｂに示した６個のイオン８０２ａ〜８０２ｆ（質量７４０ａｍｕ〜７４２．５ａｍｕで出現する）は、ヒト血清中のセロトランスフェリン前駆体タンパク質からのトリプシンペプチドの同位体である。このペプチドの配列は、ＭＹＬＧＹＥＹＶＴＡＩＲである。このイオンの質量対電荷比（ｍ／ｚ）間の間隔は、０．５ａｍｕであり、イオンの電荷がＺ＝２であることを示す。Ｚ＝２では、^１２Ｃモノアイソトピックイオンのｍ／ｚ値は、７３９．９６ａｍｕである。

図８Ｂは、図８Ａに示した６個のイオン各々に相当する一続きの質量クロマトグラムを示している。垂直方向線８０４で示すように、各イオンの保持時間は、同じ値７２．５３分を有しており、各イオンのクロマトグラフの頂点は、同じ１回の走査に入ることを示している。矢印のある垂直方向線８０４は、６つのクロマトグラフピーク８１２ａ〜８１２ｆ各々の保持時間が、同じであることを示しており、一番上のプロットに見られるイオンは、共通の前駆体に関連していることが裏付けられる。

図９Ａは、多数のスペクトルピーク９１０〜９１６を示す例示的な高エネルギースペクトルのプロットである。図９Ｃは、図９Ａに出現するピークのいくつかに相当するクロマトグラフプロファイルを示す一続きのプロットである。スペクトルピーク９１０、９１１、９１２、および９１３は、ピーク９２０、９２１、９２２、および９２３のような、図９Ｃに描かれたものに相当するクロマトグラフピークを有する。これらの４つのスペクトルピークのクロマトグラフピークは、実質的に同じピーク形状および保持時間を有し、それらが同じペプチドからのものであるという仮説と一致する。スペクトルピーク９１４、９１５、および９１６は、クロマトグラフピーク９２４、９２５、および９２６に相当する。ピーク９２４、９２５、および９２６の保持時間は、それらのピーク形状と実質的に同じであり、スペクトルピーク９１４、９１５、および９１６が、同じペプチドからのものであるという仮説と一致する。

図９Ｂは、ピーク９１０の保持時間と同一の保持時間を有するスペクトルピークのみを描いている。したがって、ピーク９１０、９１１、９１２、および９１３のみを、図９Ｂの垂直方向線９３０、９３１、９３２、および９３３のように再度描いている。保持時間の一致が外れているので、図９Ａの他のピークはすべて除外し、図９Ｂには描いていない。この例は、クロマトグラフ情報を用いて、関連するペクトルピークを選択することができるか、または関連しないピークを除外することができることを実証している。以下に記載のように、本発明の実施形態のＰＤＳアルゴリズムは、低エネルギーおよび高エネルギー両方のスペクトルにおいて見られるような前駆体とそのフラグメントとの間の保持時間の一致に依存する。

図３Ａ〜図３Ｃは、本発明の一実施形態のペプチド同定方法のフローチャートである。参照しやすいように、本発明の方法を、ペプチドデータ検索（ＰＤＳ）アルゴリズムと呼ぶ。正確な質量データベース中のあるタンパク質に相当するペプチド配列を考えると、本発明の実施形態は、そのデータを検索して当該ペプチド配列が存在するかどうか決定する。ペプチドの保持時間に関するこれまでの知識は、必要とされない。しかし、ペプチドが溶出する時間の範囲がわかれば、検索されるデータＡＭＲＴの数を低減するのに役立つ。この低減によって計算が速くなり、偽陽性検出率は下がる。これは、またより低い検出閾値（以下に記載）を検出クロマトグラムに適用することを可能にする。

データを検索する前に、低エネルギーおよび高エネルギー両方のデータから、イオンまたはＡＭＲＴを取得しなければならない。図３Ａは、本発明の一実施形態によるイオンまたはＡＭＲＴを取得する方法のフローチャートである。図３Ａの方法を低エネルギーおよび高エネルギーのデータに適用して、所要のイオンまたはＡＭＲＴを取得する。

工程３０２では、収集されるスペクトルが、ハードドライブから読み取られる。工程３０４では、イオンがスペクトルから検出される。例えば、本明細書に参照によって組み込まれる、Ｂａｔｅｍａｎ（米国特許第６７１７１３０号）に記載のような、スペクトルクロマトグラムおよび質量のクロマトグラムに適用されるピーク発見アルゴリズムによって、または「液体クロマトグラフィ／質量分析データにおいてピークを同定し、スペクトルおよびクロマトグラムを生成する装置および方法」と題する、２００５年２月１１日出願の同時係属の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０５／０４１８０号（「国際特許出願第４１８０号」）に記載の２次元畳み込み法によって、イオンを検出することができる。本発明の一実施形態では、測定されるイオンの特性は、その保持時間、質量対電荷比（ｍ／ｚ）、および強度である。工程３０４は、これらのイオン特性のリストをテーブルに格納する。このテーブルから、これらのイオンおよびそれらの特性のリストが、方法３０６に入力される。方法３０６は、正確な質量保持時間（ＡＭＲＴ）を決定し、ＡＭＲＴパラメータをテーブルに書き込み、これらのパラメータを格納する。

ＬＣ／ＭＳ試験では、ペプチドは、イオンのセットとして出現し、各イオンは、異なった同位体および電荷状態にあるペプチドに相当する。ＡＭＲＴは、ペプチドによって生成されたイオンのセットである。ＡＭＲＴの特性は、ＡＭＲＴを含んだそのイオンのセットから決定される。

あるＡＭＲＴは、工程３０４において取得されたイオンリストからのイオンのセットに相当する。したがって、方法３０６は、イオンリストをイオンのセットに分解する。ここで各セットはＡＭＲＴである。ＡＲＭＴの特性が、そのようなセットから決定される。ＡＭＲＴは、４個のパラメータ、すなわち、保持時間、ｍｗＨＰｌｕｓ、強度、および部分電荷状態によって記載される。ＡＭＲＴは、少なくとも２個以上のイオンのセットからなる。その電荷を確立するため、故にＡＲＭＴのｍｗＨＰｌｕｓを確立するためには、２個以上イオンが必要である。

ＡＭＲＴの保持時間およびｍｗＨＰｌｕｓは、最小の質量、つまりそのセット中のモノアイソトピックイオンの保持時間およびｍｗＨＰｌｕｓである。ＡＭＲＴの強度は、そのセット中のイオンの強度の合計である。部分電荷状態として知られた性能指数を、各ＡＭＲＴについて導くことも可能である。この部分電荷状態は、ＡＭＲＴ強度に対するそのイオンの部分強度によって重み付けされた各イオンの電荷の合計である。セットへとまとめられないイオンは、それらの保持時間、ｍ／ｚ、および強度によって記載される単一イオンとして扱われる。単一イオンは、そのイオンに対する電荷が、規則によって仮定または割り当てられる場合、ＡＭＲＴであると効果的にみなすことができる。

ペプチドのｍｗＨＰｌｕｓは、中性で、そのペプチドのモノアイソトピック質量に１個のプロトンの質量を加えたものであり、［Ｍ＋Ｈ］、またはｍｗＨＰｌｕｓ、あるいはＭＨ^＋と呼ばれる。その原子が、すべてその最も低い質量、最も豊富な同位体状態にあるときには、そのモノアイソトピック質量Ｍが、ペプチドの質量である。

ペプチドに適用されるようなＰＤＳおよびＥＤＡアルゴリズム（以下に記載）は、入力として、ＡＭＲＴの保持時間、ｍｗＨＰｌｕｓ、および強度を取る。この単一イオンのリストは、ＡＭＲＴリストとともに格納される。単一イオンは、そのイオンに対する電荷が、規則によって仮定または割り当てられる場合、ＡＭＲＴであると効果的にみなすことができる。したがって、ＰＤＳおよびＥＤＡアルゴリズムへの入力として、場合によっては、単一イオンをＡＲＭＴリストとともに含むことができる。あるいは、工程３０６を飛ばして工程３０４において取得されるように、ＰＤＳおよびＥＤＡアルゴリズム（以下に記載のような）を、そのイオンのみに適用することができる。

工程３０６で実施されるアルゴリズムは、ペプチドの質量分析特性の知られた特性を利用する。ペプチドは、異なる値ｍ／ｚでイオンのセットとして、質量スペクトルで出現することが知られている。そのようなスペクトルの例は、本明細書に参照によって組み込まれる、Ｂａｒｂａｒａ Ｓｅｌｉｇｅｒ Ｌａｒｓｅｎ（編集）、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｎ．ＭｃＥｗｅｎ（編集）、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒによる、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、第２版（１９９８年３月１日）、３４〜４６頁に記載されている。

ぺプチドイオンは、ｍ／ｚ＝［Ｍ＋Ｚ×Ｈ＋Ｎ×１．００３］／Ｚ＝［Ｍ＋Ｎ×１．００３３５］／Ｚ＋Ｈの可能性のある質量対電荷比を有し得る。式中、Ｍは、中性ペプチド、Ｈ＝１．００７２８ａｍｕのモノアイソトピック質量であり、ペプチドの電荷によるプロトンの質量であり、Ｚは、ぺプチドの電荷であり、Ｎは、ペプチドの同位体数（整数）であり、１．００３３５ａｍｕは、^１３Ｃ同位体と^１２Ｃ同位体との間の質量差である。この質量差は、同じペプチドの同位体間で生じる実際の質量差の近似値である。

Ｎ＝０に対する値は、このモノアイソトピック状態に相当する。次いで、Ｎ＝０およびＺ＝１に対するペプチドのモノアイソトピック質量は、［Ｍ＋Ｈ］である。

図８Ａは、単一のペプチドに関連する６個のイオンのセット８０２ａ〜８０２ｆを含む質量スペクトルの一部を示している。このようなセットは、共通してクラスタ、またはイオンクラスタと呼ばれる。このクラスタのイオン間のｍ／ｚの間隔は、０．５ａｍｕであり、そのイオンが、電荷Ｚ＝２を有するペプチドの異なった同位体状態であるという証拠である。最小質量のイオンが、モノアイソトープであり、ｍ／ｚ＝７３９．９６で出現する。このペプチドのｍｗＨＰｌｕｓは、７３９．９６×２−１．００７３９＝１４７８．９１ａｍｕであると推定される。このペプチドが電荷Ｚ＝１で出現する場合、そのモノアイソトープは、１４７８．９１ａｍｕというｍ／ｚで出現し、そのペプチドがＺ＝３で出現する場合、そのモノアイソトープは、（１４７８．９１＋２）／３＝４９３．６４ａｍｕで出現する。ペプチドの質量スペクトルは、１つ以上のイオンのクラスタからなるものとして表すことができる。各クラスタは、同じ電荷のイオンに相当する。異なるクラスタは、異なる電荷状態にあるイオンに相当する。

ここで生成されたＬＣ／ＭＳデータでは、ＡＭＲＴは、イオンのセットとして出現する（ここで、各イオンは、保持時間、ｍ／ｚ、および強度によって表される）。工程３０４で取得されたイオンリストから、イオンのセットを推定することは容易である（ここで、各セットは、ＡＭＲＴに相当し、このようなＡＭＲＴの各々は、ペプチドに相当すると推定される）。各ＡＭＲＴはペプチドから由来するものと仮定されるので、規則を利用してそのようなセットに達することができる。例えば、（Ｂａｔｅｍａｎが記載のように）ペプチドからのイオンは、共通の保持時間で生じるはずであり、そのようなセットのイオン間の質量対電荷関係は、上記規則に一致しなければならない。次いで、方法３０６は、特性がそのような規則を満たすイオンのセットを収集する。そのようなセットの各々は、ＡＭＲＴに相当し、そのようなＡＭＲＴの各々は、ペプチドに相当すると推定される。

次いで３０６における方法を、低エネルギースペクトルから取得されたイオンリストに適用して低エネルギーＡＭＲＴを取得する。高エネルギースペクトルから取得された高エネルギーイオンリストに方法を別個に適用して、高エネルギーＡＭＲＴを取得することも可能である。

要約すると、工程３０６は、ＡＭＲＴが、セットの各イオンが単一の共通のペプチドから生じると推定されるイオンのセットであると決定する。該ペプチドは、前駆体またはフラグメントであり得る。工程３０６は、上に記載し説明したようなペプチドスペクトルの知られた特性、およびそのようなイオンの共通の保持時間を利用して、ＡＭＲＴに相当するイオンのセットを推定する。次いで、工程３０６は、各イオンセットからＡＭＲＴパラメータ（保持時間、ｍｗＨＰｌｕｓ、強度、および部分電荷状態）を計算し、そのパラメータを格納し、各イオンセットを含むイオンを記録する。

それらの電荷状態ＺおよびｍｗＨＰｌｕｓを推定するために、知られているアルゴリズムが、イオンが見られたペプチドスペクトルをデコンボリューションする。そのようなアルゴリズムの一例は、Ｋａｒｌ Ｒ．Ｃｌａｕｓｅｒ、Ｐｅｔｅｒ Ｂａｋｅｒ、およびＡｌｍａ Ｌ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅの「Ｒｏｌｅ ｏｆ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍａｓｓ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ（＋／−１０ｐｐｍ）ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ＭＳ ｏｒ ＭＳ／ＭＳ ａｎｄ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９年、第７１号、２８７１〜２８８２頁に記載されている。そのような別のアルゴリズムは、Ｚｈｏｎｇｑｉ ＺｈａｎｇとＡｌａｎ Ｇ．Ｍａｒｓｈａｌｌの「Ａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ Ｆａｓｔ ａｎｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｈａｒｇｅ Ｓｔａｔｅ Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｍａｓｓ−ｔｏ−Ｃｈａｒｇｅ Ｒａｔｉｏ Ｓｐｅｃｔｒａ」、Ｊ．Ａｍ Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９８年、第９号、２２４〜２３３頁である。これらを、各々本明細書に参照によって組み込む。

しかし、これらの知られているアルゴリズムは、単一のスペクトルのみで働く。したがって、そのようなアルゴリズムは、スペクトルに観察された各ペプチドの電荷状態およびｍｗＨＰｌｕｓを決定することができるが、そのようなペプチドに関する正確な保持時間を決定することはできない。

イオンリストからＡＭＲＴを取得するために工程３０６で用いる方法は、新規なものであり、図１７Ａ〜図１７Ｃに記載されている。図１７Ａは、その方法を要約したものである。工程１７０４は、イオンリスト１７０２を取り、イオンクラスタのセットを決定する。各イオンクラスタは、同じ電荷Ｚおよび保持時間を有するイオンを含む。最も低い質量を有するこのクラスタのイオンが、そのペプチドのモノアイソトピックイオンである。このクラスタのリストは、１７０６でリストに格納され、このリストは、工程１７０８に入力される。

工程１７０８は、このリストを検証し、どのクラスタが、同じ保持時間およびｍｗＨＰｌｕｓであるが、異なる電荷状態を有しているかを決定する。同じ保持時間およびｍｗＨＰｌｕｓならびに異なる電荷状態を有するいくつかのクラスタが出現する場合、１７０８は、これらのクラスタは同じペプチドからのものであるはずであると推定する。該クラスタは、単一のセットにまとめられ、この組み合わされたセットは、単一ペプチドに対するＡＭＲＴである。固有の保持時間およびｍｗＨＰｌｕｓを有するクラスタが出現する場合、それに対応するペプチドが、唯一のクラスタを生成したと推定し、１７０８は、該１つのクラスタがＡＭＲＴであることを決定する。工程１７１０は、ＡＭＲＴおよびクラスタにまとめられなかったイオンを格納する。ＰＤＳおよびＥＤＡアルゴリズムに入力されるのは、この組み合わされたリストである。

図１７Ｂは、工程１７０４が、イオンリスト１７０２からイオンクラスタをどのように同定するかを示している。入れ子式の反復ループが、２つの検索パラメータＺｍおよびＮｍを減少させる。これらの検索パラメータの初期値は、ＺｍａｘおよびＮｍａｘである。各パスにおいては、Ｚｍはそのクラスタの電荷であり、Ｎｍはクラスタに存在するのに必要なイオンの最小数である。低エネルギーイオンの場合、初期値パラメータは、Ｚｍａｘ＝６およびＮｍａｘ＝８である。高エネルギーイオンについては、これらの初期パラメータは、Ｚｍａｘ＝３およびＮｍａｘ＝８である。

工程１７３６は、リスト中の全イオンにわたり、同じ保持時間を有しかつ１．００３３５／Ｚｍだけｍ／ｚで分離されるイオンのすべての対を見付け出す。この値１．００３３５ａｍｕは、^１３Ｃ同位体と^１２Ｃ同位体との間の質量差である。この質量差は、同じペプチドの同位体間で生じる実際の質量差の近似値である。（以下に記載のように）２０ｐｐｍの質量閾値を用いると、この単一の近似値は、１対のイオンが、共通のペプチドの同位体であるかどうかを決定するのに十分である。

工程１７３８は、イオン対をクラスタにまとめる。したがって、イオン７が、イオン１０と対になっており、イオン１０が、イオン１５と対になっている場合、イオン７、１０、および１５は、あるクラスタを形成する。イオン１５が、別のイオンと対になっている場合、そのクラスタは、その１つの付加的なイオンだけ拡大される。標識がつけられていない場合に限り、イオンは対になることが考慮される。最初は、イオンには標識が付けられておらず、すべてのイオンが考慮される。以下に記載のように、次の工程でイオンには標識が付けられる。工程１７３８は、ペアリング要件を満たす可能性のあるすべてのクラスタを決定する。

工程１７３６において適用される保持時間要件は、保持時間窓によって決定され、工程１７３６において適用されるｍ／ｚ要件は、ｐｐｍ窓によって決定される。保持時間窓は、クロマトグラフピーク幅（ＦＷＨＭ）の２０％であり、０．５分（ＦＷＨＭ）のクロマトグラフピーク幅に対して＋／−０．１分である。分解能１５０００のＴＯＦにおけるｐｐｍ窓は、＋／−２０ｐｐｍである。すなわち、それらの保持時間の差がこの窓内に入り、上記のｍ／ｚモデルからのそれらの質量差がそのｐｐｍ窓内にある場合に限り、イオンは対にされる。

工程１７３８では、イオンのセットがクラスタとして記録され、２つの付加的な条件を満たす場合に標識が付けられる。該クラスタ中のイオンの数は、Ｎｍ以上でなければならず、Ｎ＝１およびＮ＝０のイオンの強度比は、そのようなイオンについて想定される値の範囲内になければならない。ｒを、Ｎ＝１のイオン対Ｎ＝０のモノアイソトピックイオンの強度比と定める。クラスタのイオンの強度分布は、よく知られており、上記で引用した参照文献に記載されている。本明細書に記載の方法では、名目上の強度比ｒは、ｒ０＝（ｍｗＨＰｌｕｓ／２０）×０．０１０７によって概算される。式中（ｍｗＨＰｌｕｓ／２０）は、ペプチドの炭素原子数の概算値であり、０．０１０７は、^１２Ｃ原子対^１３Ｃ原子の概算の存在度である。強度比Ｎ＝１対Ｎ＝０のイオンの許容範囲は、４０％またはｒ０×１．４およびｒ０／１．４である。したがって、ｒ＞ｒ０／１．４およびｒ＜ｒ０×１．４であることを必要とする。

これら２つの規則を満たさない場合、工程１７４０および工程１７４２は、イオンに標識を付けず、後に反復する際にそれらイオンを考慮する。これらの規則を適用して、関連しないペプチドからのイオンの偶然のペアを考慮して検出しかつ除去する。

工程１７４４は、工程１７３８で取得されかつ工程１７４０および工程１７４２で受け取られたクラスタに対するクラスタパラメータを取得する。クラスタパラメータは、保持時間、ｍｗＨＰｌｕｓ、強度、および電荷である。クラスタの保持時間およびｍｗＨＰｌｕｓは、そのクラスタの最小質量の保持時間およびｍｗＨＰｌｕｓである。このクラスタの強度は、該クラスタのイオンの強度の合計である。クラスタの電荷は、Ｚｍパラメータである。イオンクラスタが受け取られる場合、工程１７４４は、これらのイオンが最早次の反復中に考慮されないようにイオンに標識を付ける。工程１７４６は、受け取られたクラスタに対するクラスタを形成するイオンを含むクラスタパラメータを格納する。

次の反復は、電荷パラメータＺｍを減少させる。したがって、第２の反復では、電荷Ｚｍ＝Ｚｍａｘ−１を有しかつＮｍ＝Ｎｍａｘ以上のイオンを有するクラスタが見付けられる。反復を継続して、Ｚｍ＝１に達するまでＺｍを減少させる。Ｚｍ＝１に達すると、Ｎｍ＝Ｎｍａｘ以上のイオンを含むすべての電荷状態のクラスタが同定される。Ｚｍ＝１に達した後、次の反復がＺｍ＝Ｚｍａｘをリセットし、Ｎｍ＝Ｎｍａｘ−１となるようにＮｍａｘを１だけ減少させる。この入れ子式の反復は、Ｎｍ＝２になるまで進む。したがって、反復は、外部ループのＮｍについては最大値から最小値まで進み、内部ループのＺｍについて最高値から最小値まで進む。

工程１７５０は、元のイオンリストで見付けられた全クラスタ（クラスタパラメータおよび関連するイオン）、およびクラスタに存在することが見付けられない全イオンを格納する。

工程１７０８の動作を、図１７Ｃに記載する。イオンクラスタのリストをループオーバする１７５０。増分変数ｎｃは、クラスタ数を指し、１に初期化される。工程１７７６は、クラスタｎｃと同じ保持時間およびｍｗＨＰｌｕｓを有する全クラスタを見付け出す。工程１７７８が、そのような他のクラスタが存在しないと決定すると、工程１７８０は、クラスタｎｃがＡＭＲＴであることを記録し、そのパラメータを工程１７８６で格納する。したがって、所与の保持時間では、所与のｍｗＨＰｌｕｓ値を有する唯一のクラスタが存在すれば、そのクラスタは、ペプチドのＡＭＲＴであると考えられる。すなわち、単一クラスタとして出現するペプチドが存在する。そのＡＭＲＴが、ＡＭＲＴリストに加えられる。ＡＭＲＴパラメータは、クラスタパラメータと同じである。

工程１７７８は、１つ以上のクラスタが、クラスタｎｃと同じ保持時間およびｍｗＨＰｌｕｓを有していると決定すると、工程１７８２は、このクラスタのセットはＡＭＲＴであると記録する。工程１７８４は、これらのクラスタを単一のＡＭＲＴにまとめ、それらのパラメータを取得し、１７８６がその結果を蓄積する。すなわち、同じｍｗＨＰｌｕｓを有する複数のクラスタが存在する場合、ペプチドが、これらの異なる電荷状態および同位体状態で出現する複数のイオンを有するデータに存在すると推論する。ＡＭＲＴパラメータは、最も強いクラスタの保持時間、最も強いクラスタのｍｗＨＰｌｕｓであり、強度は、全クラスタの強度の合計であり、部分電荷状態は、各クラスタの部分的な強度によって重み付けされたクラスタの電荷の合計である。

工程１７７８において適用される保持時間要件は、保持時間窓によって決定され、工程１７７８において適用されるｍ／ｚ要件は、ｐｐｍ窓によって決定される。これらのパラメータは、上記のイオン対決定の場合と同じ様式で取得されかつ適用される。

すべてのクラスタがループオーバされると、ループは終了し、結果がすべて格納される。最終結果は、全ＡＭＲＴパラメータおよびそれらＡＭＴＳに関連するイオンの他、クラスタの一部ではなかったイオンを含んだＡＭＲＴリストである。ＰＤＳおよびＥＤＡアルゴリズムに入力されるのはこの最終リストである。

ＰＤＳおよびＥＤＡアルゴリズムへのその他の入力は、標的ペプチド前駆体の配列およびそれらのフラグメント配列である。図３Ｂは、タンパク質配列の選択されたデータベースを用いて、標的前駆体ペプチドを選択する方法のフローチャートである。工程３１０では、適したデータベースが選択される。データベースは、試料中に存在するか存在しやすい可能性のあるすべてのタンパク質に相当するタンパク質配列を含むことが好ましい。データベースでは、各タンパク質は、アミノ酸のその一次配列によって記載される。このような配列から、消化プロトコルの他、疎水性および電荷状態などの他の特性から生じるペプチドを予測することが可能である。例えば、トリプシン消化は、知られているアミノ酸ＫおよびＲで配列を切断する。これらの切断産物に基づいて、ＹイオンおよびＢイオンフラグメントならびに衝突フラグメント化から得られる相当する質量を、予測することができる。したがって、このデータベースは、質量のモデルおよび低エネルギーおよび高エネルギーのスペクトルで生じ得る他の物理的属性を提供する。

タンパク質同定中、データに見られるＡＭＲＴまたはイオンを、データベースに含まれた質量と比較して、取得されたＬＣ／ＭＳデータに存在するペプチドの信頼できる同定をもたらす。理想的には、データ中のすべてのデータベースペプチドが、誤差なしで同定される。

工程３１２では、インシリコ消化が、データベースのタンパク質配列の１つ以上で実行されて、そのデータベースにおいて前駆体ペプチドを生成する。インシリコ消化は、上記のものなどの知られている消化特性に基づいた合成消化である。工程３１４では、前駆体ペプチドの正確な質量は、前駆体ペプチドを構成するアミノ酸配列を見ることによって決定される。前駆体ペプチドに対応する正確な質量および配列は、後で使用するのに保存される。

図３Ｃは、本発明の一実施形態の混合物中のペプチドを同定する方法のフローチャートである。方法は、データベースから前駆体ペプチド（標的前駆体）を選択することから開始される。選択されたデータベースのペプチドを用いて、選択されたペプチドに相当するＹイオンおよびＢイオンのフラグメントの質量が、決定されるかまたはデータベースから取得される。このようにして、質量のリストがまとめられる。この質量のリストは、（おそらくは、最低の質量ＹイオンおよびＢイオンを除外した）Ｙイオン、Ｂイオン各々に相当する質量の他、フラグメント化されていない前駆体自身に関連する固有の質量を含む。

前駆体ペプチドを化学修飾したものに相当するものなどの他の前駆体質量およびフラグメント質量を考慮してもよい。このような修飾の例は、グリコシレーションまたはリン酸化によるものがある。ＹまたはＢ結合以外のペプチド結合におけるフラグメント化などの他のフラグメント質量を考慮してもよい。

次いで、このリストの各質量について、ＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ^Ｅデータからの低エネルギーおよび高エネルギー両方のＡＭＲＴを検索する。一致する質量、すなわちヒットは、データベース（前駆体またはフラグメント）からの質量が、（低エネルギーまたは高エネルギーにおいて）データ中で測定された質量の質量検索窓内にあるときに発生する。ヒットしたすべてのＡＭＲＴは、それらの質量、保持時間、および強度とともに記録される。一致する質量、すなわちヒットは、複数の保持時間値域の各々について蓄積される。検出閾値を超える蓄積を有する値域は、標的前駆体と関連しているとみなされる。

以下に記載のように、本方法は、低エネルギーおよび高エネルギーにて見られるＡＭＲＴの保持時間合致を決定的に使用する。また以下に記載のように、本方法は、データベースのペプチドに関連するが同一ではないデータ中のＡＭＲＴを同定することができる。データベースからのペプチドフラグメントに関連する質量が、実質的に同一の保持時間でデータ中に見付けられたＡＭＲＴと有意に重なり合うときに、このような同定を行うことができる。

図３Ｃを参照すると、工程３５０では、前駆体ペプチド（例えば、トリプシンペプチド）は、インシリコ消化ペプチドから選択される。代替的には標的配列または標的前駆体と呼ばれるこのペプチドは、その質量（ｍｗＨＰｌｕｓ）、および工程３５２でのそのＹイオンおよびＢイオンの質量（ｍｗＨＰｌｕｓ）によって記載される。データベース中のどのペプチドも、工程３５０の標的前駆体として選択することができる。

工程３５２では、標的配列およびそのＹイオンおよびＢイオンの正確な質量のリストが決定される。工程３５４では、標的、前駆体配列、およびそのＹイオンおよびＢイオンの質量を用いて、検索許容値（例えば、２０ｐｐｍ）内にｍｗＨＰｌｕｓを有する高エネルギーおよび低エネルギーのリスト中で、データ内の全ＡＭＲＴを検索する。工程３５６では、データベースから検索許容値内までで質量リストの質量と一致するＡＭＲＴを、記録するか、標識を付けるか、あるいは同定する。検索許容値は、ユーザ指定のものであり得るか、知られている統計学的手段によってデータから自動的に決定することができる。ｍｗＨＰｌｕｓ許容値を決定する自動の方法を、以下に記載する。

理想的には、低エネルギースペクトルは、前駆イオンのみを含む。実際、前駆イオンは、イオン源においてフラグメント化することができ、その結果、低エネルギースペクトルは、前駆体のフラグメントイオンを含み得る。このようなイオンは、インソースフラグメントと呼ばれ、一般に減衰された強度で出現する。

理想的には、高エネルギースペクトルは、フラグメントイオンのみを含む。しかし、実際には、前駆イオンの衝突フラグメント化が、完了されていない恐れがあるので、その結果、高エネルギースペクトルは前駆イオンを含み得る。一般にそのような前駆イオンは、低エネルギーモードのそれらの強度に対して減衰された高エネルギーモードの強度で出現する。

したがって、前駆体またはフラグメントの質量は、低エネルギーまたは高エネルギーのいずれかのデータまたはその両方で出現し得る。リストの質量が、低エネルギーＡＭＲＴデータにおいて出現する場合、ＰＤＳアルゴリズムは、そのモードのそのデータにおいて出現するものとして、記録するか、標識を付けるか、あるいは同定する。リストのある質量が、高エネルギーＡＭＲＴデータにおいて出現する場合、ＰＤＳアルゴリズムは、そのモードのそのデータにおいて出現するものとして、記録するか、標識を付けるか、あるいは同定する。したがって、本発明は、そのようなイオンが生成または検出されたモードに関係なく、共通の前駆体分子に由来する全イオンを利用する。

工程３５８では、検出クロマトグラムが形成される。検出可能なレベルのイオンを有する配列が、データ中に存在すると仮定すると、そのような全てのイオンには、工程３５６において実行される検索中に標識が付けられる。しかし、その配列に相当しない他の多くのイオンにも標識が付けられる。検出クロマトグラムは、保持時間インターバル内で標識が付けられるイオン（低エネルギーおよび高エネルギー両方）の数を示し、各保持時間について、垂直方向の信号は、保持時間インターバル中に観察された標識の数である。偽陽性標識の効果は、ベースラインノイズを発生することである。

本発明の一実施形態によれば、検出クロマトグラムは、単純なヒストグラムである。ヒストグラムは、値域のシリーズであり、各値域の中心は、保持時間に相当し、値域の幅は、保持時間インターバルに相当する。ヒストグラムは、単純なワンアップ計数で各ヒットによって形成され、値域は、ヒットした質量の保持時間を含んでいた特定の保持時間インターバルに相当する。

本発明の第２の実施形態によれば、検出クロマトグラムは、蓄積されたガウス形状のピークを用いて導出される。この本発明の第２の実施形態では、ヒットした各ＡＭＲＴは、検出クロマトグラム中でガウス形状のピークで表される。図１４は、第２の実施形態による検出クロマトグラムを生成する方法のフローチャートである。

工程１４０２では、検出ピーク幅が確立される。検出ピーク幅は、各ヒットについて検出クロマトグラムに加えられるガウス形状のピークの幅である。加えられたガウスのピーク（以降、検出ガウスまたは検出ガウスのピークと呼ぶ）の幅を、データ中のクロマトグラフピークのＦＷＨＭの指定された部分に設定する。本発明の一実施形態によれば、この部分は１０％である。したがって、典型的なクロマトグラフピークのＦＷＨＭピーク幅は、０．５分であるなら、検出ガウスのＦＷＨＭは、０．０５分である。

検出クロマトグラムの時間範囲は、分離の時間範囲に相当する。典型的なクロマトグラフピークのＦＷＨＭピーク幅が、０．５分である場合、例えば、検出クロマトグラムのサンプル期間は、その幅の約１％、すなわち０．００５分になるように選択される。工程１４０４では、検出クロマトグラムが初期化される。検出クロマトグラムにおけるすべての地点の初期値は、ゼロに設定される。ヒットした（工程３５０で見付けられた）ＡＭＲＴのリストが、横断（ループオーバ）される。

工程１４０６では、ヒットに相当する検出ガウスのピークが加えられる。これは、ヒットした低エネルギーおよび高エネルギーＡＭＲＴをすべて分析することによって行われる。ヒットした低エネルギーおよび高エネルギーのＡＭＲＴ各々について、（検出ピーク幅の幅を有する）単位高さの単一の検出ガウスが、ＡＭＲＴまたはイオンのそれぞれの保持時間において検出クロマトグラムに加えられる。

異なる質量を有する２つのＡＭＲＴが、同時に溶出する場合、それらの検出ガウスは、ピーク高さ２を有するピークに達する。異なる質量を有するＮ個のＡＭＲＴが、同時に溶出する場合、それらの検出ガウスは、ピーク高さＮを有するあるピークに達する。

検出ガウスの幅は、ピークの保持時間を測定するのに用いる標準誤差に相当する。保持時間の測定の標準誤差を決定する方法を、以下に記載する。

図３に戻ると、工程３６２では、検出クロマトグラムの極大を同定する。ペプチド検出閾値を決定する。ペプチド検出閾値は、ペプチドが同定されたかどうかを決定する。検出閾値を決定することのできる方法を、以下に指定する。例えば、ペプチド検出閾値は、４つのＡＭＲＴになるように選択されてよい。したがって、少なくとも４つのＡＭＲＴが、同じ保持時間窓に存在する場合、ペプチドは同定されたとみなされる。低エネルギーまたは高エネルギースペクトル両方で検出されたＡＭＲＴは、この計数に役立ち得る。

すなわち、工程３６２では、（Ａ）ＡＭＲＴの閾値数以上が、見付けられた場合、（Ｂ）ＡＭＲＴの関連する保持時間が、＋／−０．０５分以内にある場合、および（Ｃ）ＡＭＲＴのｍｗＨＰｌｕｓ値のすべてが、選択されたペプチドデータベース中のフラグメントの分子量および前駆体の分子量の２０ｐｐｍ以内にある場合、データベースの標的ペプチドは、データ中に存在すると決定される。本発明の一実施形態では、検出クロマトグラムは、（Ａ）が真の場合、極大に寄与する質量も、（Ｂ）および（Ｃ）を満たさなければならないというように構築される。この点に対するＰＤＳアルゴリズムは、存在する場合には、この条件を満たし、これによって選択された前駆体（標的前駆体）が存在することを示唆するＡＭＲＴを同定する。

検出閾値を超えるどの極大も、選択されたペプチドがデータ中に存在するか、またはあるペプチドが、選択されたペプチドに密接に関連するデータに存在するかのいずれかを示唆する。この文脈で用いられる場合「密接に関連する」という用語は、データベースペプチドと保持時間ｔ_ｒにてデータ中に見付けられたペプチドとの間に有意な配列の一致が存在することを意味する。前駆体分子量（ｍｗＨＰｌｕｓ）を有するあるＡＭＲＴが、見付けられたかどうかのそのような検出を行うことができることに留意されたい。したがって、１つ以上の保持時間を見付けることができる。

図１５は、本発明の一実施形態による、工程３６２において使用することのできる配列同定およびそれらの保持時間を同定する方法のフローチャートである。図１５に示した方法が終了すると、低エネルギーのＬＣ／ＭＳデータ中で見付けられた標的前駆体の他、配列が、該標的前駆体の配列と関連している（しかし同一でない）低エネルギーのＬＣ／ＭＳデータ中に見付けられた前駆体も同定される。

工程１５０２では、検出閾値が確立される。検出閾値は、検出クロマトグラムに見付けられたすべての極大から決定することができる。検出クロマトグラムの各極大は、ある値を有する。これらの値から、中央値が得られる。検出閾値は、典型的には中間値の約４倍に設定される。この検出閾値は、単なる偶然で検出ピーク幅内に入る可能性があるフラグメントの最大数に相当する。検出閾値の典型的な値は、０．０５分の検出ピーク幅当たり５個から１０個のフラグメントイオンで変わる。

工程１５０４では、閾値を超える検出クロマトグラム中のすべてのピークが記録される。標的ペプチド（または標的のピークに関連する配列を有するあるペプチド）が、そのデータに存在しない場合、ピークは、検出クロマトグラム中に検出されない。他方では、標的ペプチドまたはその標的に関連するある配列を有するあるペプチド、あるいはその両方が、十分な濃度で存在する場合、その検出閾値を超える１つ以上の極大値が存在し得る。

工程１５０６では、閾値を超える検出ピークの保持時間は、そのペプチドの保持時間として取得される。標的ペプチド（または配列に関連する標的ペプチド）が検出されたときのその保持時間の値は、ｔ_ｄである。検出クロマトグラムの高さは、標的ペプチド（または配列に関連する標的ペプチド）について検出されたイオンの概算数を与え、極大の時間における場所は、標的ペプチド（または配列に関連する標的ペプチド）が、クロマトグラフカラムから溶出したときの保持時間である。

図３に戻ると、工程３６４では、各同定のための低エネルギーおよび高エネルギーのＡＭＲＴが収集される。これらのＡＭＲＴは、次の規則にしたがって収集される。すなわち、検出クロマトグラムからの値ｔ_ｄが、ペプチドの溶出時間であると仮定すると、ヒットリストに存在し、検出幅、つまり実験では＋／−０．０５分のｔ_ｄ内にあるすべてのＡＭＲＴが、記録されるか、標識が付けられるか、あるいは収集される。したがって、次いで、これらの収集されたＡＭＲＴは、２つの条件、（Ａ）ＡＭＲＴの関連する保持時間は、ｔ_ｄの＋／−０．０５分にあること、および（Ｂ）ＡＭＲＴのｍｗＨＰｌｕｓ値はすべて、選択されたペプチドデータベース中のフラグメントの分子量および前駆体の分子量の２０ｐｐｍ内にあることを満たす。

この規則によって収集されたＡＭＲＴの数は、ｔ_ｄにおける検出クロマトグラムの高さに近接するであろうが、必ずしもそれと同じではない。ペプチドに関連するＡＭＲＴは、測定誤差のために僅かに異なった保持時間を有し得るので、検出ガウスのピークは、正確には一致しないかもしれない。ＡＭＲＴの保持時間が同じ値を有さない場合、検出閾値を超える検出クロマトグラム中の検出ピークの高さは、整数以外になり得る。しかし、上記の規則によって収集されたＡＭＲＴの数は、明らかに整数の値でなければならない。

工程３６６では、この収集されたＡＭＲＴが格納される。必要に応じて、収集されたＡＭＲＴのスペクトルを表示することができる。工程３６８では、必要に応じて、工程３５０に戻ることによって、検索は、次の前駆体ペプチドについて繰り返される。この検索を繰り返さない場合、工程３７０においてさらに分析を行うことができる。このようなさらなる分析は、結果を他の注入からの結果と組み合わせるか、または同定されたペプチドを定量しながら、その結果を表示することができる。

他の注入からの結果を組み合わせることは、同じペプチドが２回以上の注入で出現するときの保持時間を比較することからなり得る。他の注入からの結果を組み合わせることは、２回以上の注入において見付けられた相当するＡＭＲＴの強度を比較することからなり得る。これらの注入は、同じ混合物の反復注入、または異なる条件下で行われた２つの試料の注入であってよい。

反復注入からの保持時間および強度を、一致するかどうか比較して、ペプチドが正確に同定されたかをさらに確認することができる。この注入が異なる試料（または条件）からの場合、保持時間を一致するかどうか比較して、ペプチドが正確に同定されたかをさらに確認することができ、強度を比較または比率化して、２つの条件間での試料中のペプチドの量の変化を明らかにすることができる。

ペプチド同定のリストに規則を適用して、どのタンパク質が元の試料中に存在するかを推定することができる。

図１６は、同定された配列各々に関連するＡＭＲＴおよびイオンを収集するためのフローチャートである。工程１６０２では、ある保持時間窓が確立される。一般に、保持時間窓は、検出ピーク幅に等しく設定される、この幅は、上の例では＋／−０．０５分である。工程１６０４では、保持時間が検出保持時間ｔ_ｄ上に中心がある保持時間窓閾値内にある、標識の付いたすべての低エネルギーおよび高エネルギーのＡＭＲＴが収集される。検出ピークは、ペプチドが溶出するための保持時間を提供する。保持時間が、検出保持時間ｔ_ｄに中心がある保持時間窓閾値内にあるイオンは、そのペプチドついて検出されたイオンである。このイオンの収集は、低エネルギーおよび高エネルギーでヒットした全イオンまたはＡＭＲＴを含む。これらのイオンは、標的前駆体に相当する質量を含むかもしれないし、含まないかもしれない。

この結果は、検出ピークの頂点に中心がある保持時間窓中で見付けられたイオンである。これらのイオンは、ペプチドフラグメント質量に相当する質量を有し、常にというわけではないが一般に標的前駆体の質量を含む。工程１６０６では、この結果は、記憶装置に格納される。また、工程１６０６では、この結果を、ユーザに表示することができる。

図４Ａは、高エネルギーにおいて見付けられたすべてのＡＭＲＴを示す例示的なプロットである。図４Ｂは、低エネルギーにおいて見付けられたすべてのＡＭＲＴを示す例示的なプロットである。図４Ａおよび図４Ｂでは、縦軸は、ＡＭＲＴのｍｗＨＰｌｕｓであり、横軸は、保持時間である。図４Ｃは、図４Ａおよび４Ｂに示したデータから導出された例示的な検出クロマトグラムであり、所与のペプチド配列についての前駆体質量およびフラグメント質量に相当する保持時間当たりのヒット数を示している。図４Ｃは、ヒット発生のピークが約７８分近くにあることを明白に示している。このピークは、データ中で見付けられた前駆体ペプチドを含む。図４Ｃに観察できる分布は、ヒット発生のピークの重要性を判断することができる、ノイズバックグラウンドを示す。

図５Ａは、所与のペプチド配列についての前駆体質量およびフラグメントの質量に相当する、図４Ａの高エネルギープロットのＡＭＲＴのヒットのみを示す例示的なプロットである。図５Ｂは、所与のペプチド配列についての前駆体質量およびフラグメントの質量に相当する、図４Ｂの低エネルギープロットのＡＭＲＴのヒットのみを示す例示的なプロットである。図５Ｃは、所与のペプチド配列についての前駆体質量およびフラグメントの質量に相当する、図５Ａおよび図５Ｂの高エネルギーおよび低エネルギープロットのヒットのヒストグラムプロットである。図５Ｃは、図４Ｃに類似する例示的な検出クロマトグラムであるが、閾値５０２を加えている。閾値５０２は、ペプチドの存在を示すのに必要なヒット数を示している。配列に関連する明白な前駆体ペプチド５０６が、約７８分の保持時間において同定され、ここでは４０個以上のヒットが計数されている。可能性のある配列に関連するペプチド５０４は、４３分の保持時間において同定される。フラグメント質量に対して低エネルギーＡＭＲＴがヒットしていることは、インソースフラグメント化を裏付けるものである。前駆イオンをインソースフラグメント化すれば、低エネルギースペクトルで観察されるフラグメントイオンが得られる。

ピーク特性を用いて、ペプチド同定をさらに支援することができる。そのような１つの特性は、ピーク形状である。同じ前駆体ペプチドに関連するすべてのクロマトグラフピークは、同じピーク形状およびピーク幅を有さなければならない。しかし、異なるペプチドに関連するクロマトグラフピークは、同じピーク形状および幅を有さないかもしれない。したがって、２種類のペプチドは、同じクロマトグラフ保持時間にて溶出するが、異なるピーク形状および／または幅を有することが可能である。このため、ピーク形状を用いて、別の場合には誤って同定することになるかもしれない同時発生を排除することができる。このピーク形状の特性を用いて、閾値を低減させること、すなわち、同じ保持時間で一致するのに必要なイオン数を用いて、標的ペプチドの存在を示唆することができる。同様に、ピーク形状は、ＡＭＲＴ間の関係を確認することができる。

同じ前駆体ペプチドに関連するすべてのクロマトグラフピークは、同じピーク形状およびピーク幅を本質的に有していなければならないが、そのようなピーク形状または幅の変化は、測定誤差に起因して生じるのが観察されるかもしれない。変化の別の源は、前駆体に関連しない他のピークによる干渉である。

図６Ａ〜図６Ｂに示すように、ピークには、比較してピーク幅およびピーク形状を決定することのできるいくつかの時間がある。これらは、頂点時間（保持時間）、上昇勾配変曲点の時間、および下降勾配変曲点の時間を含む。変曲点は、ピーク形状の２次導関数のゼロ交差の時間から求めることができる。２次導関数は、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタまたは関連する多項式フィルタにより求めることができる。図６Ａは、例示的なクロマトグラフピーク６０２を示している。図６Ｂは、クロマトグラフピーク６０２の２次導関数のプロットを示している。２次導関数のトレースの頂点６０４ならびに変曲点６０６ａおよび６０６ｂの時間を示している。これらの時間を、ピーク形状および幅と比較することができる。参照として、一番下のプロットに見られる時間に相当する一番上のプロットのピークの点を、点線で示している。

下降勾配の変曲点と上昇勾配の変曲点との時間差は、ピーク幅を表す。ガウスのクロマトグラフピークについて、この幅は、ガウスの標準偏差の２倍である。上昇勾配変曲点および下降勾配変曲点のピークの高さの比は、ピーク非対称性またはピーク形状の付加的な尺度である。頂点時間と上昇勾配変曲点および下降勾配変曲点の時間との間の時間差の大きさは、ピーク幅の他の尺度である。これらの時間の比は、ピーク形状または非対称性の尺度である。

ピーク形状を考慮すると、検出クロマトグラムの付加的な処理を行うことができる。上記のように、検出クロマトグラムの極大が見付けられる。その極大中に一致するピークの形状および幅を比較する。その幅または形状が外れ値である場合、ピークが拒否される。

図７は、本発明の一実施形態によるピーク形状およびピーク幅を比較する方法のフローチャートである。工程７０２では、ピークの保持時間が比較される。工程７０４では、ピークの変曲幅が比較される。ピークの変曲幅は、その変曲点間の時間である。例えば、図６Ａ〜図６Ｂの変曲点６０６ａと６０６ｂとの間の時間は、ピーク６０２の変曲幅である。工程７０６では、頂点時間と上昇勾配の変曲時間との差の大きさが比較される。工程７０８では、頂点時間と下降勾配の変曲時間との差の大きさが比較される。

工程７１０では、この時間を分析して、それらが時間閾値に入るかどうかを決定する。本発明の一実施形態では、比較各々の時間閾値は、０．０５分の検出幅である。したがって、そのピークを同じペプチドに相当するものとして考えるには、すべての時間比較は、０．０５分以内に入らなければならない。この閾値は、ユーザ指定のものであるか、または統計学的に決定されてよい。ユーザ指定の閾値または統計学的に決定された閾値は、絶対時間またはピーク幅の一部であり得る。

ピーク形状およびサイズを比べるのに使用される好適なピークは、ペプチドに関連するイオンのクラスタの^１２Ｃモノアイソトピックピークである。この^１２Ｃのモノアイソトープは、すべての同位体がそれらの最も豊富な状態である最低の質量ピークである。イオンのペプチドクラスタの他のピークを、同様に用いることができる。さらに、保持時間ならびに上昇勾配変曲および下降勾配変曲時間の平均値を、ピーク形状および幅の比較に使用することができる。

本発明の第２の実施形態では、ＡＭＲＴを検索する代わりに、またはＡＭＲＴを検索することに加えて、前駆体、フラグメント、およびそれらの同位体に相当するイオンが、検索される。イオンを用いることのある利点は、低強度のペプチドに関し、ペプチドが単一イオンとして出現するかもしれないことである。例えば、ＡＭＲＴを用いるとき、ＡＭＲＴを検出しその電荷状態を確立するためには、少なくとも２個のイオンが必要である。

このイオンベースの検索は、多くの点で上記のＡＭＲＴ検索に類似している。図１０は、本発明の一実施形態によるイオンを用いて、複合混合物中のペプチドを同定する方法のフローチャートである。イオンを用いたＰＤＳアルゴリズムにおける工程の要約は、以下の通りである。

工程１００２では、低エネルギーおよび高エネルギーのイオンが、ペプチド混合物の１回の注入から得られる。ペプチド混合物は、一般にタンパク質試料の消化物から取得される。低エネルギーおよび高エネルギーデータは、上記のような高電圧／低電圧切り換え技術を用いて取得される。工程１００４では、タンパク質のデータベースが選択される。工程１００６では、データベースのタンパク質に相当するペプチドのリストが、ペプチド消化用の規則を用いて取得される。

工程１００８では、標的前駆体が、データベース（例えば、トリプシンペプチド）から選択される。このペプチドは、その質量（ｍｗＨＰｌｕｓ）ならびにそのＹイオンおよびＢイオンの質量（ｍｗＨＰｌｕｓ）から説明される。工程１００９では、データが、選択された前駆体の質量に相当する質量について検索される。これらの質量を考える場合、工程１０１０では、検索許容値（例えば、２０ｐｐｍ以内）内の質量を有する高エネルギーリストおよび低エネルギーリストのデータ中のすべてのイオンが記録される。イオンを検索基準として用いる場合、検索は、複数の電荷状態および同位体数より多くなければならない。電荷状態は、一般に高エネルギーフラグメントについては１個〜３個に制限される。電荷状態は、一般に低エネルギーについては１個〜６個に制限される。

このイオンベースの検索の好適な実施形態では、低エネルギースペクトルから取得されたすべてのイオンの電荷状態は、Ｚ＝２と仮定され、高エネルギースペクトルから取得されたすべてのイオンの電荷状態は、Ｚ＝１と仮定される。Ｚ＝２が、最も一般的に観察されるペプチドの低エネルギーの変化であり、Ｚ＝１が、最も一般的に観察されるペプチドの高エネルギーの変化であるので、これらの割り付けが行われる。また、全イオンの同位体数は、Ｎ＝０と仮定される。すなわち、全イオンは、そのモノアイソトピック状態にあると仮定される。それぞれのイオンのｍｗＨＰｌｕｓ値を決定するために、これらの電荷状態および同位体割り付けが必要である。以下に記載のように、次いで工程１００９において、データベースから取得された質量と比較されるのがこれらのｍｗＨＰｌｕｓ値である。

工程１０１２では、ヒットした各イオンの保持時間が記録される。この段階の出力が、データベースのペプチドからのある質量とヒットした高エネルギーおよび低エネルギーのデータからのイオンのリストである。

上記のような工程１０１６では、合成の検出クロマトグラムが生成される。本発明の一実施形態では、ヒットした各イオンは、以下のように、検出ガウスのピークによって表される。クロマトグラムの時間範囲は、分離の時間範囲に相当する。クロマトグラムのＦＷＨＭピーク幅が、０．５分の場合、例えば、本発明の一実施形態では、検出クロマトグラムのサンプル期間は、その幅の約１％、すなわち０．００５分になるように選択される。検出クロマトグラムの全ての点の初期値は、０に設定される。ヒットしたイオンのリストが、横断（ループオーバ）される。リストの各入力について、ガウス形状のピーク（検出ガウスのピーク）が、検出クロマトグラムに加えられる。検出ガウスのピークの幅は、データのクロマトグラフピークのＦＷＨＭの指定の部分に設定される。本発明の一実施形態では、この部分は１０％である。したがって、検出ガウスのＦＷＨＭは０．０５分である。検出ガウスのピークの幅は、ピークの保持時間を測定するのに用いる標準誤差に相当する。

異なる質量を有する２個のイオンが、同時に溶出する場合、それらの検出ガウスは、ピーク高さ２を有する新たなピークに達する。異なる質量を有するＮ個のイオンが、同時に溶出する場合、それらの検出ガウスは、ピーク高さＮを有する新たなピークに達する。

工程１０１８〜工程１０２６は、上記の図３Ｃの工程３６２〜工程３７０と同様である。検出クロマトグラムの極大は、工程１０１８に見付けられる。閾値が決定される。検出閾値を決定することのできる方法は、以下のように指定される。閾値に対して可能性のある値は、同じ保持時間窓に存在する４個以上のイオン（低エネルギーでのＡＭＲＴを高エネルギーでのＡＭＲＴと合計することによって得られる）である。

検出閾値を超える全ての極大は、データベースのペプチドと同一であるかまたはそれと密接に関連するかのいずれかのあるペプチドがデータ中に存在することを示唆する。極大は、検出の保持時間を決定する。相当な数のイオンを含んだ保持時間は、標的ペプチドがそのデータ中に存在するという示唆である。この保持時間を考えると、この保持時間の閾値内にあり、かつ質量の閾値内にある低エネルギーおよび高エネルギー両方のイオンはすべて、工程１０２０において選択される。付加的な閾値を適用して、これらの要件を満たすイオンの数を決定することができる。工程１０２２では、閾値を超えるイオンのグループが記録される。これらのグループは、ペプチド同定を示唆する。工程１０２４では、付加的な前駆体がある場合、工程１００８に戻ることによって、次の前駆体ペプチドについて検索が繰り返される。工程１０２６では、結果の分析がさらに実行され得る。

検出クロマトグラムを生成する際、関連のあるイオンならどれもあるヒットとして含むために、^１２Ｃイオンは、電荷および同位体クラスタの各々について見られるという付加的な要件を課してもよい。すなわち、^１３Ｃが見られる場合、同じ電荷状態の^１２Ｃが見られない限り計数されない。

上記のＰＤＳアルゴリズムは、従来のペプチド同定法に対して多数の利点を有する。先行技術の問題の１つは、それが、低エネルギーのＡＭＲＴ（またはイオン）は、前駆体ペプチドのみであると仮定することにある。しかし、フラグメント化は、イオン化およびフォーカシング工程の一部として低エネルギー（インソースフラグメント化）で起こり得る。このため、従来のシステムでは、実際は前駆体ではないＡＭＲＴによって、検索を開始することができる。そのような検索は、結果として標的へのヒットにならないか、または標的へのヒットは、結果として誤った偽の同定になるかのいずれかである。このような誤った同定は、偽陽性と呼ばれる。

しかし、本発明の実施形態を用いれば、例えば、図５Ｂからわかるように、低エネルギーにおいて出現するインソースフラグメントが検出される。本発明の実施形態は、低エネルギーおよび高エネルギーのデータのＡＭＲＴを検出するので、実際にはフラグメント（トリプシン前駆体ではない）である低エネルギーのＡＭＲＴがすべて同定される。

本発明の実施形態の別の利点は、検索を行うことができ、かつ前駆体質量を検出しなくても、ペプチド配列を同定することができることにある。すなわち、データベースからのペプチドは、前駆体分子量（ｍｗＨＰｌｕｓ）Ｍを有し得る。従来の方法では、検索は、分子量（ｍｗＨＰｌｕｓ）Ｍを有するペプチドを、データベース中に見付けることによって開始される。データベースが、この分子量を有するペプチドを含んでいない場合、従来のシステムは同定を行わない。

しかし、ペプチド混合物は、データベースから取得されたペプチドに関連しているが同一ではないペプチドを含んでいるかもしれない。例えば、ペプチドは、データベースのペプチドに化学的に関連する試料中に存在するかもしれない。この場合、Ｙおよび／またはＢイオンは存在するかもしれないが、その前駆体ｍｗＨＰｌｕｓは存在しないかもしれない。本発明の実施形態を用いれば、共通の保持時間において過剰に豊富な（検出閾値を超える）イオンは、標的前駆体の配列に密接に関連する分子が、試料中に存在することが裏付けられる。そのような状況を生じ得る工程の例は、タンパク質の一次配列の修飾、またはタンパク質の翻訳後修飾であるか、あるいは消化後に、ペプチドの一末端または他方末端が修飾されるかクリップされる可能性がある。

修飾タンパク質の一次配列の一例は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であり、これは、ＤＮＡ配列中の単一塩基の違いである。ＳＮＰは、１つの変化／１００個の塩基の頻度で生じ得る。ある有機体では、ＳＮＰは、タンパク質データベースから導出された理論上の配列とは、ある単一アミノ酸だけ異なるトリプシンペプチドを生じ得る。この単一アミノ酸の置換は、未修飾の配列の理論上の質量に関連して、前駆体の質量を変えるのに十分である。この置換は、ペプチド配列の残りを無傷のままにしておく。特に、アミノ酸置換のポイントまでは、修飾されたペプチドのＹイオンおよびＢイオンのシリーズは、未修飾の配列のシリーズと同一である。

したがって、ｍｗＨＰｌｕｓ質量Ｍを有するデータベース中のペプチドと実質的に同じ配列を有する、試料混合物中のペプチドが生じるかもしれない。しかし、試料中のペプチドの配列または化学組成が変わると、一般に、その質量の前駆体が変化する。したがって、質量Ｍの前駆体は、そのデータ中に存在しないであろうが、データベースから導出された質量に相当する配列の相当な数のＹイオンおよびＢイオンは、試料データ中に存在する。これらのサブ配列イオンに相当するイオンは、データ中に実質的に同じ保持時間で出現する。したがって、ヒットの蓄積は、データベース中の前駆体の理論上の質量が、そのデータ中に存在することを必要としない。

修飾された配列の保持時間は、一般に、標的配列（存在する場合）の保持時間とは異なる。修飾された配列および標的配列は、異なる２個のペプチド分子に由来する。この２個の分子の各々は、クロマトグラフ分離において異なって保持される。したがって、修飾されたペプチドおよび（未修飾の）標的ペプチドが、ともに試料中に存在する場合、標的配列のための検出クロマトグラムでは、各ペプチドについて１つである２つの検出ピークが出現する。これらの検出ピークの保持時間は、それぞれの分子の保持時間を反映する。

ヒットの質量許容値が、そのデータの固有の質量精度を反映し得ることは、本発明にとって注目に値する。すなわち、質量許容値を広げて、前駆体質量に影響を及ぼすと考えられる配列修飾を考慮する必要はない。修飾された配列の場合、データの固有の質量精度を反映する狭い質量許容値を使用する本発明は、前駆体の理論上の質量を排除する。しかし、そのような狭い質量許容値は、データベースから取得されたＹおよびＢの理論上の質量に相当するデータに存在する、ＹイオンおよびＢイオンにヒットすることをさらに可能にする。

したがって、十分なヒットが、修飾されたペプチドの溶出の保持時間において蓄積すると、ＹイオンおよびＢイオンのみとの一致が、十分なヒットを生成して、そのデータ中に修飾されたペプチドが存在することを検出することができるので、修飾されたペプチドが検出される。本発明は、未修飾のペプチドの理論上のフラグメント質量を用いることによって、修飾されたペプチド配列を検出することができる。

したがって、検索を実行することができるとともに、データベース中のペプチドに関連する試料データ中で、ペプチドを見付けることができる。さらに、試料データは、ヒットしたイオンから部分配列情報を提供することができる。したがって、データベースペプチドのモノアイソトープは、ＬＣ／ＭＳまたはＬＣ／ＭＳ−Ｅデータには存在しないかもしれないが、本発明の実施形態は、データベースペプチドが、可能性のある修飾された形態で試料中に存在することをさらに同定し得る。

修飾されたペプチドの検出を考えると、その保持時間に溶出するデータ中の質量を続いて調査すれば、修飾されたペプチドの正確な配列および質量を明らかにすることができる。例えば、アブイニシオシーケンスアルゴリズムを、データの質量に適用してペプチド配列を決定することができる。

図１１は、約８７分において、データにあることが検出されたデータベースからのペプチドを示している。この保持時間において見られたｍｗＨＰｌｕｓの最高値は、その前駆体のｍｗＨＰｌｕｓと一致している。図１１は、（それが閾値を超えるときには、ノイズに対して想定されるよりも多くの）相当な数のヒットを有すると思われるが、データベース中には前駆体が存在しない、約４９分におけるペプチドの一例も示している。具体的には、約４９分では、約５個のイオンが、共通の保持時間４９分で観察される。ペプチドに関連するｍｗＨＰｌｕｓを有するイオンは見られない。これは、試料中に存在し、かつデータベースのペプチドに化学的に関連する、ペプチドの一例であり得る。該２つのペプチドは、異なった保持時間において溶出し、このことは異なった化学組成を示唆していることに留意されたい。

したがって、図１１のプロットによって示したように、ペプチド混合物は、データベースから取得されたペプチドに関連するがそれと同一ではないペプチドを含み得る。

要約すると、本発明の実施形態は、従来のシステムに対して多数の利点を提供する。これらは、知られたペプチド質量のあるデータベースを用いてデータを検索することを含む。本発明の実施形態は、低エネルギーフラグメントを低エネルギー（トリプシン）前駆体として誤って同定することなく、低エネルギーデータ中のペプチドフラグメント（先行技術は、各低エネルギーＡＭＲＴは前駆体であると誤って推定する）を同定することができる。

データのアーカイブ検索を実行するように、本発明の実施形態を構成することができる。ＭＳの質量分解能が十分に高く、保持時間分解能が十分に高く、高／低切り換えプロトコルを用いてデータが得られる限り、ペプチドを同定することができるはずである。次いで、これらのペプチドの強度および保持時間を、データ中のヒットしたイオンから測定することができる。

さらに、本発明の実施形態は、データのグローバル検索を可能にする。例えば、高エネルギーデータは、世界中でアーカイブすることができ、またこのアルゴリズムを用いてレトロスペクティブに検索することができる。

本発明の実施形態は、共有された配列が同一でない場合、または共有が完全ではない場合であっても、データベース中のペプチドと配列を共有するデータ中のペプチドを検出することができる。例えば、ＹイオンおよびＢイオンの部分配列の存在は、典型的には、ＡＭＲＴをデータベースからのペプチドに関連しているものとして同定するのに十分である。

また、本発明の実施形態は、データベースのペプチドと同じ配列を有するが、化学的に修飾されたデータ中のペプチドを検出する。ＹイオンおよびＢイオンの部分配列の存在は、ＡＭＲＴを、データベースからのペプチドに関連するものとして同定するのに十分である。

本発明の実施形態は、高／低切り換えＭＳ分析において保持時間合致を用いる。クロマトグラフ分解能の改善は、ペプチドを同定する能力の改善に直接つながる。例えば、クロマトグラフピーク幅が低減される（分解能は増大した）ので、検出閾値が低減され得る。本発明の実施形態は、ピーク形状および幅一致をさらに使用して、高／低ＭＳ分析を調整する。

本発明の実施形態は、保持時間特異性を用いて、前駆体、例えば、アンモニア分子などの中性の水分子を失ったペプチドを有するペプチドの化学修飾であるイオンを、さらに同定することができる。ペプチドがデータ中に存在していると同定された後、そのペプチドに関連するすべてのイオンを同定することができる。その結果、これらのより低いレベルのペプチドは、前駆体あるいはＹフラグメントまたはＢフラグメントであると誤って同定されない。

本発明の実施形態は、バックグラウンドノイズの測定を提供する。その結果、データの統計的挙動に基づいて、同定の有意性または信頼性を算出することができる。ヒストグラムよりはむしろ、保持時間インターバルにおけるヒットの数、検出クロマトグラムは、保持時間インターバル内のヒットの最長の連続する配列のみを計数することができる。すなわち、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６、Ｙ７、Ｙ１０がヒットした場合、これらの４個のイオン（Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６、Ｙ７）だけが、Ｙイオンの連続するある配列を形成する。検出ヒストグラムは、保持時間において４個のイオンを含むであろう。検出閾値の有意性は、モンテカルロ手段によって評価することができるか、またはデータからバックグラウンドヒットの統計的特性を取得することによって評価することができる。また、データベースにおけるペプチドの分布を用いてヒットの有意性を評価するように、本発明の実施形態を構成することができる。

本発明の実施形態は、データベース検索において強度規則および配列規則を使用するように構成することもできる。例えば、候補前駆体ＡＭＲＴが、高エネルギーおよび低エネルギー両方のスペクトルで見られる場合、高エネルギースペクトルにおける前駆体の強度を、低エネルギースペクトルにおいて見られる前駆体の強度と比較することができる。ＡＭＲＴがある前駆体である場合、高エネルギーにおけるその強度は、低エネルギーにおける強度未満でなければならない。高エネルギーにおける強度が、低エネルギーにおける強度を超えると測定された場合、低エネルギーおよび高エネルギーにおいて見られるＡＭＲＴは、実際には恐らくさらに別の前駆体フラグメントである。この場合、ＰＤＳアルゴリズムは、低エネルギーＡＭＲＴを可能性のある前駆体として排除するように構成することができ、これにより可能性のある偽陽性同定が除去される。

別の規則の一例として、フラグメントＡＭＲＴの強度が、その前駆体と関連する可能性のある他のフラグメントＡＲＭＴの強度に対して、外れた値であると判断された場合、所与の前駆体とのヒットは削除される。

別の規則の一例として、特定の前駆体配列について、アミノ酸組成は、その前駆体の特定のＹイオンまたはＢイオンが、効果的にイオン化するべきであるということを示すことが考えられる。フラグメントＡＭＲＴの相対強度または絶対強度が、イオン化効率のそのようなモデルと一致しない場合、その不一致は、配列の同定を排除するための根拠を提供し得る。他方では、フラグメントＡＭＲＴの相対強度または絶対強度が、そのようなイオン化効率のモデルと一致する場合、これは、配列の同定を裏付け得る。

ＡＭＲＴを分析することに関する問題は、それらの強度のダイナミックレンジである。データのセットのＡＭＲＴは、大きなダイナミックレンジにわたる強度とともに生じ得る。この強度のダイナミックレンジは、１：１０００以上であり得る。ＭＳ技術の進歩が、このダイナミックレンジを１：１０，０００以上まで拡大することができる。大きなダイナミックレンジは、２つの効果から生じる。第１に、ペプチドの組成の変化は、イオン化効率の変化を生じるので、試料中の所与のタンパク質は、ダイナミックレンジが１：１００以上かもしれないＡＭＲＴを生成し得る。その結果、いくつかのＡＭＲＴは、他のものよりも効果的にイオン化し得る。第２に、濃度のダイナミックレンジが大きい異なるタンパク質が、試料中に生じ得る。

したがって、低強度ＡＭＲＴは、複数の源から生成され得る。例えば、低強度ＡＭＲＴは、ペプチドのイオン化が弱い高濃度のタンパク質から、またはペプチドが効果的にイオン化する低濃度のタンパク質から生じ得る。

したがって、強度の大きいダイナミックレンジは、偽陽性同定の可能性のある源である。イオン化が弱い高濃度のタンパク質からのＡＭＲＴまたはイオンは、低濃度のタンパク質からの高度にイオン化するペプチドから生じるものと誤って解釈される恐れがある。

ダイナミックレンジによって生じるこの複雑さに対処する方法が、開示されている。該方法は、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＥＤＡ）と呼ばれ、低濃度のタンパク質が分析される前に、高濃度のタンパク質に関連するイオンをすべて同定かつ除去する。高濃度のタンパク質に関連するＡＭＲＴを除去すれば、試料中の高強度のすべてのＡＭＲＴの他、高濃度のタンパク質から来る試料中の低強度のすべてのイオンも除去される。したがって、高濃度のタンパク質からの低強度ＡＭＲＴは、効果的にイオン化する低濃度のタンパク質からのＡＭＲＴと混同されない。

高濃度のタンパク質に関連する低い強度のＡＭＲＴおよびイオンを除去すれば、偽陽性の重要な源が低減される。例えば、低強度ＡＭＲＴの変化は、低濃度のタンパク質のバイオマーカーの証拠として誤って解釈されるかもしれない。実際、この場合、それは、誤って同定された、高濃度のタンパク質のイオン化の弱いフラグメントである。

図１２は、本発明の一実施形態によるＥＤＡを実行する方法のフローチャートである。工程１２０２では、データの全てのＡＭＲＴは、上記ＰＤＳを用いて同定される。工程１２０３では、ＡＭＲＴに相当するペプチドが同定される。同定されたＡＭＲＴは、最高の強度から最低の強度まで強度として工程１２０４において格納され、リストに格納される。

工程１２０６では、リストに残っている最も強いペプチド（リストの一番上の項目）が選択される。工程１２０８では、ＰＤＳを用いて、そのペプチドに関連する前駆体、ＹイオンおよびＢイオンの各々に、ペプチドで標識が付けられる。工程１２１０では、工程１２０８において標識を付けた前駆体、ＹイオンおよびＢイオンに関連する各ニュートラルロスＡＭＲＴに、ペプチドで標識が付けられる。工程１２１２では、標識の付いた全てのＡＭＲＴは、データから除去される。工程１２１４において、決定される所定の強度閾値より高い強度を有するＡＭＲＴが存在しない場合、方法は工程１２１６で終了する。他方では、強度閾値よりも高い強度を有する別のＡＭＲＴが存在する場合、処理は、最も高い強度を有する残りのペプチドを用いて工程１２０６で継続する。

本発明の実施形態は、保持時間およびｍｗＨＰｌｕｓの標準誤差を測定するように構成することができる。この方法に関連する保持時間の測定誤差は、単一のペプチドに共通するＡＭＲＴおよびイオンの誤差である。したがって、この誤差は溶出誤差ではない。この誤差は、保持時間を測定し得るのに用いる制限のみに起因する。

本発明の実施形態に関連するｍｗＨＰｌｕｓの測定誤差は、正確に質量測定されたタンパク質およびペプチドのデータベースに関連する誤差である。この誤差は、ｍ／ｚを質量分析計で測定し得るのに用いる制限に起因する。このｍ／ｚの誤差には、２つの源があり、それらは、統計的ノイズと較正誤差である。

これらの誤差を用いて、どのＡＭＲＴがヒットを構成するのかを決定する際、および場合によっては上記のＰＤＳ法の検出クロマトグラムを構成する際に使用される閾値を設定するので、保持時間誤差およびｍｗＨＰｌｕｓ誤差を、推定しなければならない。

保持時間誤差およびｍｗＨＰｌｕｓ誤差は、誤差分布の標準偏差として測定される。該標準偏差を考えると、どのＡＭＲＴがヒットを構成するかを決定する際に使用され、かつ検出クロマトグラムにおいて相当数のヒットを有する閾値は、標準偏差の数倍である。典型的な値は、３シグマすなわち１／１０００の偽陽性率に対しては３であるかもしれないし、あるいは６シグマすなわち１／１００００００の公式の偽陽性率を指定するかもしれない。

本発明の一実施形態によれば、保持時間誤差およびｍｗＨＰｌｕｓ誤差を決定するために、低エネルギーおよび高エネルギーにおいて共通であるイオンが同定される。例えば、低エネルギーにおいて出現するトリプシン前駆体は、低減された強度であるにもかかわらず、高エネルギーでも出現する。イオン間の保持時間の名目上の差は、必然的にゼロである。ｍｗＨＰｌｕｓの名目上の差はゼロである。

これらイオン間の観察された保持時間の差は、保持時間の誤差の尺度である。そのような多くの対からの誤差を組み合わせることによって決定されるような、この誤差の標準偏差は、保持時間の標準誤差の測定の基礎となる。

上記に基づけば、図１３は、本発明の一実施形態による、保持時間誤差およびｍｗＨＰｌｕｓ誤差を決定する方法である。工程１３０２では、低エネルギーのすべてのＡＭＲＴＳ（またはイオン）をループする。質量および保持時間に大きな閾値（例えば、それぞれ５０ｐｐｍおよび０．５分）を用いて、工程１３０４で一致する高エネルギーのすべてのＡＭＲＴ（またはイオン）を見付ける。工程１３０６では、保持時間とｍｗＨＰｌｕｓとの一致間の誤差が分析される。工程１３０８では、中央値フィルタリングなどの標準的な技術を用いて、外れた値が除去される。工程１３１０では、得られた分布に対する標準偏差が算出される。工程１３１２では、ｍｗＨＰｌｕｓの標準偏差を、統計的因子（３〜６）と掛け合わせて、どのＡＭＲＴがＰＤＳアルゴリズムにおいてヒットするかを決定する際に使用することのできる分子量閾値を確立する。工程１３１４では、保持時間の標準偏差を、統計的因子（３〜６）と掛け合わせて、ＰＤＳアルゴリズムの検出クロマトグラムを生成する工程において使用することのできるある保持時間閾値を確立する。

ペプチドがデータ中に存在するか否かを決定する際に使用される検出閾値は、以下の様式で決定することができる。Ｎ個以上のＡＭＲＴ（またはイオン）が見付かった場合、データベース中のペプチドは、そのデータ中で検出されたと考えられる。この数Ｎは、試料の複雑さに応じる。試料が複雑になるほど、Ｎは大きくなるはずである。ヒットのバックグラウンドを検証することによって、データから実験的にＮを決定することができる。標準的なヒストグラムまたは他の統計的技術を用いて、Ｎを確立することができる。実際、４〜６のＮの値は、高／低データにおいて見付けられたＡＭＲＴに対して受容可能な検出閾値であることが判明した。

本発明から得られた結果は、試料中で同定されたペプチドのリストである。リスト中のそのようなペプチドの各々は、データベースからのペプチド配列、および前駆体の測定された保持時間、測定されかつ理論上の質量、前駆体の測定された強度を含む他、データ中に見付けられかつ前駆体に関連する、フラグメントイオンの測定された保持時間、強度および質量も含む。これらの結果は、プロテオミクス分野で高い有用性を有するであろうことが期待される。例えば、そのようなプロテオミクスの４つの用途は、試料中のタンパク質の同定、試料間のペプチドの保持時間の追跡、および試料間のペプチドおよびタンパク質の定量である。

この方法によって同定されるペプチドは、元のタンパク質配列が試料中に発生したことの証拠となる。例えば、本発明によって同定されたトリプシンペプチドに相当するタンパク質のリストは、試料中に存在するタンパク質を同定する１つの方法である。観察されたペプチドの同定および濃度から、当技術分野で知られているアルゴリズムが、親タンパク質の同定および濃度を推定することもできる。

このリスト上のエントラントは、偽陽性を含んでいるかもしれない。すなわち、ペプチドの同定を誤ると、タンパク質の同定を誤る恐れがある。先行技術で知られているいくつかの手段の１つを用いれば、偽陽性を低減または除去することが可能である。あるタンパク質を同定するには、そのタンパク質に対して２個以上のペプチドを本発明の方法によって同定することを要求することができる。ユーザは、Ｎ＞１の場合にそのようなペプチドが検出されるように指定してよい。あるいは、そのユーザは、最小のパーセンテージの範囲（アミノ酸による）のタンパク質配列が、該タンパク質に対して１個以上のペプチドを検出することによって達成するように指定してよい。また、ユーザは、試料を数回反復してＬＣ／ＭＳ分析する各々において、タンパク質が同定されるように要求してよい。当該分野で知られている可能性のある他の規則を適用して、タンパク質の偽陽性同定を低減することもできる。

本発明は、同じかまたは異なったＬＣ／ＭＳシステムで分析された複数の試料から取得されたデータに適用することができる。データベースからのペプチド配列が、２つ以上のそのような試料または分析で見られた場合、各試料または分析からのそのペプチドの保持時間を比較することができる。したがって、本発明は、ペプチドの保持時間を注入毎に追跡する手段を提供する。また、異なるＬＣ分離方法論を利用した、異なる器具によって取得されたデータ中にペプチドを検出することもできる。したがって、そのペプチドの保持時間を、そのような異なる器具とＬＣ分離との間で比較することもできる。

同じかまたは異なる器具での複数の注入において見られるような同じ配列の保持時間の一致を検証することができる。このような一致の検証を用いて、偽陽性同定を検出しかつ削除することができる。

所与の混合物の反復注入において見られるような、または異なる条件下で試料を注入する際に見られるような、同じペプチドの強度を考える場合、先行技術の方法を適用して強度を較正し、ペプチドおよびタンパク質の発現の変化を決定することができる。例えば、２つの試料の注入間で、同じペプチド配列が検出された場合、相当する前駆体の強度の比を計算することもできる。これらのペプチドが、較正用の標準タンパク質からのものである場合、比は、それぞれの注入の相対的濃度較正または絶対的濃度較正を可能にする。ペプチドが、試料に内在性のタンパク質からのものである場合、比を用いて、ペプチドまたは元のタンパク質の発現レベルの変化を決定することができる。

本発明の方法を、ペプチドの混合物以外の混合物に適用することができる。（１）分子の任意の混合物、および（２）それら分子およびそれらのフラグメントの質量を含んだデータベースを考える場合、本方法を用いて、試料中でその分子を同定することができる。

適用される方法について、試料は、記載のＬＣ／ＭＳシステムによって分析される。上記方法による前駆体分子のフラグメント、ならびに前駆体およびフラグメントの理論上の質量は、知られている。これらの条件が満たされると、本発明の方法によって前駆体を同定することができる。上記の方法の考察では、前駆体は、低エネルギーで見られるイオンの質量を参照する。フラグメントは、高エネルギーまたは場合によっては低エネルギーで見られる前駆体のフラグメントの質量を参照する。次いで、本方法は、カラムで分離される元の分子を同定する。

したがって、例えば、代謝試験は、本発明から利益を受けることができる。消化の工程は、代謝の分子には必要でない。本発明に必要なのは、前駆体およびそれに関連するフラグメントに相当する正確な理論上の質量のリストだけである。そのようなリストを用いれば、本方法は、質量のそのセットまたはサブセットの存在、および元の前駆体分子が、クロマトグラフカラムから溶出したときの保持時間を検出することができる。

好適な一実施形態では、ＰＤＳアルゴリズムおよびＥＡＤアルゴリズムは、高エネルギーモードおよび低エネルギーモードを交番することで収集されたスペクトルにより取得されたデータに適用される。しかし、これらのアルゴリズムの両方を、１つのモードのみで、すなわち、固定されたエネルギーモードで収集されたスペクトルに適用することができる。したがって、例えば、これらのアルゴリズムを、低エネルギースペクトルまたは高エネルギースペクトルの一方だけに適用することができる。すなわち、原則的には、両モードが収集されてもいいが、単一モードのみに適用されるＰＤＳまたはＥＤＡアルゴリズムを用いて、ペプチドを同定することができる。前駆イオンのいくつかのフラグメント化が、単一エネルギーモードのみで行われる限り、これらのアルゴリズムを適用すれば、データ中の前駆体および／またはそのフラグメントの存在を検出するであろう。図５Ｃおよび図１１Ｃに明らかなインソースフラグメント化は、ＰＤＳまたはＥＤＡアルゴリズムを、低エネルギーデータのみに適用してもよいことを示している。

したがって、データが、２つのモードで収集される要件が好ましいが、ＰＤＳまたはＥＤＡアルゴリズムの適用にとって必ずしも必要ではない。

単一の固定されたエネルギーのみで意図的に取得されたスペクトルデータに、ＰＤＳまたはＥＤＡアルゴリズムを適用することができることにも留意されたい。実際、低エネルギーまたは高エネルギー取得に典型的に用いられる電圧の中間の電圧に相当するように、固定されたエネルギーモードで電圧（または電圧ステップ）を調整することも有利であろう。この目的は、前駆体およびフラグメントの最適な混合物を含むスペクトルを収集することであろう。このような取得は、ＰＤＳまたはＥＤＡアルゴリズムを使用して、ペプチドの同定にも役立つであろう。

本発明の好適な実施形態の上記開示は、例示および説明のためのものである。包括的であること、または本発明を開示した厳密な形態に限定することを意図したものではない。上記開示を考慮すれば、本明細書に記載の実施形態の多数の変形および改変が、当業者には明白であろう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその同等物によってのみ定められる。

また、代表的な本発明の実施形態を記載において、本明細書は、本発明の方法および／またはプロセスを、特定の工程の順序として示したかもしれない。しかし、本方法またはプロセスが、本明細書に記載した特定の工程の順序に応じない程度まで、本方法またはプロセスは、記載した特定の工程の順序に限定されるべきではない。当業者であれば理解するであろうが、他の工程の順序も可能である。したがって、本明細書に記載の特定の工程の順序は、特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。また、本発明の方法および／またはプロセスに向けられた特許請求の範囲は、書かれた順序のそれらの工程の性能に限定されるべきではなく、当業者であれば、その順序は変化されてよいとともに本発明の精神および範囲に依然としてあることを容易に理解することができる。

本発明の一実施形態による、生物学的な複合混合物中のタンパク質を同定および定量するシステムを示す略図である。 例示的なスペクトルを取得したときの時間を示すグラフである。これらのスペクトルは、本発明の一実施形態による交番する低エネルギーモードおよび高エネルギーモードを適用した結果得られたものである。 本発明の一実施形態による、ペプチド同定方法を示すフローチャートである。 本発明の一実施形態による、ペプチド同定方法を示すフローチャートである。 本発明の一実施形態による、ペプチド同定方法を示すフローチャートである。 高エネルギーで見られたすべてのＡＭＲＴを示す例示的プロットである。 低エネルギーで見られたすべてのＡＭＲＴを示す例示的プロットである。 図４Ａおよび図４Ｂに示したデータから導出した例示的な検出クロマトグラムであり、あるデータベースからの理論上の所与のペプチドに関する保持時間当たりのヒット数を示す。図４Ｃは、約７８分において相当な数のヒットを有するように見える、データベース中の前駆体ペプチド配列の一例を示す。 図４Ａの高エネルギープロットにおけるＡＭＲＴのヒットのみを示す例示的プロットである。 図４Ｂの低エネルギープロットにおけるＡＭＲＴのヒットのみを示す例示的プロットである。 図５Ａおよび図５Ｂの高エネルギーおよび低エネルギーのプロットのヒットを示すヒストグラムプロットである。図５Ｃは、約７８分において相当な数のヒットを有するように見える、データベース中の前駆体ペプチド配列の一例を示す。 クロマトグラフピークの第２の導関数ゼロ交差がどのように得られるかを示す。 クロマトグラフピークの第２の導関数ゼロ交差がどのように得られるかを示す。 本発明の一実施形態による、ピーク形状およびピーク幅を比較する方法を示すフローチャートである。 あるペプチドの例示的スペクトルを示す。 図８Ａに示した６個のイオン各々に相当する質量クロマトグラムのシリーズを示すグラフである。 多数のスペクトルピークを示す例示的な高エネルギースペクトルのプロットである。 図９Ａに示したピークの１つの保持時間と同一の保持時間を有するスペクトルピークのみを示すプロットである。 図９Ａに出現するピークの大半に相当するクロマトグラフプロファイルを示すプロットのシリーズである。 本発明の一実施形態による、イオンを用いて複合混合物中のペプチドを同定する方法を示すフローチャートである。 相当数のヒットを有するように見えるが、データベース中には前駆体が存在しない、約４９分におけるペプチドの一例を示すプロットである。 本発明の一実施形態による、ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＥＤＡ）を実行する方法を示すフローチャートである。 本発明の一実施形態による、保持時間誤差およびｍｗＨＰｌｕｓ誤差を決定する方法を示すフローチャートである。 検出ガウスのピークを加えた検出クロマトグラムを生成する方法を示すフローチャートである。 本発明の一実施形態による、配列同定およびそれらの保持時間を同定する方法を示すフローチャートである。 本発明の一実施形態による、各配列同定に関連するＡＭＲＴおよびイオンを収集する方法を示すフローチャートである。 本発明の一実施形態による、イオンリストからＡＭＲＴを決定する方法を示すフローチャートである。 本発明の一実施形態による、イオンリストからＡＭＲＴを決定する方法を示すフローチャートである。 本発明の一実施形態による、イオンリストからＡＭＲＴを決定する方法を示すフローチャートである。

Claims (25)

1. 混合物中のタンパク質を同定する方法であって、
   混合物を消化してペプチド混合物を得る工程と、
   消化された混合物をＬＣ／ＭＳシステムに適用する工程と、
   ＬＣ／ＭＳシステムの質量分析計部分において低エネルギーモードを適用する工程と、
   ＬＣ／ＭＳシステムの質量分析計部分において高エネルギーモードを適用してペプチド混合物に由来するペプチド前駆体をフラグメント化する工程と、
   低エネルギーモード中にペプチド前駆体から取得されたペプチド前駆体のデータから、質量情報および保持時間情報を取得する工程と、
   高エネルギーモード中にフラグメント化されたペプチド前駆体から取得されたフラグメントデータから、質量情報および保持時間情報を取得する工程と、
   タンパク質のデータベースから標的ペプチドを選択する工程と、
   前記データベースから選択された標的ペプチドと関連する標的前駆体に関連する質量を決定する工程と、
   標的前駆体に相当するＹイオンおよびＢイオン各々に関連する質量を決定する工程と、
   標的前駆体に関連する質量、およびＹイオンおよびＢイオンに関連する質量を、ペプチドの前駆体データおよびフラグメントデータに関連する質量情報と比較する工程と、
   比較から得られる質量の一致を検出する工程と、
   質量の一致の保持時間を決定する工程と、
   検出された質量の一致および検出された質量の一致の保持時間に基づいて、標的ペプチドがペプチド混合物中に存在するか否かを同定する工程とを含む方法。
2. クロマトグラフピーク幅の間に、高エネルギーモードおよび低エネルギーモード各々が複数回適用されるように、高エネルギーモードおよび低エネルギーモードの適用を十分な頻度で交番するプロトコルに従って、高エネルギーモードと低エネルギーモードとを切り換える工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 検出クロマトグラムを生成する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 検出クロマトグラムを生成するために、質量の一致に相当する検出ガウスのピークを個々の保持時間値域に加える工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
5. 検出閾値を決定する工程と、
   特定の保持インターバル中の質量の一致の計数が、検出閾値を超えるか否かに基づいて、ペプチドが存在するかどうかを決定する工程とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
6. 検出閾値に関連するノイズフロアを推定する工程と、
   計数およびノイズフロアの推定に基づいて、ペプチド同定の有意性を分析する工程とをさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. 低エネルギーモードが、ＬＣ／ＭＳシステムの質量分析計部分の衝突セルにおいて低電圧を印加することによって適用され、高エネルギーモードが、ＬＣ／ＭＳシステムの質量分析計部分の衝突セルにおいて高電圧を印加することによって適用される、請求項１に記載の方法。
8. データベースとして、ペプチド混合物中で見付けられる可能性があるタンパク質を有する特化されたデータベースを選択する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
9. ピーク特性を用いて、特定のクロマトグラフピークが標的前駆体に関連しているかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. ピーク特性がピーク形状である、請求項９に記載の方法。
11. ピーク形状が、ピークの頂点、上昇勾配変曲点、および下降勾配変曲点の分析を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 混合物中のタンパク質を同定するシステムであって、
    混合物を消化してペプチド混合物を得る手段と、
    混合物を適用して混合物を分離する液体クロマトグラフと、
    液体クロマトグラフによって出力された分離された混合物中の質量を測定するための質量分析計とを備え、該質量分析計が、ペプチドをフラグメント化する衝突セルと、フラグメント化されたペプチドおよびフラグメント化されていないペプチドに関連する質量情報を決定する質量分析装置とを備え、前記システムがさらに、
    標的ペプチドが選択されるタンパク質のデータベースと、
    データベースおよび質量分析計出力に結合され、分析コンピュータで実行されるソフトウェアを有する分析コンピュータとを備え、前記ソフトウェアは、分析コンピュータに、前記データベースから選択された標的ペプチドと関連する標的前駆体に関連する質量を決定させ、標的前駆体に対応するＹイオンおよびＢイオン各々に関する質量を決定させ、標的前駆体ならびにＹイオンおよびＢイオンに関連する質量を、フラグメント化されたおよびフラグメント化されていないペプチドに関連する質量情報と比較させ、比較から得られる質量の一致を検出させ、質量の一致の保持時間を決定させ、検出された質量の一致および検出された質量の一致の保持時間に基づいて、標的ペプチドが混合物中にあるか否かを同定させる、システム。
13. 高電圧を衝突セルに印加してペプチドをフラグメント化し、低電圧を印加してフラグメン化されていないペプチドについて質量分析器からデータを提供する、請求項１２に記載のシステム。
14. 衝突セルは、クロマトグラフピーク幅の間に、高エネルギーモードおよび低エネルギーモード各々が複数回適用されるように、高エネルギーモードおよび低エネルギーモードの適用を十分な頻度で交番するプロトコルに従って、高エネルギーモードと低エネルギーモードとを切り換えるように構成された、請求項１２に記載のシステム。
15. コンピュータソフトウェアが、コンピュータに、さらに検出クロマトグラムを生成させる、請求項１２に記載のシステム。
16. コンピュータソフトウェアが、コンピュータに、さらに質量の一致に相当する検出ガウスのピークを個々の保持時間値域に加えて、検出クロマトグラムを生成させる、請求項１５に記載のシステム。
17. コンピュータソフトウェアが、コンピュータにさらに、
    検出閾値を決定させ、
    特定の保持インターバル中の質量の一致の計数が、検出閾値を超えるか否かに基づいて、ペプチドが存在するかどうかを決定させる、請求項１２に記載のシステム。
18. コンピュータソフトウェアが、コンピュータにさらに、
    検出閾値に関連するノイズフロアを推定させ、
    計数およびノイズフロアの推定に基づいて、ペプチド同定の有意性を分析させる、請求項１７に記載のシステム。
19. 低エネルギーモードが、ＬＣ／ＭＳシステムの質量分析計部分の衝突セルにおいて低電圧を印加することによって適用され、高エネルギーモードが、ＬＣ／ＭＳシステムの質量分析計部分の衝突セルにおいて高電圧を印加することによって適用される、請求項１４に記載のシステム。
20. データベースが、混合物中で見付けられる可能性があるタンパク質を有する特化されたデータベースである、請求項１２に記載のシステム。
21. コンピュータソフトウェアが、コンピュータに、ピーク特性を用いて特定のクロマトグラフピークが標的前駆体に関連しているかどうかを決定させる、請求項１２に記載のシステム。
22. コンピュータソフトウェアが、コンピュータに、ピーク形状を用いて特定のクロマトグラフピークが標的前駆体に関連しているかどうかを決定させる、請求項２１に記載のシステム。
23. コンピュータソフトウェアが、コンピュータに、ピークの頂点、上昇勾配変曲点、および下降勾配変曲点を分析させる、請求項２２に記載のシステム。
24. 混合物中の前駆体を同定する方法であって、
    液体クロマトグラフ部分および質量分析計部分を有するＬＣ／ＭＳシステムに混合物を適用する工程と、
    ＬＣ／ＭＳシステムの質量分析計部分において低エネルギーモードを適用する工程と、
    ＬＣ／ＭＳシステムの質量分析計部分において高エネルギーモードを適用して混合物に由来する前駆体をフラグメント化する工程と、
    低エネルギーモード中に前駆体から取得された前駆体のデータから質量情報および保持時間情報を取得する工程と、
    高エネルギーモード中にフラグメント化された前駆体から取得されたフラグメントデータから質量情報および保持時間情報を取得する工程と、
    データベースから標的前駆体を選択する工程と、
    前記データベースから選択された標的前駆体に関連する質量を決定する工程と、
    前記データベースから選択された標的前駆体に相当するフラグメントイオンに関連する質量を決定する工程と、
    前記データベースから選択された標的前駆体に関連する質量およびフラグメントイオンに関連する質量を、前駆体データおよびフラグメントデータに関連する質量情報と比較する工程と、
    比較から得られる質量の一致を検出する工程と、
    質量の一致の保持時間を決定する工程と、
    検出された質量の一致および検出された質量の一致の保持時間に基づいて、標的前駆体が混合物中に存在するか否かを同定する工程とを含む方法。
25. 混合物中の前駆体を同定する方法であって、
    液体クロマトグラフ部分および質量分析計部分を有するＬＣ／ＭＳシステムに混合物を適用する工程と、
    ＬＣ／ＭＳシステムの質量分析計部分において前駆体およびフラグメントの混合物を収集する固定エネルギーモードを適用する工程と、
    固定エネルギーモード中に取得された前駆体およびフラグメントのデータから、質量情報および保持時間情報を取得する工程と、
    データベースから標的前駆体を選択する工程と、
    前記データベースから選択された標的前駆体に関連する質量を決定する工程と、
    前記データベースから選択された標的前駆体に相当するフラグメントイオンに関連する質量を決定する工程と、
    前記データベースから選択された標的前駆体に関連する質量およびフラグメントイオンに関連する質量を、前駆体データおよびフラグメントデータに関連する質量情報と比較する工程と、
    比較から得られる質量の一致を検出する工程と、
    質量の一致の保持時間を決定する工程と、
    検出された質量の一致および検出された質量の一致の保持時間に基づいて、標的前駆体が混合物中に存在するか否かを同定する工程とを含む方法。

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