DE102012102875B4

DE102012102875B4 - Vorläuferauswahl mit einem Artificial-Intelligence-Algorithmus erhöht Abdeckung und Reproduzierbarkeit von proteomischen Proben

Info

Publication number: DE102012102875B4
Application number: DE102012102875.3A
Authority: DE
Inventors: Joshua J. Coon; Michael S. Westphall; Graeme C. McAlister; Derek Bailey
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 2011-04-04
Filing date: 2012-04-03
Publication date: 2024-04-18
Anticipated expiration: 2032-04-04
Also published as: US9040903B2; US20120261568A1; DE102012102875A1

Abstract

Verfahren zum Identifizieren oder Quantifizieren eines Analyten in einer Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:(a) Bereitstellen einer Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen, wobei die Liste 25 bis 5.000.000 Targetanalyten enthält;(b) Berechnen einer Chromatographiesäulen-Elutionsreihenfolge des Analyten in der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen, um dadurch eine Elutionsreihenfolgeliste zu erzeugen;(c) Sortieren der Elutionsreihenfolgeliste vom ersten eluierenden Analyten bis zum letzten eluierenden Analyten, um dadurch eine sortierte Elutionsreihenfolgeliste zu erzeugen;(d) Bereitstellen einer einen Analyten enthaltenden Probe;(e) Fraktionieren der Probe mit einer Chromatographiesäule;(f) Erzeugen einer Verteilung von Vorläuferanalyt-Ionen aus der fraktionierten Probe mittels Elektrospray-Ionisation oder matrixgestützter Laser-Desorption-/Ionisation (MALDI);(g) Fragmentieren von Vorläuferanalyt-Ionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen;(h) Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Produkt-Ionen in einem Massenanalysegerät, wobei das Massenanalysegerät eine Massengenauigkeit von wenigstens 1000 ppm hat, um dadurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; und(i) Anwenden eines Artificial- Intelligence-Algorithmus zum Identifizieren von Targetanalyt-Produktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Targetanalyten entsprechen, um dadurch einen Targetanalyten zu identifizieren; Vergleichen des identifizierten Targetanalyten mit der sortierten Elutionsreihenfolgeliste bei der Datenerfassung; und(j) Identifizieren von einem oder mehreren Targetanalyten aus der sortierten Elutionsreihenfolgeliste, die innerhalb von X Analyten des identifizierten Analyten sind, wobei X gleich 20 % der Gesamtzahl der Targetanalyten in der Elutionsreihenfolgeliste ist, um dadurch eine Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten zu erzeugen; um dadurch einen Analyten in der Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie zu identifizieren oder zu quantifizieren.

Description

QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Die vorliegende Anmeldung beansprucht den Vorzug der Priorität gemäß 35 U.S.C. 119(e) der provisorischen US-Anmeldung 61/471,461 , eingereicht am 4. April 2011, und der provisorischen US-Anmeldung 61/601,856 , eingereicht am 22. Februar 2012, beide mit dem Titel „Precursor Selection Using an Artificial Intelligence Algorithm Increases Proteomic Sample Coverage and Reproducibility“, die beide hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen sind.
AUSSAGE IN BEZUG AUF BUNDESSTAATLICH UNTERSTÜTZTE FORSCHUNG ODER ENTWICKLUNG
Die vorliegende Erfindung wurde von der Regierung gemäß GM080148 unterstützt, gewährt von den National Institutes of Health. Die Regierung hat bestimmte Rechte an der Erfindung.
HINTERGRUND
Die Fähigkeit, Proteine zu identifizieren und deren chemische Strukturen zu bestimmen, hat im Bereich Biowissenschaften zentrale Bedeutung erlangt. Die Aminosäuresequenz von Proteinen bietet eine Verbindung zwischen Proteinen und deren kodierenden Genen über den genetischen Code, und im Prinzip eine Verbindung zwischen Zellphysiologie und Genetik. Die Identifizierung von Proteinen stellt ein Fenster zu komplexen regulatorischen Zellnetzwerken bereit.
Ionenfallen-Massenspektrometer gehören zu den am weitesten verbreiteten Plattformen für die Molekularanalyse und überspannen natürliche Produkte, Pharmazeutika und Biologika wie Proteine. Die meisten Experimente auf Massenspektrometerbasis beginnen mit der Isolierung einer Gruppe von Verbindungen von einem Satz Proben durch irgendeine Extraktionstechnik, wie z.B. Proteine aus Geweben, Zelllysaten oder Fluiden, gefolgt von einer proteolytischen Verdauung dieser Proteine zu Peptiden (d.h. Bottom-Up-Proteomik). Massenspektrometer werden dann häufig, wenn auch nicht unbedingt, mit einer Art von Trennung gekoppelt, wie z.B. elektrophoretische oder chromatographische Trennung. Im Verlauf von nur ein paar Stunden können Massenspektralinstrumente Zehntausende molekulare Spezien über Tandem-Massenspektrometrie autonom abfragen.
Quantitative Analyse ist in der Chemie die Ermittlung der absoluten oder relativen Abundanz von einer, mehreren oder allen bestimmten Substanz(en) in einer Probe. Für biologische Proben kann eine quantitative Analyse per Massenspektrometrie die relative Abundanz von Peptiden und Proteinen ermitteln. Im Rahmen der anerkannten Methodik zum Durchführen von massenspektrometrischer Quantifizierung wird ein MS/MSfragmentationsfähiges Massenspektrometer verwendet (d.h. Dreifachquadrupol oder Ionenfalle). Der Quantifizierungsvorgang kann isobares Markieren von Peptidvorläufern beinhalten, das in Kombination mit Nacherfassungssoftware die relative Abundanz von Peptiden liefert. Wenn ein Peptidvorläufer für die Tandem-Massenspektrometrie gewählt wird, gibt es jedoch häufig interferierende Spezien mit ähnlichen Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, die gleichzeitig isoliert und aktiviert werden. Diese Spezien sind oft andere isobar markierte Peptide mit unterschiedlicher relativer Quantifizierung, die daher die quantitative Messung des Peptids von Interesse stören.
Isobares Markieren ist ein wichtiges quantitatives Verfahren, da es eine Multiplexierung zulässt und direkt auf klinische Proben anwendbar ist. Eine signifikante Fehlerquelle tritt jedoch auf, wenn ein anderes eluierendes Peptid-Ion einen m/z-Wert hat, der sehr nahe an dem des gewählten Vorläufers liegt (-50 %, in unserem Fall). Das Ergebnis ist eine Isolierung beider Spezien, die folglich co-dissoziiert werden, um ein zusammengesetztes MS/MS-Spektrum zu erzeugen. Die resultierenden Reporter-lonen-Verhältnisse reflektieren die relativen Abundanzen beider Peptide nicht genau; sie beschränken sowohl die Präzision als auch den dynamischen Bereich der Quantifizierung, da das mittlere Peptidverhältnis nahe an 1:1 liegt.
Die zunehmende Popularität von iTRAQ für quantitative Proteomik hat zu verstärkten Anstrengungen im Hinblick auf die Beurteilung ihrer Relevanz, Genauigkeit und Präzision für eine biologische Interpretation geführt. Einige Forscher haben kürzlich damit begonnen, die Genauigkeit und Präzision der iTRAQ-Quantifizierung sowie Nachteile zu beurteilen, die die Anwendbarkeit und den erreichbaren dynamischen Bereich von iTRAQ behindern. Einige Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass „Crosstalk“ zwischen interferierenden Faktoren zu Unterbewertungen führen kann [Ow et al., „iTRAQ Underestimation in Simple and Complex Mixtures: ,The Good, the Bad and the Ugly”’, Journal of Proteome Research, Web-Veröffentlichung 16. September 2009]. Es ist klar, dass es ein verlockendes Potential für iTRAQ und andere Proteinmarkierungsverfahren gibt, um eine genaue Quantifizierung zu erzielen, die mehrere Größenordnungen überspannt. Dieses Potential kann jedoch durch mehrere Faktoren begrenzt sein. Zunächst erfordert beispielsweise die Existenz isotopischer Verunreinigungen häufig eine Korrektur der Massenspektraldaten, um eine genaue Quantifizierung zu erzielen, die derzeit die Verfügbarkeit genauer isotopischer Faktoren erfordert. Zweitens ist die Interferenz eines gemischten MS/MS-Beitrags während der Vorläuferauswahl ein Problem, das sich derzeit nur schwer herabmindern lässt.
Proteinidentifizierungstechniken sind rasch herangereift, so dass das Erstellen von Katalogen mit den Tausenden von Proteinen, die in einer Zelle enthalten sind, mit Massenspektrometrie (MS) heute relativ einfach ist [de Godoy, L.M.F. et al. Nature 455, 1251-1255 (2008); Swaney, D.L., Wenger, C.D. & Coon, J.J. J. Proteome Res. 9, 1323-1329 (2010) ]. Dies gilt jedoch nicht für die Kenntnis, wie sich die Abundanz dieser Moleküle unter verschiedenen Umständen ändert [Ong, S.E. & Mann, M. Nat. Chem. Biol. 1, 252-262 (2005)]. Eine stabile Isotop markierung durch Aminosäuren in einer Zellkultur (SILAC) liefert ein Mittel zur Durchführung binärer oder ternärer Vergleiche [Jiang, H. & English, A.M. J. Proteome Res. 1, 345-350 (2002); Ong. S.E. et al. Mol. Cell. Proteomics 1, 376-386 (2002)]. Durch Verschachteln dieser Zwei- oder Dreiwege-Experimente können Vergleiche höherer Ordnung erzielt werden [Olsen, J.V. et al. Sci. Signal. 3, ra3 (2010)]. Solche groß angelegten multiplexierten Experimente sind von unschätzbarem Wert, da sie (1) eine Messung von Zeitverlaufsexperimenten ermöglichen, (2) eine Sammlung von biologischen Replikaten zulassen und (3) einen direkten Vergleich von transkriptomischen und proteomischen Daten ermöglichen.
Der Aufbau dieser Art von facettenreicher Proteomikstudie ist jedoch ein langwieriger Vorgang und wurde bisher nur bei ein paar Experimenten von einer noch kleineren Gruppe von Forschern bewerkstelligt. Das erste Hindernis ist die Notwendigkeit, mehrere Gruppen von Zellen mit verschiedenen Markierungen zu kultivieren. Dieser Schritt stellt jedoch in der Tat eine geringere Einschränkung dar als das zweite Haupthindernis: jeder binäre oder ternäre Satz muss separat analysiert werden. In Kombination mit der Notwendigkeit für eine umfangreiche Vor-MS-Fraktionierung und technische Replikate verlangt ein groß angelegtes Experiment über SILAC drei bis sechs Monate an konstantem Instrumenteneinsatz.
Während sich die Proteomik von auf Entdeckung beruhenden Experimenten in Richtung auf hypothesegesteuerte Analysen bewegt, ist das Erfolgsmaß nicht mehr die absolute Zahl der identifizierten Proteine, sondern die Identifizierung spezifischer Proteine von Interesse. Dieser Trend wird durch das rasch ansteigende Interesse an SRM-(selektierte Reaktionsüberwachung)-gestützten Protein-Assays veranschaulicht - ein leistungsstarkes Tandem-Massenspektrometrieverfahren, das zum Überwachen von Targetpeptiden innerhalb eines komplexen Proteinverdaus angewendet werden kann. Diese Experimente beinhalten typischerweise eine sorgfältige Optimierung von Fragmentierungsparametern, eine enge Regulierung von Flüssigchromatographie-(LC)-Bedingungen und eine komplexe Verfahrensplanung. Bisher war das Spektrometer in allen Proteinassays auf Massenspektrometerbasis ein passives Mittel. Der Benutzer weist das Instrument an, wie es die Vorläufer-Ionenpopulation prüfen soll, welche Vorläufer es abfragen soll und wie diese Vorläufer abgefragt werden sollen. Diese Instrumente verlangen im Wesentlichen eine sorgfältige und genaue Handhabung durch den Benutzer, wodurch aufwändige Verfahren zum Erzeugen empfindlicher, spezifischer und reproduzierbarer Ergebnisse erforderlich sind.
ZUSAMMENFASSUNG
Es werden hierbei Massenspektrometriesysteme und -verfahren beschrieben, die eine dynamische neue Datenerfassungs-/Instrumentensteuermethodik nutzen. Diese Systeme und Verfahren arbeiten mit neuartigen Artificial- Intelligence-Algorithmen, um die Quantifizierungs- und/oder Identifizierungsgenauigkeit bei der Datenerfassung stark zu verbessern. In einer Ausgestaltung können die Algorithmen die Instrumentenverfahren und -systeme bei der Datenerfassung adaptieren, um Datenerfassungsmittel anzuweisen, die Quantifizierungs- oder Identifizierungsgenauigkeit von Targetanalyten wie Proteinen, Peptiden und Peptidfragmenten zu erhöhen.
In einer Ausgestaltung wird ein Verfahren zum Identifizieren oder Quantifizieren eines Analyten in einer Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie bereitgestellt, wobei das Verfahren Folgendes beinhaltet:

(a) Bereitstellen einer Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen, wobei die Liste 25 bis 5.000.000 Targetanalyten, optional zwischen 25 und 1.000.000 Targetanalyten, optional zwischen 50 und 100.000 Targetanalyten, optional zwischen 50 und 10.000 Targetanalyten, optional mehr als 50, optional mehr als 100, optional mehr als 500, optional mehr als 1000, optional mehr als 1500, optional 100 bis 5000, optional 200 bis 2500, optional 500 bis 2500 Targetanalyten enthält;
(b) Bereitstellen einer einen Analyten enthaltenden Probe;
(c) Erzeugen einer Verteilung von Vorläuferanalyt-Ionen aus der Probe;
(d) Fragmentieren von Vorläuferanalyt-Ionenmit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen;
(e) Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Produkt-Ionen in einem Massenanalysegerät, wobei das Massenanalysegerät eine Massengenauigkeit von wenigstens 100 ppm, optional 1000 ppm, optional 200 ppm, optional 80 ppm, optional 50 ppm, optional 10 ppm, optional 5 ppm, optional von 5 bis 1000 ppm, von 5 bis 250 ppm, optional von 5 bis 100 ppm, optional von 5 bis 50 ppm, optional von 5 bis 25 ppm hat, um dadurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; und
(f) Optimieren von Analytidentifizierung oder -quantifizierung bei der Datenerfassung durch Vergleichen der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen; um dadurch einen Analyten in der Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie zu identifizieren oder zu quantifizieren.

Die hierbei bereitgestellten Systeme und Verfahren sind besonders im Rahmen der Protein-, Peptid- und Peptidfragmentanalyse nützlich. In einer Ausgestaltung wird z.B. ein Verfahren bereitgestellt, bei dem:

die Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen Targetpeptide und Targetpeptid-Produktinformationen enthält, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen;
der Analyt Peptide umfasst, die Proteinen entsprechen;
der Schritt des (d) Fragmentierens von Vorläuferanalyt-Ionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen, das Fragmentieren von Vorläuferpeptid-Ionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen beinhaltet, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen; und
der Schritt des (f) Optimierens von Analytidentifizierung oder -quantifizierung bei der Datenerfassung durch Vergleichen der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen das Optimieren von Peptid- oder Proteinidentifizierung oder -quantifizierung bei der Datenerfassung durch Vergleichen der Produkt-lonen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen beinhaltet, die Targetpeptide und Targetpeptid-Produktinformationen enthält, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen.

In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Identifizieren von Targetpeptid-Produktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Targetpeptid entsprechen, um dadurch ein Targetpeptid zu identifizieren; und Entfernen des identifizierten Targetpeptids aus der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen, das einem oder mehreren Proteinen entspricht, bei der Datenerfassung.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Entfernen der identifizierten Targetpeptid-Produktinformationen aus der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, bei der Datenerfassung.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Identifizieren von einem oder mehreren Targetpeptiden, die einem einzelnen Protein entsprechen, um dadurch ein Targetprotein zu identifizieren; und
Entfernen aller identifizierten Targetpeptide und Peptidproduktinformationen aus der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, die dem identifizierten Protein entsprechen, bei der Datenerfassung.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Hinzufügen von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen zur Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, bei der Datenerfassung.
In einer Ausgestaltung beinhalten die Targetanalyt-Produktinformationen die Massen der Targetanalyten oder Targetanalytprodukte. In einer anderen Ausgestaltung beinhalten die Targetpeptid-Produktinformationen die Massen der Targetpeptide oder Targetpeptidprodukte.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Berechnen einer Chromatographiesäulen-Elutionsreihenfolge der Peptide in der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, um dadurch eine Elutionsreihenfolgeliste zu erzeugen;

Sortieren der Elutionsreihenfolgeliste vom ersten eluierenden Peptid bis zum letzten eluierenden Peptid, um dadurch eine sortierte Elutionsreihenfolgeliste zu erzeugen;
Fraktionieren der Probe mit einer Chromatographiesäule vor dem Erzeugen einer Verteilung von Vorläuferpeptidionen aus der Probe;
Identifizieren von Targetpeptid-Produktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Targetpeptid entsprechen, um dadurch ein Targetpeptid zu identifizieren;
Vergleichen des identifizierten Targetpeptids mit der sortierten Elutionsreihenfolgeliste bei der Datenerfassung; und
Identifizieren von einem oder mehreren Targetpeptiden aus der sortierten Elutionsreihenfolgeliste, die innerhalb von X Peptiden des identifizierten Peptids sind, wobei X gleich 20 % der Gesamtzahl der Targetpeptide in der Elutionsreihenfolgeliste ist, um dadurch eine Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide zu erzeugen.

In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Identifizieren von einem oder mehreren Peptiden in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide bei der Datenerfassung;

Auswählen eines Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von Vorläufer-Ionen, die den ein oder mehreren Peptiden in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide entsprechen; und
Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse des Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, die den ein oder mehreren Peptiden in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide entsprechen, um dadurch Vorläufer-Massenspektrometriedaten zu erzeugen.

In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Identifizieren von einem oder mehreren Peptiden in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide bei der Datenerfassung;
wobei in Schritt (d) die Vorläuferpeptidionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen den ein oder mehreren Peptiden in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide entsprechen.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse eines Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, die der Verteilung von Vorläuferpeptidionen entsprechen, um dadurch Vorläufer-Massenspektrometriedaten zu erzeugen;
Ermitteln eines Signal-Rausch-Verhältnisses von zwei oder mehr Peaks in den Vorläufer-Massenspektrometriedaten, die einem oder mehreren Peptiden in der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen entsprechen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, bei der Datenerfassung; wobei wenigstens einer der zwei oder mehr Peaks in den Vorläufer-Massenspektrometriedaten, die einem oder mehreren Peptiden entsprechen, einem markierten Protein entspricht und wenigstens einer einem unmarkierten Protein entspricht; und
Wiederholen der Schritte (c) - (f), wenn das Signal-Rausch-Verhältnis des am wenigsten intensiven der zwei oder mehr Peaks in den Vorläufer-Massenspektrometriedaten, die einem oder mehreren Peptiden in der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen entsprechen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, kleiner als 2:1, optional 3:1, optional 5:1, optional 10:1, optional 20:1, optional zwischen 2:1 und 20:1, optional zwischen 5:1 und 20:1 ist.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Identifizieren von Targetpeptid-Produktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Targetprotein entsprechen, um dadurch ein Targetprotein zu identifizieren;
Ermitteln eines Signal-Rausch-Verhältnisses von einem oder mehreren Peaks in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Sequenz-Tag des identifizierten Targetproteins entsprechen, bei der Datenerfassung; und
Wiederholen der Schritte (c) - (f), wenn das Signal-Rausch-Verhältnis von einem oder mehreren Peaks in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Sequenz-Tag eines identifizierten Targetproteins entsprechen, kleiner als 2:1, optional 3:1, optional 5:1, optional 10:1, optional 20:1, optional zwischen 2:1 und 20:1, optional zwischen 5:1 und 20:1 ist.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Identifizieren von Targetpeptid-Produktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Targetprotein entsprechen, um dadurch ein Targetprotein zu identifizieren;
Ermitteln eines Signal-Rausch-Verhältnisses von einem oder mehreren Peaks in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Reporter-Tag des identifizierten Targetproteins entsprechen, bei der Datenerfassung; und
Wiederholen der Schritte (c) - (f), wenn das Signal-Rausch-Verhältnis von einem oder mehreren Peaks in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Reporter-Tag eines identifizierten Targetproteins entsprechen, kleiner als 2:1, optional 3:1, optional 5:1, optional 10:1, optional 20:1, optional zwischen 2:1 und 20:1, optional zwischen 5:1 und 20:1 ist.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Auswählen eines Targetpeptids mit einer oder mehreren post-translationalen Modifikationsstellen;
Vergleichen der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, um zu ermitteln, ob die Stellen des Targetpeptids mit einer oder mehreren post-translationalen Modifikationen eindeutig identifiziert werden können; und
Einstellen eines Fragmentierungsparameters bei der Datenerfassung, bis Stellen des Targetpeptids mit den ein oder mehreren post-translationalen Modifikationen eindeutig identifiziert werden können; wobei der Fragmentierungsparameter Fragmentierungsdruck, Gas, Elektronenenergie, Wellenlänge von elektromagnetischer Strahlung, Leistung von elektromagnetischer Strahlung, Beleuchtungszeit von elektromagnetischer Strahlung, Fluss von elektromagnetischer Strahlung, Gesamtdosis an elektromagnetischer Strahlung, Stoßenergie oder Reaktionszeit entspricht.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Auswählen eines Targetpeptids mit einer oder mehreren post-translationalen Modifikationsstellen;
Vergleichen der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, um zu ermitteln, ob die Stellen des Targetpeptids mit einer oder mehreren post-translationalen Modifikationen eindeutig identifiziert werden können; und
Angleichen eines Fragmentierungsverfahrens bei der Datenerfassung, bis Stellen des Targetpeptids mit den ein oder mehreren post-translationalen Modifikationen eindeutig identifiziert werden können; wobei das Fragmentierungsverfahren eine stoßaktivierte Strahlendissoziation, eine Ionenreaktionsdissoziation, eine Elektronenreaktionsdissoziation, eine Elektronentransferdissoziation, eine Elektroneneinfangdissoziation, eine neutrale Reaktionsdissoziation, eine laserinduzierte Dissoziation, eine oberflächeninduzierte Dissoziation oder eine stoßaktivierte Resonanzanregungsdissoziation ist.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Auswählen eines Targetpeptids mit einer oder mehreren Stellen post-translationaler Modifikation;
Identifizieren von Peaks in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die dem Targetpeptid mit einer oder mehreren Stellen post-translationaler Modifikation entsprechen;
Vergleichen der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, bei der Datenerfassung, um zu ermitteln, ob die Stellen des Targetpeptids mit einer oder mehreren post-translationalen Modifikationen eindeutig identifiziert werden können; und
Wiederholen der Schritte (c) - (f), bis Stellen des Targetpeptids mit der einen oder mehreren post-translationalen Modifikationen eindeutig identifiziert werden können.
Die hierbei beschriebenen Systeme und Verfahren sind besonders im Rahmen einer Analyse auf der Basis isobarer oder isotopischer Markierung von Nutzen. In einer Ausgestaltung wird z.B. ein Verfahren zum Identifizieren oder Quantifizieren eines Analyten in einer Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie bereitgestellt, wobei die Proteine isobar markierte Proteine sind. In einer Ausgestaltung wird ein Verfahren zum Identifizieren oder Quantifizieren eines Analyten in einer Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie bereitgestellt, wobei die Proteine oder Peptide isotopisch markierte Proteine oder Peptide oder isotopisch kodierte Proteine oder Peptide sind. In einem Aspekt sind die Proteine oder Peptide phosphorylierte Proteine öder Peptide. In einem anderen Aspekt sind die Proteine oder Peptide co-translational modifizierte Proteine oder Peptide. In einem weiteren Aspekt sind die Proteine oder Peptide post-translational modifizierte Proteine oder Peptide. In einem Aspekt zeigen die Proteine einen Krankheitszustand an.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Identifizieren von Targetanalyt-Produktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Targetanalyten entsprechen, um dadurch einen Targetanalyten zu identifizieren; und
Entfernen des identifizierten Targetanalyten aus der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen bei der Datenerfassung.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Entfernen der identifizierten Targetanalyt-Produktinformationen aus der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen bei der Datenerfassung.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Identifizieren von einem oder mehreren Targetanalyten, die einem einzelnen Analyten entsprechen, um dadurch einen Targetanalyten zu identifizieren; und
Entfernen aller identifizierten Targetanalyten und Analytproduktinformationen aus der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen, die dem identifizierten Analyten entsprechen, bei der Datenerfassung.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Hinzufügen von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen zur Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen bei der Datenerfassung.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Berechnen einer Chromatographiesäulen-Elutionsreihenfolge des Analyten in der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen, um dadurch eine Elutionsreihenfolgeliste zu erzeugen;
Sortieren der Elutionsreihenfolgeliste vom ersten eluierenden Analyten bis zum letzten eluierenden Analyten, um dadurch eine sortierte Elutionsreihenfolgeliste zu erzeugen;
Fraktionieren der Probe mit einer Chromatographiesäule vor dem Erzeugen einer Verteilung von Vorläuferanalytionen aus der Probe;
Identifizieren von Targetanalyt-Produktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Targetanalyten entsprechen, um dadurch einen Targetanalyten zu identifizieren;
Vergleichen des identifizierten Targetanalyten mit der sortierten Elutionsreihenfolgeliste bei der Datenerfassung; und
Identifizieren von einem oder mehreren Targetanalyten aus der sortierten Elutionsreihenfolgeliste, die innerhalb von X Analyten des identifizierten Analyten sind, wobei X gleich 20 % der Gesamtzahl von Targetanalyten in der Elutionsreihenfolgeliste ist, um dadurch eine Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten zu erzeugen.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Identifizieren von einem oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten bei der Datenerfassung;
Auswählen eines Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von Vorläufer-Ionen, die den ein oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten entsprechen; und
Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse des Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, die den ein oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten entsprechen, um dadurch Vorläufer-Massenspektrometriedaten zu erzeugen.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Identifizieren von einem oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten bei der Datenerfassung; wobei in Schritt (d) die Vorläuferanalytionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen den ein oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten entsprechen.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Identifizieren von einem oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten bei der Datenerfassung; Auswählen eines Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von Vorläufer-Ionen, die den ein oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten entsprechen; Fragmentieren von Vorläufer-Ionen mit Masse-zu-Ladung-Verhältnissen in dem gewählten Bereich von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; und Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der fragmentierten Vorläufer-Ionen, um dadurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes: Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse eines Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, die der Verteilung von Vorläuferanalytionen entsprechen, um dadurch Vorläufer-Massenspektrometriedaten zu erzeugen;
Ermitteln eines Signal-Rausch-Verhältnisses von zwei oder mehr Peaks in den Vorläufer-Massenspektrometriedaten, die den ein oder mehreren Analyten in der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen entsprechen, bei der Datenerfassung; wobei wenigstens einer der zwei oder mehr Peaks in den Vorläufer-Massenspektrometriedaten, die den ein oder mehreren Analyten entsprechen, einem markierten Analyten entspricht, und wenigstens einer einem unmarkierten Analyten entspricht; und
Wiederholen der Schritte (c) - (f), wenn das Signal-Rausch-Verhältnis des am wenigsten intensiven der zwei oder mehr Peaks in den Vorläufer-Massenspektrometriedaten, die einem oder mehreren Analyten in der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen entsprechen, kleiner als 2:1, optional 3:1, optional 5:1, optional 10:1, optional 20:1, optional zwischen 2:1 und 20:1, optional zwischen 5:1 und 20:1 ist.
In einer weiteren Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner die Verwendung von Massenspektrometriedaten von den Vorläuferanalytionen zum Optimieren der Analytdetektion. Es können beispielsweise Daten von einem MS¹-Scan zusätzlich zu den bei einem MS²-Scan gesammelten Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten verwendet werden. Von Vorläuferanalytionen gemessene Massenspektrometriedaten können mit der Liste von Targetanalyten verglichen werden, die auch Targetanalyt-Vorläuferioneninformationen und Landmark-Vorläuferionensignalinformationen enthalten kann. Der Begriff „Targetanalyt-Vorläuferioneninformationen“ bezieht sich auf eine oder mehrere gemessene Eigenschaften der Vorläuferanalytionen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die z.B., aber ohne Begrenzung, Masse, Signalintensität, Masse-zu-Ladung-Verhältnis, Ladungszustand, Signal-Rausch-Verhältnis und Kombinationen davon beinhaltet. Der Begriff „Landmark-Vorläuferionensignalinformationen“ bezieht sich auf gewünschte Eigenschaften von lonenmassenspektrometriedaten, die möglicherweise nicht nur einem spezifischen Targetanalyten entsprechen.
So beinhaltet das Verfahren in einer Ausgestaltung ferner Folgendes:

Messen von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferanalytionen, um dadurch Vorläuferanalytionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; und
Optimieren der Analytidentifizierung oder -quantifizierung bei der Datenerfassung durch Vergleichen der Vorläuferanalytionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen, wobei die genannte Liste ferner Targetanalyt-Vorläuferioneninformationen und Landmark-Vorläuferionensignalinformationen enthält.

Alternativ könnten die Massenspektrometriedaten von den Vorläuferanalytionen anstatt der Produktmassenspektrometriedaten verwendet werden, um die Analytdetektion zu optimieren. So beinhaltet das Verfahren in einer Ausgestaltung Folgendes:

(a) Bereitstellen einer Liste von Targetanalyten, Targetanalyt-Vorläuferioneninformationen und Landmark-Vorläuferionensignalinformationen, wobei die Liste 25 bis 5.000.000 Targetanalyten enthält;
(b) Bereitstellen einer einen Analyten enthaltenden Probe;
(c) Erzeugen einer Verteilung von Vorläuferanalytionen aus der Probe;
(d) Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferanalytionen in einem Massenanalysegerät, wobei das Massenanalysegerät eine Massengenauigkeit von wenigstens 1000 ppm hat, um dadurch Vorläuferanalytionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; und (e) Optimieren der Analytidentifizierung oder -quantifizierung bei der Datenerfassung durch Vergleichen der Vorläuferanalytionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetanalyten, Targetanalyt-Vorläuferioneninformationen und Landmark-Vorläuferionensignalinformationen; um dadurch einen Analyten in der Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie zu identifizieren oder zu quantifizieren.

In einer Ausgestaltung wird ein Verfahren zum Identifizieren oder Quantifizieren eines Analyten in einer Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie bereitgestellt, wobei das Verfahren Folgendes beinhaltet:

(a) Bereitstellen einer Liste von Targetpeptiden, wobei die Targetliste 25 bis 5.000.000 Targetpeptide enthält;
(b) Berechnen einer Chromatographiesäulen-Elutionsreihenfolge und Elutionszeit der Peptide in der Liste von Targetpeptiden, um dadurch eine Elutionsreihenfolgeliste und vorhergesagte Elutionszeiten für jedes Targetpeptid zu erzeugen;
(c) Sortieren der Elutionsreihenfolgeliste vom ersten eluierenden Peptid bis zum letzten eluierenden Peptid, um dadurch eine sortierte Elutionsreihenfolgeliste zu erzeugen;
(d) Bereitstellen einer einen Analyten enthaltenden Probe, wobei der genannte Analyt Peptide umfasst, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen;
(e) Erzeugen einer Verteilung von Vorläuferanalytionen aus der Probe zu Elutionszeiten, die den vorhergesagten Elutionszeiten für die Targetpeptide entsprechen, wobei die genannten Analyt-Ionen Peptid-Ionen umfassen;
(f) Fragmentieren von Vorläuferanalytionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferanalytionen, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen;
(g) Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Produkt-Ionen, die in einem Massenanalysegerät gesammelt wurden, wobei das Massenanalysegerät eine Massengenauigkeit von wenigstens 100 ppm hat, optional eine Massengenauigkeit von wenigstens 1000 ppm, um dadurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; und
(h) Identifizieren von Targetpeptiden oder Peptidproduktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Targetpeptid entsprechen, durch Vergleichen der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen, um dadurch einen Analyten in der Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie zu identifizieren oder zu quantifizieren. Optional beinhaltet die Liste 25 bis 1.000.000 Targetpeptide, 50 bis 100.000 Targetpeptide oder optional zwischen 50 und 10.000 Targetpeptide, optional mehr als 50, optional mehr als 100, optional mehr als 500, optional mehr als 1000, optional mehr als 1500, optional von 100 bis 5000, optional von 200 bis 2500 oder optional von 500 bis 2500.

In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner das Vergleichen der Elutionszeit der identifizierten Targetpeptide oder Peptidproduktinformationen mit der sortierten Elutionsreihenfolgeliste und den vorhergesagten Elutionszeiten bei der Datenerfassung. In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner das Ausführen von einem oder mehreren datenabhängigen Erfassungs-Scans zum Ermitteln der aktuellen Elutionszeit und zum Vergleichen der ermittelten Elutionszeit mit der sortierten Elutionsreihenfolgeliste und den vorhergesagten Elutionszeiten bei der Datenerfassung. In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner das Ausführen von einem oder mehreren datenabhängigen Erfassungs-Scans, die Folgendes umfassen:

Erzeugen einer zweiten Verteilung von Vorläuferanalytionen aus der Probe, wobei die Elutionszeiten der zweiten Verteilung von Vorläuferanalytionen nicht mit den vorhergesagten Elutionszeiten für die Targetpeptide korrelieren;
Fragmentieren von Vorläuferanalytionen von wenigstens einem Teil der zweiten Verteilung von Vorläuferanalytionen, um dadurch einen zweiten Satz von Produkt-Ionen zu erzeugen; und
Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse des zweiten Satzes von Produkt-Ionen, um dadurch datenabhängige Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen.

In einer Ausgestaltung sieht das Verfahren ferner vor, dass in Schritt (f) die Vorläuferpeptidionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen den ein oder mehreren Peptiden in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide entsprechen.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner Folgendes:

(i) Identifizieren von einem oder mehreren Peptiden in der sortierten Elutionsliste als Peptide, deren Elution als nächstes vorhergesagt wurde, bei der Datenerfassung;
(j) Auswählen eines Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von Vorläufer-Ionen, die den ein oder mehreren Peptiden entsprechen, deren Elution als nächstes vorhergesagt wurde; und
(k) Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse des Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, die den ein oder mehreren Peptiden entsprechen, deren Elution als nächstes vorhergesagt wurde, um dadurch Vorläufermassenspektrometriedaten zu erzeugen.

In einer Ausgestaltung beinhalten die Targetpeptid-Produktinformationen die Massen der Targetpeptide oder Targetpeptidprodukte.
In einer Ausgestaltung wird ein Verfahren zum Identifizieren oder Quantifizieren eines Analyten in einer Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie bereitgestellt, wobei das Verfahren Folgendes beinhaltet:

(a) Erzeugen einer Sequenzierungswarteschlange, die einen auszuführenden MS1-Scan und ein oder mehrere auszuführende Massenspektrometrie-Scans enthält, wobei die genannten auszuführenden Massenspektrometrie-Scans in der Sequenzierungswarteschlange mit Analyt-Ionenpeaks mit einer vorhergesagten Elutionszeit korrelieren und der genannte MS1-Scan nicht mit einer Elutionszeit assoziiert ist;
(b) Erzeugen einer Echtzeit-Heap-Warteschlange, die ein oder mehrere auszuführende Target-Scans enthält, wobei die genannten auszuführenden Target-Scans mit Peptiden oder Targetpeptiden mit einer vorhergesagten Elutionszeit korrelieren, wobei immer dann, wenn ein neuer Massenspektrometrie-Scan oder Target-Scan auszuführen ist, Target-Scans in der Echtzeit-Heap-Warteschlange vor Massenspektrometrie-Scans aus der Sequenzierungswarteschlange ausgeführt werden;
(c) Bereitstellen einer einen Analyten enthaltenden Probe;
(d) Ausführen des MS1-Scans, wenn keine anderen Scans in der Sequenzierungswarteschlange oder der Echtzeit-Heap-Warteschlange vorhanden sind, wobei das Ausführen des MS1-Scans das Erzeugen einer Verteilung von Vorläuferanalytionen aus der Probe und das Messen von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von wenigstens einem Teil der Produkt-Ionen in einem Massenanalysegerät beinhaltet, um dadurch ein oder mehrere Analytlonenpeaks zu erzeugen;
(e) Auswählen von einem oder mehreren Analyt-Ionenpeaks, Erzeugen eines neuen Massenspektrometrie-Scans, der jedem der gewählten Analyt-Ionenpeaks entspricht, und Hinzufügen des neuen Massenspektrometrie-Scans zur Sequenzierungswarteschlange;
(f) Ausführen von einem oder mehreren Massenspektrometrie-Scans aus der Sequenzierungswarteschlange, wobei Massenspektrometrie-Scans, die vor kürzerer Zeit der Sequenzierungswarteschlange hinzugefügt wurden, nach Massenspektrometrie-Scans ausgeführt werden, die der Sequenzierungswarteschlange früher hinzugefügt wurden, wobei das Ausführen von einem oder mehreren Massenspektrometrie-Scans Folgendes beinhaltet:
1. (i) Fragmentieren von Vorläuferanalytionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen;
2. (ii) Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Produkt-Ionen in einem Massenanalysegerät, um dadurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen;
(g) Identifizieren eines Targetanalyten aus den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, Berechnen einer Elutionszeit für den Targetanalyten, Erzeugen eines neuen Target-Scans, der dem Targetanalyten und der berechneten Elutionszeit entspricht, und Hinzufügen des neuen Target-Scans zur Echtzeit-Heap-Warteschlange;
(h) Ausführen von einem oder mehreren Target-Scans aus der Echtzeit-Heap-Warteschlange, wobei Target-Scans zu Elutionszeiten ausgeführt werden, die den berechneten Elutionszeiten für die Targetanalyten entsprechen, wobei das Ausführen von einem oder mehreren Target-Scans Folgendes beinhaltet:
- (i) Fragmentieren von Vorläuferanalytionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen;
- (ii) Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Produkt-Ionen in dem Massenanalysegerät, um dadurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; und
(i) Vergleichen von Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten mit einer Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen; um dadurch einen Analyten in der Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie zu identifizieren oder zu quantifizieren. In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner das Vergleichen der Elutionszeit von ausgeführten Target-Scans mit berechneten Elutionszeiten bei der Datenerfassung, um dadurch die aktuelle Elutionszeit des Experiments zu verfolgen.

In einer Ausgestaltung beinhalten die Targetanalyt-Produktinformationen die Massen der Targetanalyten oder Targetanalytprodukte.
In den hierbei beschriebenen Systemen und Verfahren werden die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von mehreren Produkt-Ionen optional gleichzeitig gemessen. Zusätzlich werden die mehreren Produkt-Ionen optional von verschiedenen Vorläuferanalytionen erzeugt.
Die hierbei beschriebenen Systeme und Verfahren sind besonders im Rahmen einer Analyse auf der Basis isobarer oder isotopischer Markierung von Nutzen. In einer Ausgestaltung wird z.B. ein Verfahren zum Identifizieren oder Quantifizieren eines Analyten in einer Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie bereitgestellt, wobei der Analyt ein isobar markierter Analyt ist. In einem Aspekt ist der Analyt ein isotopisch markierter Analyt oder ein isotopisch kodierter Analyt.
In einer verwandten Ausgestaltung umfasst der Analyt ein oder mehrere kleine Moleküle, pharmazeutische Verbindungen, Oligonucleotide oder Zucker. In einer Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren ferner das Verdauen der ein oder mehreren Proteine. In einer Ausgestaltung wird die Verteilung von Vorläuferanalytionen mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle oder einer MALDI-Quelle erzeugt. In einer anderen Ausgestaltung wird das Verfahren in einem Tandem-Massenspektrometerinstrument, einem mehrstufigen Massenspektrometer-Instrument oder einem Hybrid-Massenspektrometerinstrument implementiert.
In einer Ausgestaltung wird ein Massenspektrometersystem zum Analysieren eines Analyten bereitgestellt, wobei das System Folgendes umfasst:

eine lonenquelle zum Erzeugen von Ionen von dem Analyten;
erste lonentrennoptik in Verbindung mit der lonenquelle zum Trennen von Ionen gemäß ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen;
lonenfragmentierungsoptik in Verbindung mit der ersten lonentrennoptik zum Erzeugen von Produkt-Ionen;
ein Massenanalysegerät in Verbindung mit der lonenfragmentierungsoptik zum Trennen von Ionen gemäß ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; wobei das Massenanalysegerät einen Ionendetektor zum Detektieren von Ionen umfasst, die gemäß ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen getrennt wurden;
eine Steuerung, die funktionell mit der ersten und der zweiten lonentrennoptik, dem ersten lonendetektor und der lonenfragmentierungsoptik verbunden ist; wobei die Steuerung ein Speichermodul umfasst;
wobei die Steuerung das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor steuert, um:
1. (a) eine Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen im Speichermodul zu empfangen, wobei die Liste 25 bis 5.000.000 Targetanalyten, 25 bis 1.000.000 Targetanalyten; optional zwischen 50 und 100.000 Targetanalyten oder optional zwischen 50 und 10.000 Targetpeptiden enthält;
2. (b) eine einen Analyten enthaltende Probe bereitzustellen;
3. (c) eine Verteilung von Vorläuferanalytionen aus der Probe zu erzeugen;
4. (d) Vorläuferanalytionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen zu fragmentieren, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen;
5. (e) die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Produkt-Ionen in dem Massenanalysegerät zu messen, wobei das Massenanalysegerät eine Massengenauigkeit von wenigstens 100 ppm hat, optional eine Massengenauigkeit von wenigstens 1000 ppm, um dadurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; und
6. (f) Analytidentifizierung oder -quantifizierung bei der Datenerfassung durch Vergleichen der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen zu optimieren.

In einer Ausgestaltung wird ein Massenspektrometersystem zum Analysieren eines Analyten bereitgestellt, wobei:

die Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen Targetpeptide und Targetpeptid-Produktinformationen umfasst, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen; der Analyt Peptide umfasst, die Proteinen entsprechen; die Steuerung das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor steuert, um:
1. (d) Vorläuferpeptidionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen zu fragmentieren, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen; und
2. (f) die Protein- oder Peptididentifizierung oder -quantifizierung bei der Datenerfassung durch Vergleichen der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen, die ein oder mehreren Proteinen entsprechen, zu optimieren.

In einer Ausgestaltung wird ein Massenspektrometersystem zum Analysieren eines Analyten bereitgestellt, wobei die Steuerung ferner das Speichermodul, die ionenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor steuert, um:

Targetpeptid-Produktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu identifizieren, die einem Targetpeptid entsprechen, um dadurch ein Targetpeptid zu identifizieren; und
das identifizierte Targetpeptid aus der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen bei der Datenerfassung zu entfernen, das einem oder mehreren Proteinen entspricht.

In einer Ausgestaltung wird ein Massenspektrometersystem zum Analysieren eines Analyten bereitgestellt, wobei die Steuerung ferner das Steuermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor steuert, um: die identifizierten Targetpeptid-Produktinformationen aus der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen bei der Datenerfassung zu entfernen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen.
In einer Ausgestaltung wird ein Massenspektrometersystem zum Analysieren eines Analyten bereitgestellt, wobei die Steuerung ferner das Speichermodul, die ionenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor steuert, um: ein oder mehrere Targetpeptide zu identifizieren, die einem einzelnen Protein entsprechen, um dadurch ein Targetprotein zu identifizieren; und
alle identifizierten Targetpeptide und Peptidproduktinformationen aus der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen bei der Datenerfassung zu entfernen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, die dem identifizierten Protein entsprechen.
In einer Ausgestaltung wird ein Massenspektrometersystem zum Analysieren eines Analyten bereitgestellt, wobei die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor steuert, um: Targetpeptide und Targetpeptid-Produktinformationen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, bei der Datenerfassung zur Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen hinzuzufügen.
In einer Ausgestaltung umfasst das System ferner eine Chromatographiesäule in Verbindung mit der lonenquelle zum Fraktionieren der Probe.
In einer Ausgestaltung beinhaltet das System ferner die Steuerung, die das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät, die Chromatographiesäule und den Detektor ferner steuert, um: eine Chromatographiesäulen-Elutionsreihenfolge der Peptide in der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen zu berechnen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, um dadurch eine Elutionsreihenfolgeliste zu erzeugen;
die Elutionsreihenfolgeliste vom ersten eluierenden Peptid bis zum letzten eluierenden Peptid zu sortieren, um dadurch eine sortierte Elutionsreihenfolgeliste zu erzeugen;
die Probe mit der Chromatographiesäule vor dem Erzeugen einer Verteilung von Vorläuferpeptidionen aus der Probe zu fraktionieren;
Targetpeptid-Produktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu identifizieren, die einem Targetpeptid entsprechen, um dadurch ein Targetpeptid zu identifizieren;

das identifizierte Targetpeptid mit der sortierten Elutionsreihenfolgeliste bei der Datenerfassung zu vergleichen; und
ein oder mehrere Targetpeptide aus der sortierten Elutionsreihenfolgeliste zu identifizieren, die innerhalb von X Peptiden des identifizierten Peptids sind, wobei X gleich 20 % der Gesamtzahl von Targetpeptiden in der Elutionsreihenfolgeliste ist, um dadurch eine Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide zu erzeugen.

In einer Ausgestaltung umfassen die Targetanalyt-Produktinformationen die Massen der Targetanalyten oder Targetanalytprodukte. In einer anderen Ausgestaltung umfassen die Targetpeptid-Produktinformationen die Massen der Targetpeptide oder Targetpeptidprodukte.
In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die Ionenoptik, das Massenanalysegerät, die Chromatographiesäule und den Detektor, um: ein oder mehrere Peptide in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide bei der Datenerfassung zu identifizeren;
einen Bereich von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von Vorläufer-Ionen auszuwählen, die den ein oder mehreren Peptiden in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide entsprechen; und
die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse des Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen zu messen, die den ein oder mehreren Peptiden in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide entsprechen, um dadurch Vorläufermassenspektrometriedaten zu erzeugen.
In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die Ionenoptik, das Massenanalysegerät, die Chromatographiesäule und den Detektor, um: ein oder mehrere Peptide in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide bei der Datenerfassung zu identifizieren;
wobei in Schritt (d) die Vorläuferpeptidionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen den ein oder mehreren Peptiden in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide entsprechen.
In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die ionenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor, um: die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse eines Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen zu messen, die der Verteilung von Vorläuferpeptidionen entsprechen, um dadurch Vorläufermassenspektrometriedaten zu erzeugen;
ein Signal-Rausch-Verhältnis von zwei oder mehr Peaks in den Vorläufermassenspektrometriedaten, die einem oder mehreren Peptiden in der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen entsprechen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, bei der Datenerfassung zu ermitteln; wobei wenigstens einer der zwei oder mehr Peaks in den Vorläufermassenspektrometriedaten, die einem oder mehreren Peptiden entsprechen, einem markierten Protein entspricht und wenigstens einer einem unmarkierten Protein entspricht; und
die Schritte (c) - (f) zu wiederholen, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis des am wenigsten intensiven der zwei oder mehr Peaks in den Vorläufer-Massenspektrometriedaten, die einem oder mehreren Peptiden in der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen entsprechen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, weniger als 2:1, optional 3:1, optional 5:1, optional 10:1, optional 20:1, optional zwischen 2:1 und 20:1, optional zwischen 5:1 und 20:1 beträgt.
In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor, um: Targetpeptid-Produktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu identifizeren, die einem Targetprotein entsprechen, um dadurch ein Targetprotein zu identifizieren;
ein Signal-Rausch-Verhältnis von einem oder mehreren Peaks in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Sequenz-Tag des identifizierten Targetproteins entsprechen, bei der Datenerfassung zu ermitteln; und
die Schritte (c) - (f) zu wiederholen, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis von einem oder mehreren Peaks in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Sequenz-Tag eines identifizierten Targetproteins entsprechen, weniger als 2:1, optional 3:1, optional 5:1, optional 10:1, optional 20:1, optional zwischen 2:1 und 20:1, optional zwischen 5:1 und 20:1 beträgt.
In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor, um: Targetpeptid-Produktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu identifizieren, die einem Targetprotein entsprechen, um dadurch ein Targetprotein zu identifizieren;
ein Signal-Rausch-Verhältnis von einem oder mehreren Peaks in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Reporter-Tag des identifizierten Targetproteins entsprechen, bei der Datenerfassung zu ermitteln; und
die Schritte (c) - (f) zu wiederholen, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis von einem oder mehreren Peaks in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Reporter-Tag eines identifizierten Targetproteins entsprechen, weniger als 2:1, optional 3:1, optional 5:1, optional 10:1, optional 20:1, optional zwischen 2:1 und 20:1, optional zwischen 5:1 und 20:1 beträgt.
In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor, um: ein Targetpeptid mit einer oder mehreren Stellen pöst-translationaler Modifikation auszuwählen;
die Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen zu vergleichen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, um zu ermitteln, ob die Stellen des Targetpeptids mit einer oder mehreren post-translationalen Modifikationen eindeutig identifiziert werden können; und
Einstellen eines Fragmentierungsparameters bei der Datenerfassung, bis Stellen des Targetpeptids mit den ein oder mehreren post-translationalen Modifikationen eindeutig identifiziert werden können; wobei der Fragmentierungsparameter Fragmentierungsdruck, Gas, Elektronenenergie, Wellenlänge von elektromagnetischer Strahlung, Leistung von elektromagnetischer Strahlung, Beleuchtungszeit von elektromagnetischer Strahlung, Fluss von elektromagnetischer Strahlung, Gesamtdosis an elektromagnetischer Strahlung, Stoßenergie oder Reaktionszeit entspricht.
In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor, um: ein Targetpeptid mit einer oder mehreren Stellen post-translationaler Modifikation auszuwählen;
die Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen zu vergleichen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, um zu ermitteln, ob die Stellen des Targetpeptids mit einer oder mehreren post-translationalen Modifikationen eindeutig identifiziert werden können; und
Angleichen eines Fragmentierungsverfahrens bei der Datenerfassung, bis Stellen des Targetpeptids mit den ein oder mehreren post-translationalen Modifikationen eindeutig identifiziert werden können; wobei das Fragmentierungsverfahren eine stoßaktivierte Strahlendissoziation, eine lonenreaktionsdissoziation, eine Elektronenreaktionsdissoziation, eine Elektronentransferdissoziation, eine Elektroneneinfangdissoziation, eine neutrale Reaktionsdissoziation, eine laserinduzierte Dissoziation, eine oberflächeninduzierte Dissoziation oder eine stoßaktivierte Resonanzanregungs-Dissoziation ist.
In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Steuermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor, um: ein Targetpeptid mit einer oder mehreren Stellen post-translationaler Modifikation auszuwählen;
Peaks in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu identifizieren, die dem Targetpeptid mit einer oder mehreren Stellen von post-translationaler Modifikation entsprechen;
die Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, bei der Datenerfassung zu vergleichen, um zu ermitteln, ob die Stellen des Targetpeptids mit einer oder mehreren post-translationalen Modifikationen eindeutig identifiziert werden können; und
die Schritte (c) - (f) zu wiederholen, bis Stellen des Targetpeptids mit den ein oder mehreren post-translationalen Modifikationen eindeutig identifiziert werden können.
Die hierbei beschriebenen Systeme und Verfahren sind besonders im Rahmen einer Analyse auf der Basis isobarer oder isotopischer Markierung von Nutzen. In einer Ausgestaltung wird z.B. ein System bereitgestellt, bei dem Proteine oder Peptide isobar markierte Proteine oder Peptide sind. In einer Ausgestaltung sind die Proteine oder Peptide isotop markerierte Proteine oder Peptide. In einer Ausgestaltung sind die Proteine oder Peptide phosphorylierte Proteine oder Peptide. In einer Ausgestaltung sind die Proteine oder Peptide co-translational modifizierte Proteine oder Peptide. In einer Ausgestaltung sind die Proteine oder Peptide post-translational modifizierte Proteine oder Peptide. In einer Ausgestaltung zeigen die Proteine einen Krankheitszustand an.
In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor, um: Targetanalyt-Produktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu identifizieren, die einem Targetanalyten entsprechen, um dadurch einen Targetanalyten zu identifizieren; und den identifizierten Targetanalyten aus der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen bei der Datenerfassung zu entfernen.
In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor, um: die identifizierten Targetanalyt-Produktinformationen aus der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen bei der Datenerfassung zu entfernen.
In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor, um: einen oder mehrere Targetanalyten zu identifizieren, die einem einzelnen Analyten entsprechen, um dadurch einen Targetanalyten zu identifizeren; und alle identifizierten Targetanalyten und Analyt-Produktinformationen aus der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen bei der Datenerfassung zu entfernen, die dem identifizierten Analyten entsprechen.
In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor, um: Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen zur Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen bei der Datenerfassung hinzuzufügen.
In einer Ausgestaltung umfasst das System ferner eine Chromatographiesäule in Verbindung mit der lonenquelle zum Fraktionieren der Probe. In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät, die Chromatographiesäule und den Detektor, um: eine Chromatographiesäulen-Elutionsreihenfolge der Analyten in der Liste von Targetanalyten und Targetpeptidanalyten zu berechnen, die einem oder mehreren Analyten entsprechen, um dadurch eine Elutionsreihenfolgeliste zu erzeugen;

die Elutionsreihenfolgeliste vom ersten eluierenden Analyten bis zum letzten eluierenden Analyten zu sortieren, um dadurch eine sortierte Elutionsreihenfolgeliste zu erzeugen;
die Probe mit der Chromatographiesäule vor dem Erzeugen einer Verteilung von Vorläuferanalytionen aus der Probe zu fraktionieren;
Targetanalyt-Produktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu identifizieren, die einem Targetanalyten entsprechen, um dadurch einen Targetanalyten zu identifizeren;
den identifizierten Targetanalyten mit der sortierten Elutionsreihenfolgeliste bei der Datenerfassung zu vergleichen; und
eine oder mehrere Targetanalyten aus der sortierten Elutionsreihenfolgeliste zu identifizieren, die innerhalb von X Analyten des identifizierten Analyten sind, wobei X gleich 20 % der Gesamtzahl von Targetanalyten in der Elutionsreihenfolgeliste ist, um dadurch eine Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten zu erzeugen.

In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die ionenoptik, das Massenanalysegerät, die Chromatographiesäule und den Detektor, um: einen oder mehrere Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten bei der Datenerfassung zu identifizieren; einen Bereich von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von Vorläufer-Ionen auszuwählen, die den ein oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten entsprechen; und die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse des Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen zu messen, die den ein oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten entsprechen, um dadurch Vorläufer-Massenspektrometriedaten zu erzeugen.
In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät, die Chromatographiesäule und den Detektor, um: einen oder mehrere Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten bei der Datenerfassung zu identifizieren; wobei in Schritt (d) die Vorläuferanalytionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen den ein oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten entsprechen.
In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät, die Chromatographiesäule und den Detektor, um: einen oder mehrere Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten bei der Datenerfassung zu identifizieren; einen Bereich von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von Vorläufer-Ionen auszuwählen, die den ein oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten entsprechen; Vorläufer-Ionen mit Masse-zu-Ladung-Verhältnissen innerhalb des gewählten Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen zu fragmentieren; und die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der fragmentierten Vorläufer-Ionen zu messen, um dadurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen.
In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor, um: die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse eines Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen zu messen, die der Verteilung von Vorläuferanalytionen entsprechen, um dadurch Vorläufer-Massenspektrometriedaten zu erzeugen;
ein Signal-Rausch-Verhältnis von zwei oder mehr Peaks in den Vorläufer-Massenspektrometriedaten, die einem oder mehreren Analyten in der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen entsprechen, bei der Datenerfassung zu ermitteln; wobei wenigstens einer der zwei oder mehr Peaks in den Vorläufer-Massenspektrometriedaten, die einem oder mehreren Analyten entsprechen, einem markierten Analyten entspricht, und wenigstens einer einem unmarkierten Analyten entspricht; und
die Schritte (c) - (f) zu wiederholen, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis des am wenigsten intensiven der zwei oder mehr Peaks in den Vorläufer-Massenspektrometriedaten, die einem oder mehreren Analyten in der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen entsprechen, weniger als 2:1, optional 3:1, optional 5:1, optional 10:1, optional 20:1, optional zwischen 2:1 und 20:1, optional zwischen 5:1 und 20:1 beträgt.
In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor, um: Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferanalytionen zu messen, um dadurch Vorläuferanalytionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; und die Analytidentifizierung oder -quantifizierung bei der Datenerfassung durch Vergleichen der Vorläuferanalytionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen zu optimieren, wobei die genannte Liste ferner Targetanalyt-Vorläuferioneninformationen und Landmark-Vorläuferionensignalinformationen enthält.
In einer Ausgestaltung wird ein Massenspektrometersystem zum Analysieren eines Analyten bereitgestellt, wobei das System Folgendes umfasst:

eine lonenquelle zum Erzeugen von Ionen von dem Analyten;
erste lonentrennoptik in Verbindung mit der lonenquelle zum Trennen von Ionen gemäß ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen;
lonenfragmentierungsoptik in Verbindung mit der ersten lonentrennoptik zum Erzeugen von Produkt-Ionen;
ein Massenanalysegerät in Verbindung mit der lonenfragmentierungsoptik zum Trennen von Ionen gemäß ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; wobei das Massenanalysegerät einen Ionendetektor zum Detektieren von Ionen umfasst, die gemäß ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen getrennt wurden;
eine Steuerung, die funktionell mit der ersten und der zweiten lonentrennoptik, dem ersten lonendetektor und der lonenfragmentierungsoptik verbunden ist; wobei die Steuerung ein Speichermodul umfasst;
wobei die Steuerung das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor steuert, um:
1. (a) eine Liste von Targetanalyten, Targetanalyt-Vorläuferioneninformationen und Landmark-Vorläuferionensignalinformationen bereitzustellen, wobei die Liste 25 bis 5.000.000 Targetanalyten enthält;
2. (b) eine einen Analyten enthaltende Probe bereitzustellen;
3. (c) eine Verteilung von Vorläuferanalytionen aus der Probe zu erzeugen;
4. (d) Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferanalytionen in einem Massenanalysegerät zu messen, wobei das Massenanalysegerät eine Massengenauigkeit von wenigstens 1000 ppm hat, um dadurch Vorläuferanalytionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; und
5. (e) die Analytidentifizierung oder -quantifizierung bei der Datenerfassung durch Vergleichen der Vorläuferanalytionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetanalyten, Targetanalyt-Vorläuferioneninformationen und Landmark-Vorläuferionensignalinformationen zu optimieren.

In einer Ausgestaltung wird ein Massenspektrometersystem zum Analysieren eines Analyten bereitgestellt, wobei das System Folgendes umfasst:

eine lonenquelle zum Erzeugen von Ionen von dem Analyten;
erste lonentrennoptik in Verbindung mit der lonenquelle zum Trennen von Ionen gemäß ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen;
lonenfragmentierungsoptik in Verbindung mit der ersten lonentrennoptik zum Erzeugen von Produkt-Ionen;
ein Massenanalysegerät in Verbindung mit der lonenfragmentierungsoptik zum Trennen von Ionen gemäß ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; wobei das Massenanalysegerät einen Ionendetektor zum Detektieren von Ionen umfasst, die gemäß ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen getrennt wurden;
eine Steuerung, die funktionell mit der ersten und der zweiten lonentrennoptik, dem ersten lonendetektor und der lonenfragmentierungsoptik verbunden ist; wobei die Steuerung ein Speichermodul umfasst, wobei die Steuerung das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor steuert, um:
1. (a) eine Liste von Targetpeptiden bereitzustellen, wobei die Targetliste 25 bis 5.000.000 Targetpeptide, optional zwischen 25 und 1.000.000 Targetpeptide, optional zwischen 50 und 100.000 Targetpeptide oder optional zwischen 50 und 10.000 Targetpeptide umfasst;
2. (b) eine Chromatographiesäulen-Elutionsreihenfolge und Elutionszeit der Peptide in der Liste von Targetpeptiden zu berechnen, um dadurch eine Elutionsreihenfolgeliste und vorhergesagte Elutionszeiten für jedes Targetpeptid zu erzeugen;
3. (c) die Elutionsreihenfolgeliste vom ersten eluierenden Peptid bis zum letzten eluierenden Peptid zu sortieren, um dadurch eine sortierte Elutionsreihenfolgeliste zu erzeugen;
4. (d) eine den Analyten enthaltende Probe bereitzustellen, wobei der genannte Analyt Peptide umfasst, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen;
5. (e) eine Verteilung von Vorläuferanalytionen aus der Probe zu erzeugen, wobei die Analyt-Ionen Peptid-Ionen umfassen;
6. (f) Vorläuferanalytionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen zu fragmentieren, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen;
7. (g) die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der in dem Massenanalysegerät zu Elutionszeiten gesammelten Produkt-Ionen zu messen, die den vorhergesagten Elutionszeiten für die Targetpeptide entsprechen, wobei das Massenanalysegerät eine Massengenauigkeit von wenigstens 100 ppm hat, optional eine Massengenauigkeit von wenigstens 1000 ppm, um dadurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; und
8. (h) Targetpeptide oder Peptidproduktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Targetpeptid entsprechen, durch Vergleichen der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen zu identifizieren.

In einer Ausgestaltung beinhalten die Targetanalyt-Produktinformationen die Massen der Targetanalyten oder Targetanalytprodukte. In einer anderen Ausgestaltung beinhalten die Targetpeptid-Produktinformationen die Massen der Targetpeptide oder Targetpeptidprodukte.
In einer Ausgestaltung wird ein Massenspektrometersystem zum Analysieren eines Analyten bereitgestellt, wobei das System Folgendes umfasst:

eine lonenquelle zum Erzeugen von Ionen von dem Analyten;
erste lonentrennoptik in Verbindung mit der lonenquelle zum Trennen von Ionen gemäß ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen;
lonenfragmentierungsoptik in Verbindung mit der ersten lonentrennoptik zum Erzeugen von Produkt-Ionen;
ein Massenanalysegerät in Verbindung mit der lonenfragmentierungsoptik zum Trennen von Ionen gemäß ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; wobei das Massenanalysegerät einen Ionendetektor zum Detektieren von Ionen umfasst, die gemäß ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen getrennt wurden;
eine Steuerung, die funktionell mit der ersten und der zweiten lonentrennoptik, dem ersten lonendetektor und der lonenfragmentierungsoptik verbunden ist; wobei die Steuerung ein Speichermodul umfasst, wobei die Steuerung das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor steuert, um:

(a) eine Sequenzierungswarteschlange zu erzeugen, die einen auszuführenden MS1-Scan und ein oder mehrere auszuführende Massenspektrometrie-Scans enthält, wobei die genannten auszuführenden Massenspektrometrie-Scans in der Sequenzierungswarteschlange mit Analyt-Ionenpeaks mit einer vorhergesagten Elutionszeit korrelieren und der genannte MS1-Scan nicht mit einer Elutionszeit assoziiert ist;
(b) eine Echtzeit-Heap-Warteschlange zu erzeugen, die ein oder mehrere auszuführende Target-Scans enthält, wobei die genannten auszuführenden Target-Scans mit Peptiden oder Targetpeptiden mit einer vorhergesagten Elutionszeit korrelieren, wobei immer dann, wenn ein neuer Massenspektrometrie-Scan oder Target-Scan auszuführen ist, Target-Scans in der Echtzeit-Heap-Warteschlange vor Massenspektrometrie-Scans aus der Sequenzierungswarteschlange ausgeführt werden;
(c) eine einen Analyten enthaltenden Probe bereitzustellen;
(d) den MS1-Scan auszuführen, wenn keine anderen Scans in der Sequenzierungswarteschlange oder der Echtzeit-Heap-Warteschlange vorhanden sind, wobei das Ausführen des MS1-Scans das Erzeugen einer Verteilung von Vorläuferanalytionen aus der Probe und das Messen von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von wenigstens einem Teil der Produkt-Ionen in einem Massenanalysegerät beinhaltet, um dadurch ein oder mehrere Analytlonenpeaks zu erzeugen;
(e) einen oder mehrere Analyt-Ionenpeaks auszuwählen, einen neuen Massenspektrometrie-Scan zu erzeugen, der jedem der gewählten Analyt-Ionenpeaks entspricht, und den neuen Massenspektrometrie-Scan zur Sequenzierungswarteschlange hinzuzufügen;
(f) einen oder mehrere Massenspektrometrie-Scans aus der Sequenzierungswarteschlange auszuführen, wobei Massenspektrometrie-Scans, die vor kürzerer Zeit der Sequenzierungswarteschlange hinzugefügt wurden, nach Massenspektrometrie-Scans ausgeführt werden, die der Sequenzierungswarteschlange früher hinzugefügt wurden, wobei das Ausführen von einem oder mehreren Massenspektrometrie-Scans Folgendes beinhaltet:
1. (i) Fragmentieren von Vorläuferanalytionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen;
2. (ii) Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Produkt-Ionen in einem Massenanalysegerät, um dadurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen;
(g) einen Targetanalyten aus den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu identifizieren, eine Elutionszeit für den Targetanalyten zu berechnen, einen neuen Target-Scan zu erzeugen, der dem Targetanalyten und der berechneten Elutionszeit entspricht, und den neuen Target-Scan zur Echtzeit-Heap-Warteschlange hinzuzufügen;
(h) einen oder mehrere Target-Scans aus der Echtzeit-Heap-Warteschlange auszuführen, wobei Target-Scans zu Elutionszeiten ausgeführt werden, die den berechneten Elutionszeiten für die Targetanalyten entsprechen, wobei das Ausführen von einem oder mehreren Target-Scans Folgendes beinhaltet:
- (i) Fragmentieren von Vorläuferanalytionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen;
- (ii) Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Produkt-Ionen in dem Massenanalysegerät, um dadurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; und
(i) Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten mit einer Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen zu vergleichen;

Die hierbei beschriebenen Systeme und Verfahren sind besonders im Rahmen einer Analyse auf der Basis isobarer oder isotopischer Markierung von Nutzen. In einer Ausgestaltung wird z.B. ein System bereitgestellt, bei dem der Analyt ein isobar markierter Analyt ist. In einer Ausgestaltung ist der Analyt ein isotopisch markierter oder isotopisch kodierter Analyt. In einer Ausgestaltung umfasst der Analyt ein oder mehrere kleine Moleküle, pharmazeutische Verbindungen, Oligonucleotide oder Zucker.
In einer Ausgestaltung steuert die Steuerung ferner das Speichermodul, die ionenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor, um die ein oder mehreren Proteine zu verdauen. In einer Ausgestaltung wird die Verteilung von Vorläuferanalytionen mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle oder einer MALDI-Quelle erzeugt. In einer Ausgestaltung wird das System in einem Tandem-Massenspektrometerinstrument, einem mehrstufigen Massenspektrometer-Instrument oder einem Hybrid-Massenspektrometerinstrument implementiert.
Ohne uns durch eine bestimmte Theorie zu binden, können hierbei Erörterungen der Ansichten oder des Verständnisses von zu Grunde liegenden Prinzipien oder Mechanismen in Bezug auf die Erfindung enthalten sein. Es wird erkannt, dass unabhängig von der endgültigen Korrektheit irgendeiner Erläuterung oder Hypothese eine Ausgestaltung der Erfindung trotzdem funktionsfähig und nützlich sein kann.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN

1 zeigt eine Tabelle der Zahl von Proteinen, die in üblichen übergreifenden fünffachen Schrotschuss-Proteomik-Experimenten (links) und Mikroarray-Transkript-Analysen (rechts) beobachtet wurden.
2 zeigt einen Plot, der veranschaulicht, dass die Verwendung eines 2-fach-Veränderungs-Schwellenfilters Veränderungen anzeigen kann, die statistisch nicht signifikant sind (p > 0,1, linke Balken, rot), während subtile, aber sich ständig verändernde Proteine oder Phosphorylierungsstellen fehlen (p < 0,0005, rechte Balken, gold).
3 zeigt ein Histogramm der Gene-Ontology-(GO)-Termini-Gruppierungen anhand der Zahl der Proteine, die in jeder vorliegen. Nur 20 GO-Gruppierungen enthalten mehr als 1000 Elemente.
4 zeigt ein Schaubild des OrbiQ-Massenspektrometers.
5 zeigt ein Schaubild eines QqQ-Systems, das vordefinierte Vorläufer auswählen und ihre Produkt-Ionen nacheinander detektieren kann. Außerdem wird ein einfaches OrbiQ-System gezeigt, das alle von einem Vorläufer erzeugten Produkt-Ionen detektieren kann, sowie ein umfassenderes OrbiQ-System, das mehrere Produkt-Ionen von mehreren Vorläufern detektieren kann.
6 zeigt eine Empfindlichkeitsbeurteilung von SRM (QqQ) und PRM (parallele Reaktionsüberwachung) (OrbiQ). Ein komplexes Gemisch aus Hefepeptiden im Bereich von 20 bis 20.000 amol wurde mit mehreren synthetischen Peptiden gespickt. Jede Peptidsequenz (x-Achse) zeigt die niedrigste detektierbare Menge für jedes Verfahren. Die eingesetzten Diagramme auf der rechten Seite zeigen, wie genaue Massenmessungen die Detektion von Targets mit geringen Konzentrationen in komplexen Hintergründen zulassen können.
7 zeigt einen Plot von mehreren mitochondrialen Transkript-Expressionsniveaus und deren entsprechende Proteinabundanzen als Reaktion auf akuten Eisenstress.
8 zeigt OrbiQ „Leistungszahlen“ (Figures of Merit) auf der Basis der bekannten Fähigkeiten jeder Komponente und der PRM-Leistung einer Velos-Orbitrap.
9 zeigt einen Plot, der die Nichtübereinstimmungsrate zwischen OMSSA-Identifizierungen (1 % FDR) und rtTC in Abhängigkeit von der Zahl der durch rtTC abgeglichenen Produkte zeigt.
10 zeigt einen Plot der Differenz zwischen der relativen Hydrophobizitäts-Verschiebung einer gegebenen Identifizierung und dem Durchschnitt der vorherigen fünf relativen Hydrophobizitäts-Verschiebungen. Diese Differenz liegt in 95 % der Fälle innerhalb von +/-200 des vorhergesagten Wertes.
11 zeigt einen Plot der Anzahl von Kanälen, die zum Detektieren verschiedener Zahlen der ca. 1000 mitochondrialen Proteine mit MaeStro2 benötigt werden.
12 zeigt Immunblots, die den dosisabhängigen (oben) und zeitabhängigen (unten) Verlust an mitochondrialen Proteinen nach einer Eisenchelation offenbaren.
13 zeigt ein Flussdiagramm der Versuchsanordnung für eine mitochrondriale Proteinanalyse wie hierbei beschrieben.
14 ist eine Darstellung des Rechenansatzes zur Identifizierung von mRNA-Motiven, die an post-transkriptionalen Regulierungsmechanismen beteiligt sind.
15 zeigt ein Flussdiagramm eines vollständigen MS¹-Scans mit einem SILAC-Paar, dessen schwerer lonenpeak heavy on list (Der Begriff „heavy on list“ in 15, Abs. [0100] und Abs. [0302] soll bedeuten, dass der schwere lonenpeak des speziellen SILAC-Paares auf der Erfassungsliste eines Targets ist. Da das schwere Ion zu einem vorhergesagten Target auf der Liste passt, wird das kreisförmige Paar an Peaks einem zusätzlichen SIM-Scan unterzogen) in Feld A ist; den Schritt des Prüfens des Signal-Rausch-Verhältnisses des am wenigsten intensiven SILAC-Peak-Paares in Feld B; das Verschmälern des MS¹-Scan-Fensters zum Erhöhen des Signal-Rausch-Verhältnisses der SILAC-Paar-Peaks in Feld C; und das erneute Prüfen des Signal-Rausch-Verhältnisses der SILAC-Paar-Peaks in Feld D.
16 veranschaulicht ein Fortschreiten der inSeq-Logik. (Feld A) Ein nHPLC-MS/MS-Chromatogramm bei 48,35 Minuten zusammen mit einem MS²-Scan (Feld B), das zu dieser Zeit nach einer Dissoziation eines doppelt protonierten Merkmals mit m/z 737,86 erhalten wurde. Nach dem Sammeln des MS²-Scans gruppiert inSeq alle Peptidkandidaten (in silico, n = 94), deren theoretische Masse innerhalb . von 30 ppm der experimentell ermittelten Vorläuferneutralmasse von 1473,757 (Feld C) liegt. Dann führt inSeq in silico eine Fragmentierung durch, um eine theoretische Produkt-Ionenserie für jeden der 94 Kandidaten zu erzeugen, und vergleicht dann jede mit dem experimentellen Spektrum (<10 ppm Massengenauigkeit). (Feld D) Plot von inSeq-Identifizierungen im Vergleich zu einer konventionellen Nacherfassungssuche. inSeq stimmt (richtig positiv) in >98 % der Fälle überein, wenn >6 Fragment-Ionen abgeglichen werden.
17 zeigt Versuchsergebnisse, die Ausgestaltungen mit einer Elutionsreihenfolgevorhersage mittels inSeq demonstrieren. (Feld A) Experimentelles Chromatogramm, Gradient 60,39 Minuten bis 120 Minuten, das erhalten wurde, während inSeq Sofortidentifizierungen aufzeichnete. (Feld B) Die von inSeq berechnete Elutionsreihenfolge (CEO), die durch Mitteln der CEOs der vorherigen 5 sofort identifizierten Peptide erhalten wurde. (Feld C) Das asymmetrische Fenster (5 a.u.) um den sofortigen CEO-Durchschnitt (µ = 26,926) und die entsprechenden Sequenzen. inSeq kann dann eine Targetliste auf nur diejenigen verfeinern, die CEOs innerhalb des vorhergesagten Fensters haben. (Feld D) Diese Analyse wird nach jeder neuen Peptidbestätigung wiederholt, um das CEO-Fenster ständig auf der Basis von aktuellen chromatographischen Bedingungen neu auszurichten.
18 zeigt Versuchsergebnisse, die demonstrieren, dass inSeq quantitative Resultate für isobares Tagging verbessert. Es wurde ein inSeq-Entscheidungsknoten geschrieben, so dass eine Echtzeit-Identifizierung einer Targetsequenz eine automatische Erfassung von drei aufeinander folgenden QuantMode-(QM)-Scans bewirkte. (Feld A) Eine Summierung der Reporter-lonen-Tag-Intensität von ein, zwei oder drei QM-Scans führt zu einer erheblichen Verbesserung der statistischen Signifikanz der Messung. (Feld B) Eine Summierung von technischen QM-Replikaten reduziert die Variation bei der biologischen Replikatmessung durch Erhöhen des Reporter-Ionen-S/N. (Feld C) Durch inSeq ausgelöste QM-Scans erhöhen die Zahl der sich signifikant verändernden Proteine von 28 auf 91.
19 zeigt Versuchsergebnisse, die demonstrieren, dass inSeq quantitative Resultate für SILAC verbessern kann. Nach einer inSeq-Bestätigung eines Peptids mit der Sequenz IEELDQENEAALENGIK wurde automatisch ein enger (8 Th), hochauflösender (R = 100.000) SIM-Scan ausgelöst, der das S/N-Verhältnis von 5,8 auf 1279 erhöhte (Felder A und B). Dieser SIM-Scan ermöglichte die Detektion beider Partner und ergab das richtige Verhältnis von 5:1 (leicht:schwer). Neben einem erhöhten dynamischen Bereich stimmt die theoretische Isotopverteilung (in ungefüllten Kreisen angedeutet) im SIM-Scan gut überein (Feld B), während das Signal für den schweren Partner im MS¹ noch nicht einmal detektierbar ist (Feld A). Über unseren gesamten Datensatz verbessern die durch inSeq ausgelösten SIM-Scans das mittlere Verhältnis von 4,47 auf 5,34, aber, was noch beeindruckender ist, sie produzierten ~20 % mehr quantifizierbare Messungen (3548 gegenüber 2887).
20 zeigt Versuchsergebnisse, die demonstrieren, dass inSeq PTM-Lokalisierungsraten verbessern kann. Nach MS² (HCD) des einzeln phosphorylierten Vorläufers RNsSEASSGDFLDLK konnte inSeq nicht genügend Informationen finden, um die Modifikation zuverlässig entweder auf Ser 3 oder 4 zu lokalisieren (Feld A, AScore = 0). inSeq löste sofort ein ETD MS²-Scan-Ereignis an demselben Vorläufer aus (Feld B). Diesem Spektrum wurde ein AScore von 31,0129 (Phosphorylierung auf Ser3) zugeordnet und es wurde als zuverlässig lokalisiert angesehen - man beachte die SDFs c₃ und z₁₂ Ionen. (Feld C) Im Allgemeinen stimmte die inSeq-Lokalisierungsberechnung mit einer Offline-Analyse unter Anwendung des tatsächlichen AScore-Algorithmus überein. (Feld D) Mit einem einfachen Dissoziationsverfahren DT erzeugte inSeq eine zuverlässig lokalisierte Phosphorylierungsstelle für 78 von 324 nicht lokalisierbaren Stellen.
21 zeigt eine Verteilung von inSeq-Sofortanalysezeiten (Q-Exactive). Das komplette Hefeproteom (6717 Proteine) wurde in silico verdaut (Trypsin-Spezifizität bis zu 3 verpasste Spaltungen) und die resultierenden Peptide wurden sortiert, um nur diejenigen mit einer Länge zwischen 6 und 50 Resten für eine Datenbank von 1.174.780 eindeutigen Sequenzen zu behalten. Der von inSeq verursachte Overhead ist klein (µ = 16 ms / Spektrum) im Vergleich zur Gesamterfassungsrate (-100-250 ms/Spektrum), wobei mehr als 95 % der MS²-Ereignisse für eine Suche weniger als 45 ms benötigen.
22 zeigt Versuchsergebnisse von Tests der inSeq-(Q-Exactive)-Detektionsfähigkeiten. Ganzzellen-Hefelysat wurde bei 2 fmol (auf Säule)- mit fünfundzwanzig AQUA™-Peptiden (Sigma-Aldrich) gespickt. Acht dieser Peptide wurden targetiert, indem 5 HCD-(PRM)-Scans durchgeführt wurden, gefolgt von 1 SIM für den gesamten Durchlauf (90 min).
23 zeigt SIM- und PRM-extrahierte lonenchromatogramme (XIC) für die in 22 targetierten 8 AQUA™-Peptide.
24 zeigt Versuchsergebnisse, die demonstrieren, dass inSeq (Q-Exactive) die 8 Peptide aus 22 detektieren konnte. inSeq konnte jedes der 8 Peptide bei 2 fmol detektieren, während nur 1 bis 3 dieser Peptide bei 2 fmol mit datenabhängiger Erfassung (DDA) detektiert wurden.
Die 25-30 zeigen schematische Schritte für eine sofortige Sequenzbestätigung mit inSeq. 25 zeigt zunächst das Erstellen einer Liste von Peptidtargets aus vorherigen DDA-Experimenten und deren Sortierung gemäß einer Elutionsreihenfolge (CEO). 26 zeigt die Durchführung von DDA mit einer Einschlussliste aus der Liste von Peptiden. Die Peptide, die durch inSeq identifiziert wurden, werden zum Aktualisieren des CEO-Fensters verwendet. 27 zeigt, dass, wenn sich die durchschnittliche CEO einer Target-CEO nähert, der PRM-Zyklus für dieses Target gestartet wird. 28 zeigt, dass die PRM-Scans für einen bestimmten Zeitraum mit einer regelmäßigen Frequenz gestartet werden. 29 zeigt, dass DDA-Scans ablaufen, wenn eine freie Möglichkeit dazu besteht, um das CEO-Fenster auf dem aktuellen Stand zu halten. 30 zeigt das Fortsetzen der DDA mit der Einschlussliste, bis das nächste Target in das CEO-Fenster eintritt.
31 zeigt ein Flussdiagramm der Implementation eines inSeq-Prozesses. Dieser Prozess enthält zwei Datenstrukturen zum Speichern von anstehenden Scans, die vom Massenspektrometer auszuführen sind: 1) eine Scan-Queue-(SQ)-Datenstruktur und 2) eine Echtzeit-Heap-(rtHeap)-Datenstruktur, wobei der Scan in rtHeap Vorrang gegenüber anderen Scans in der SQ hat.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
In Bezug auf die Zeichnungen weisen gleiche Bezugsziffern auf gleichartige Elemente hin und dieselbe Zahl, die in mehr als einer Zeichnung erscheint, bezieht sich auf dasselbe Element. Im Allgemeinen haben die hierbei verwendeten Begriffe und Ausdrücke ihre in der Technik anerkannte Bedeutung, die in Standardtexten, Journalreferenzen und der Fachperson bekannten Kontexten zu finden sind. Die folgenden Definitionen sollen deren spezifische Verwendung im Rahmen der Erfindung verdeutlichen.
Die hierbei verwendeten Begriffe „Produkt-lon“ und „Sekundär-Ion“ werden in der vorliegenden Beschreibung austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Ion, das bei einem Fragmentierungsprozess eines Vorläufer-Ions erzeugt wird. Der hierbei verwendete Begriff „sekundäres Produkt-Ion“ bezieht sich auf ein Ion, das das Produkt aufeinander folgender Fragmentierungen ist.
Der hierbei verwendete Begriff „Vorläufer-Ion“ bezieht sich auf ein Ion, das in der Ionisationsstufe der Massenspektrometrieanalyse erzeugt wird, einschließlich der MS¹-Ionisationsstufe der MS/MS-Analyse.
Der hierbei verwendete Begriff „Analysieren“ bezieht sich auf einen Vorgang zum Ermitteln einer Eigenschaft eines Analyten. Durch Analysieren können beispielsweise physikalische Eigenschaften von Analyten wie die Massen- oder Atom- oder Substituentenzusammensetzung bestimmt werden.
Der hierbei verwendete Begriff „Analyt“ bezieht sich auf eine Verbindung oder eine Zusammensetzung, die der Gegenstand einer Analyse ist. Analyten beinhalten z.B., aber ohne Begrenzung, Proteine, Peptide, kleine Moleküle, pharmazeutische Verbindungen, Oligonucleotide und Zucker. Ein „isotopisch markierter Analyt“ bezieht sich auf einen Analyten, der mit einem oder mehreren isobaren Tagging-Reagenzien markiert wurde. Ebenso bezieht sich ein „isobar markierter Analyt“ auf einen Analyten, der mit einem oder mehreren isobaren Tagging-Reagenzien markiert wurde. Ein „isobar markierter Analyt“ kann beispielsweise ein Gemisch sein, das Proteine oder Peptide enthält, die mit mehreren isobaren Tagging-Reagenzien markiert wurden, wobei die isobaren Tagging-Reagenzien verschiedene Reporter-Ionen bei der Fragmentierung erzeugen.
Der hierbei verwendete Begriff „Targetanalyt-Produktinformationen“ und „Targetpeptid-Produktinformationen“ bezieht sich auf eine oder mehrere gemessene Eigenschaften des Targetanalyten, Targetpeptids oder von Ionen oder Fragmenten des Targetanalyten oder Targetpeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus, aber ohne Begrenzung, Masse, Signalintensität, Masse-zu-Ladung-Verhältnis, Ladungszustand, Signal-Rausch-Verhältnis und Kombinationen davon.
Der hierbei verwendete Begriff „Ionenquelle“ bezieht sich auf eine Vorrichtungskomponente, die Ionen aus einer Probe erzeugt. Beispiele für lonenquellen sind, aber ohne Begrenzung, Elektrospray-Ionisationsquellen und matrixgestützte Laser-Desorptions-/Ionisations-(MALDI)-Quellen.
Der hierbei verwendete Begriff „Massenspektrometrie“ (MS) bezieht sich auf eine Analysetechnik zum Bestimmen der elementaren Zusammensetzung eines Analyten. Massenspektrometrische Techniken sind zum Verdeutlichen der chemischen Strukturen von Analyten wie Peptiden und anderen chemischen Verbindungen von Nutzen. Das Massenspektrometrieprinzip besteht darin, Analyte zu ionisieren, um geladene Spezies oder Spezienfragmente zu erzeugen und ihre Masse-zu-Ladung-Verhältnisse zu messen. Die Durchführung einer massenspektrometrischen Analyse eines Analyten resultiert in der Erzeugung von Massenspektrometriedaten, die sich auf die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse des Analyten und der Analytfragmente beziehen. Massenspektrometriedaten, die einem Analyt-Ion und Analyt-Ionenfragmenten entsprechen, werden in Masse-zu-Ladung-(m/z)-Einheiten ausgedrückt, die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Analyt-Ionen und/oder Analytlonenfragmente repräsentieren.
„Quantitative Analyse“ ist die Ermittlung der absoluten oder relativen Abundanz von einer, mehreren oder allen bestimmten Substanz(en) in einer Probe. Für biologische Proben kann eine quantitative Analyse per Massenspektrometrie die relative Abundanz von Peptiden und Proteinen ermitteln. Im Rahmen der anerkannten Methodik zum Durchführen von massenspektrometrischer Quantifizierung wird ein MS/MS-fragmentationsfähiges Massenspektrometer verwendet (d.h. Dreifachquadrupol oder lonenfalle). Der Quantifizierungsvorgang beinhaltet typischerweise isobares Markieren von Peptidvorläufern, das in Kombination mit Nacherfassungssoftware die relative Abundanz von Peptiden liefert.
Der hierbei verwendete Begriff „Interferenz“ bezieht sich auf eine Spezies, die bei einer Analyse detektiert wird und die störend auf die Detektion einer Spezies oder eines Analyten von Interesse einwirkt. Interferenz kann sich auf die Detektion eines Proteins oder Proteinfragments beziehen, das kein Protein oder Proteinfragment von Interesse ist und das störend auf die genaue Detektion oder Quantifizierung des Proteins oder Peptidfragments von Interesse einwirkt. Interferenz kann als ein Interferenzverhältnis quantifiziert werden, wie z.B. ein Verhältnis zwischen einer Größe eines Interferenzsignals und einer Größe eines Analytsignals. Bei einer Massenspektralanalyse kann sich Interferenz als ein Interferenz-Peak zeigen, der der Detektion einer Spezies entspricht, die kein Analyt von Interesse ist.
Der hierbei verwendete Begriff „Signal-Rausch-Verhältnis“ bezieht sich auf ein Maß, das quantifiziert, wie stark ein Signal durch Rauschen oder ein unerwünschtes Signal verfälscht wurde. Er kann sich auch auf das Verhältnis von Signalleistung zu der das Signal verfälschenden Rauschleistung beziehen. Ein Verhältnis von mehr als 1:1 weist auf mehr Signale als Rauschen hin und ist für einige Anwendungen wünschenswert.
Der hierbei verwendete Begriff „Masse-zu-Ladung-Verhältnis“ bezieht sich auf das Verhältnis zwischen der Masse einer Spezies und dem Ladungszustand einer Spezies. Der Begriff „m/z-Einheit“ bezieht sich auf ein Maß des Masse-zu-Ladung-Verhältnisses. Die Thomson-Einheit (mit Th abgekürzt) ist ein Beispiel für eine m/z-Einheit und ist als der Absolutwert des Verhältnisses zwischen der Masse eines Ions (in Dalton) und der Ladung des Ions (mit Bezug auf die elementare Ladung) definiert.
Der hierbei verwendete Begriff „Ionenoptik“ bezieht sich auf eine Vorrichtungskomponente, die den Transport und die Manipulation geladener Partikel, z.B. Ionen, durch Anlegen von elektrischen und/oder magnetischen Feldern unterstützt. Das elektrische oder magnetische Feld kann statisch oder wechselnd sein oder kann sowohl statische als auch wechselnde Komponenten enthalten. Ionenoptische Vorrichtungskomponenten beinhalten z.B., aber ohne Begrenzung, Ionen-Deflektoren, die Ionen ablenken, lonenlinsen, die Ionen fokussieren, und Multipole (wie z.B. Vierpole), die Ionen auf einen bestimmten Raum oder eine bestimmte Bahn beschränken. Ionenoptik beinhaltet mehrpolige RF-Vorrichtungskomponenten, die mehrere Stäbe mit sowohl statischen als auch wechselnden elektrischen und/oder magnetischen Feldern umfassen.
Der hierbei verwendete Begriff „Massenspektrometer“ bezieht sich auf eine Vorrichtung, die Ionen aus einer Probe erzeugt, die Ionen nach ihrer Masse trennt und die Masse und Abundanz der Ionen detektiert. Massenspektrometer beinhalten mehrstufige Massenspektrometer, die die massengetrennten Ionen fragmentieren und die Produkt-Ionen ein oder mehrere Male nach Masse trennen. Mehrstufige Massenspektrometer beinhalten Tandem-Massenspektrometer, die die massengetrennten Ionen fragmentieren und die Produkt-Ionen einmal nach Masse trennen.
Der hierbei verwendete Begriff „Krankheitszustand“ bezieht sich auf einen Zustand, der Schmerzen, Dysfunktion, Not, soziale Probleme und/oder den Tod eines Patienten verursachen kann. Die hierbei beschriebenen Verfahren und Systeme können für die Diagnose eines Krankheitszustands von Nutzen sein.
Die Begriffe „Peptid“ und „Polypeptid“ werden in der vorliegenden Beschreibung synonym verwendet und beziehen sich auf eine Klasse von Verbindungen, die aus Aminosäureresten bestehen, die durch Amidbindungen (oder Peptidbindungen) chemisch aneinander gebunden sind. Peptide und Polypeptide sind polymere Verbindungen, die wenigstens zwei Aminosäurereste oder modifizierte Aminosäurereste umfassen. Modifikationen können natürlich vorkommen oder nicht natürlich vorkommen, wie z.B. durch chemische Synthese erzeugte Modifikationen. Modifikationen an Aminosäuren in Peptiden beinhalten, aber ohne Begrenzung, Phosphorylierung, Glykosylierung, Lipidierung, Prenylierung, Sulfonierung, Hydroxylierung, Acetylierung, Methylierung, Methioninoxidation, Alkylierung, Acylierung, Carbamylierung, lodierung und die Zugabe von Cofaktoren. Peptide beinhalten Proteine und beinhalten ferner Zusammensetzungen, die durch den Abbau von Proteinen, z.B. durch proteolytische Verdauung, entstehen. Peptide und Polypeptide können durch eine im Wesentlichen vollständige Verdauung oder durch teilweisen Verdau von Proteinen erzeugt werden. Zu Polypeptiden gehören z.B. Polypeptide mit 1 bis 100 Aminosäureeinheiten, optional für einige Ausgestaltungen 1 bis 50 Aminosäureeinheiten und optional für einige Ausgestaltungen 1 bis 20 Aminosäureeinheiten.
„Protein“ bezieht sich auf eine Klasse von Verbindungen, die eine oder mehrere Polypeptidketten und/oder modifizierte Polypeptidketten umfassen. Proteine können durch natürlich vorkommende Prozesse wie post-translationale Modifikationen oder co-translationale Modifikationen modifiziert werden. Beispielhafte post-translationale Modifikationen oder co-translationale Modifikationen sind, ohne Begrenzung, Phosphorylierung, Glykosylierung, Lipidierung, Prenylierung, Sulfonierung, Hydroxylierung, Acetylierung, Methylierung, Methioninoxidation, die Zugabe von Cofaktoren, Proteolyse und der Einbau von Proteinen in makromolekulare Komplexe. Die Modifikation von Proteinen kann auch nicht natürlich vorkommende Derivate, Analoga und funktionelle Nachahmer, erzeugt durch chemische Synthese, beinhalten. Beispielhafte Derivate beinhalten chemische Modifikationen wie Alkylierung, Acylierung, Carbamylierung, lodierung oder jede Modifikation, die das Protein derivatisiert.
Der hierbei verwendete Begriff „Steuerung“ bezieht sich auf eine Vorrichtungskomponente, die zum Steuern einer Vorrichtung oder eines Systems programmiert werden kann, wie in der Technik gut bekannt ist. Steuerungen können beispielsweise so programmiert werden, dass sie Massenspektrometersysteme wie hierbei beschrieben steuern. Steuerungen können beispielsweise zur Durchführung von lonenmanipulations- und Probenanalyseverfahren, wie hierbei beschrieben, an Systemen und Vorrichtungen, wie hierbei beschrieben, programmiert werden.
Der hierbei verwendete Begriff „fraktioniert“ oder „fraktionieren“ bezieht sich auf die physikalische Trennung einer Probe, wie in der Technik gut bekannt ist. Eine Probe kann gemäß physikalischen Eigenschaften wie unter anderem Masse, Länge oder Affinität zu einer anderen Verbindung unter Anwendung von chromatographischen Techniken, wie in der Technik gut bekannt, fraktioniert werden. Fraktionierung kann in einer Trennstufe erfolgen, bei der eine Probe von Interesse nach einer oder mehreren physikalischen Eigenschaften fraktioniert wird, wie in der Technik gut bekannt ist. Trennstufen können neben anderen Techniken flüssig- und gaschromatographische Techniken einsetzen. Trennstufen beinhalten z.B., aber ohne Begrenzung, Flüssigchromatographietrennsysteme, Gaschromatographietrennsysteme, Affinitätschromatographietrennsysteme und Kapillarelektrophorese-Trennsysteme.
BEISPIEL 1: EIN QUADRUPOL-ORBITRAP-MASSENSPEKTROMETER FÜR REPRODUZIERBARE PROTEOMIK MIT HOHEM DURCHSATZ
Hinweis: die Zahlen in Klammern beziehen sich auf die am Ende von BEISPIEL 1 aufgeführten Literaturquellen.
Der am weitesten verbreitete Ansatz in der Proteomik verbindet Schrotschuss-Identifizierungsverfahren mit einer Reihe verschiedener Quantifizierungsstrategien. Diese Technologien haben sich im Laufe der letzten 10 Jahre rasch entwickelt und die Quantifizierung von Tausenden von Proteinen in nur ein paar Tagen [1-8] ist heute eine Routineangelegenheit. Mit diesem Ansatz können zwar hohe Durchsätze erzielt werden, aber es fehlt ihm an Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit. Insbesondere ist eine komplette Abdeckung spezifischer Pfade oder funktioneller Gruppen nicht typisch (d.h. alle 500 Kinasen, 1400 Transkriptionsfaktoren usw.). Ebenso sind überlappende Identifizierungen in Replikatexperimenten gering (35-60 %) [9, 10]. Dieser Mangel an Vollständigkeit und Reproduzierbarkeit begrenzt die Anzahl und Qualität der biologischen Schlussfolgerungen, die aus einem proteomischen Experiment gezogen werden können. Diese Begrenzungen haben das jüngste Streben nach targetbasierten Verfahren, nämlich SRM (selektierte Reaktionsüberwachung), vorangetrieben [11-16]. SRM erzielt die Reproduzierbarkeit, die dem Schrotschussansatz fehlt, und kann die absolute Abundanz ermitteln, allerdings weist das Verfahren einen geringen Durchsatz und eine niedrige Auflösung auf, da es in erster Linie auf die Dreifach-Quadrupol-(QqQ)-MS-Plattform begrenzt ist [16-19]. Diese Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung schlägt die Konstruktion eines „Crossover“-Instruments - einer Quadrupol-Orbitrap-Hybride - vor, das die Empfindlichkeit und Wiederholbarkeit von SRM-Verfahren mit den hohen Durchsatzkapazitäten der Schrotschusstechnik kombiniert. Diese neue Hardware-Plattform wird mit neuartigen Datenerfassungsprogrammen gekoppelt, damit bis zu 1000 Genprodukte schnell und reproduzierbar mit einer Empfindlichkeit überwacht werden können, die genauso gut oder noch besser ist wie die von SRM-Verfahren des Standes der Technik. Diese Technologie ermöglicht beispielsweise die Analyse des mitochondrialen Proteoms (1098 Proteine), das für die menschliche Gesundheit von sehr hoher Bedeutung ist. Ziel ist es, die Veränderungen von mitochondrialen Proteinniveaus als Reaktion auf einen zellulären Eisenmangel, der weltweit am weitesten verbreitete Ernährungsstörung, vollständig und präzise zu überwachen [20].
Aufbau und Entwicklung eines Quadrupol-Orbitrap-Hybrid-Massenspektrometers (OrbiQ). Ein Thermo Scientific Exactive Orbitrap MS wurde so adaptiert, dass es einen hochauflösenden Quadrupol-Massenfilter enthielt. Das Instrument ist so ausgelegt, dass es beispiellose MS-Leistungszahlen liefert - z.B. eine Scan-Geschwindigkeit von 10 Hz bei einer Auflösungsleistung von 10.000, eine schnelle, effiziente hochauflösende Isolierungsfähigkeit (± 0,2 m/z), eine hohe Massengenauigkeit (< 5 ppm, externe Kalibrierung) und einen dynamischen Intrascan-Bereich von mehr als 15.000. Diese Merkmale ermöglichen eine Echtzeit-Target-Bestätigung (rtTC) sowie eine parallele Reaktionsüberwachung (PRM), nur einige von zahlreichen anderen hierbei offenbarten neuartigen Steuermerkmalen.
Implementierung eines neuen Massenspektrometer-Datenerfassungsfundaments - MaeStro. Die einzigartigen Fähigkeiten der OrbiQ-Hardware bereiten den Weg für die intelligente, gerichtete Datenerfassungslogik der nächsten Generation. Die Basis der Logik besteht darin, Echtzeit-Target-Bestätigung (rtTC) zu nutzen, um zu erfahren, welche der Targets detektiert wurden. Aufgrund dieser Kenntnis kann die Datenerfassung so organisiert werden, dass die gewünschten Leistungszahlen erhalten werden - die Fähigkeit, Gruppen von bis zu Tausenden von Proteinen mit hoher Reproduzierbarkeit (>95 %) und einer Empfindlichkeit zu targetieren und quantifizieren, die genauso gut oder noch besser ist wie die von derzeitigen gezielten SRM-Ansätzen. Das Analyseschema ist mit ,Feedback’ in der Elektronik analog, wo der Ausgang eines Geräts zum Modulieren des Eingangs verwendet wird, um den Ausgang weiter zu regulieren oder zu verändern.
Proteomische und transkriptomische Analysen einer mitochondrialen Adaption an Eisenmangel. Die neuen Fähigkeiten der OrbiQ-MaeStro-Plattformkönnen wirksam eingesetzt werden, um mit bisher nie dagewesener Präzision den Expressionsstatus der 1098 mitochondrialen Proteine über einen 48-stündigen Eisenentzug in kultivierten Skelettmuskelzellen zu überwachen. Zusätzlich können abgestimmte Mikroarray-Analysen bei allen Bedingungen durchgeführt werden. Dieser Ansatz kann (1) die Untersuchung des Ausmaßes ermöglichen, in dem das gesamte mitochondriale Proteom als Reaktion auf eine bedeutende physiologische Belastung umstrukturiert wird, und (2) ein Fundament zum Entschlüsseln der transkriptionalen und post-transkriptionalen Mechanismen bieten, die der Schlüssel zur mitochondrialen Adaption sind.
Proteomik. Die am weitesten verbreitete Technik in der Proteomik ist das Schrotschussverfahren. Proteine werden zu Peptiden verdaut, chromatographisch getrennt und mit Massenspektrometrie (MS) gemessen [21, 22]. Es werden viele Arten von Massenspektrometern verwendet - Quadrupol-Ionenfallen (QIT), QIT-Hybriden, wie z.B. Orbitrap oder LTQ-FT-ICR, und Quadrupol Time-of-Flight (Q-TOF)- aber die Experimente ab den MS-Messungen sind grundsätzlich dieselben. Die Masse-zu-Ladung-(m/z)-Werte von eluierenden Peptidkationen werden im MS¹-Scan gemessen. Dann werden die abundantesten Vorläufer für eine Reihe von sequentiellen Tandem-MS-Ereignissen (MS²) ausgewählt. Die Zahl dieser Ereignisse hängt von der Erfassungsrate der Vorrichtung ab, liegt aber im Allgemeinen im Bereich von 3 bis 15. Nach einem zweiten MS¹-Scan wird eine neue Gruppe von Targets ausgewählt. Der Prozess, der als datenabhängige Erfassung (DDA) bezeichnet wird, wird für die Dauer der chromatographischen Trennung fortgesetzt. Da sich dieses Verfahren in den letzten fünfzehn Jahren nicht geändert hat, kamen die Fortschritte von der konstanten Entwicklung der MS-Hardware. Im Laufe dieser Zeit haben sich signifikante Verbesserungen der wichtigsten Leistungszahlen wie Empfindlichkeit, Scan-Geschwindigkeit, Massengenauigkeit und Auflösung ergeben. Mit dem lonenfallen-Orbitrap-Hybridsystem können beispielsweise Messungen mit hoher Massengenauigkeit (<5 ppm) für sowohl MS¹ als auch MS² erzielt werden, mit einer hohen Empfindlichkeit bei Wiederholraten von ~4 Hz [23]. Ein konstanter Betrieb solcher Systeme ergibt Hunderttausende von Spektren innerhalb von Tagen. Diese Spektren werden dann mit hochentwickelten Datenbanksuchalgorithmen wie SEQUEST [24], MASCOT [25], OMSSA [26] und verschiedenen anderen auf eine Peptid- oder Proteinsequenz kartiert. Erfolgreiche Ergebnisse können innerhalb von nur ein paar Tagen an Instrumentanalysezeit erhalten werden und sind wirklich spektakulär: Zehntausende von eindeutigen Peptidspektralabgleichen kartiert auf mehrere tausend eindeutige Proteinisoformen sind zur Norm geworden. Und wenn man diese Verfahren mit isotopisch basierter Markierung koppelt, dann ist der dynamische Vergleich der Abundanzen dieser Proteine und Peptide über gestörte Zellen oder Gewebe möglich [27, 28].
Grenzen der derzeitigen Technologie. Nicht-Reproduzierbarkeit - die Identifizierung von statistisch signifikanten Differenzen bei Protein- oder PTM-Abundanz verlangt Reproduzierbarkeit. Eine geringe Reproduzierbarkeit ist ein weithin bekanntes Problem in der Proteomik und rührt von der stochastischen Natur des datenabhängigen Erfassungsparadigmas her [9, 29-31]. Es wird jedoch nur selten behandelt, da sich der Bereich hauptsächlich auf die Dokumentierung von immer größeren Protein- und PTM-Listen konzentriert hat. Eine kürzliche Interlaborstudie hat gezeigt, dass sich Peptidlisten von Paaren technischer Replikate nur um 35-60 % überlappten [10]. Diese Ergebnisse stimmen mit einer kürzlichen fünffach durchgeführten Analyse überein (1), wobei 3061 Proteine in wenigstens einem der fünf Schrotschuss-Experimente identifiziert wurden, aber nur 954 dieser Proteine in allen Replikaten beobachtet wurden. 1 zeigt diese Ergebnisse im Vergleich zu denen von den gepaarten transkriptomischen Messungen, die eine 95%ige Überlappung zwischen allen fünf Mikroarray-Assays zeigten (man beachte, dass nur Transkripte gezeigt werden, die den detektierten Proteinen entsprechen). Bei der proteomischen Arbeit wurde daher die statistische Leistung, die durch fünfmaliges Durchführen der Analyse hätte erzielt werden sollen, nur für ein Drittel der Proteine erzielt. Ferner waren die jeweils identifizierten Proteine die weniger interessanten, abundanteren Spezien≤.
2 zeigt die Notwendigkeit für Replikatmessungen. Im ersten Experiment wurde festgestellt, dass eine Phosphorylierungsstelle auf PAK1 um fast das 2,5fache hinaufreguliert war. Eine andere Stelle auf AKT-Substrat 1 zeigt eine nur etwa 1,3fache Veränderung. Fast alle komparativen proteomischen Experimente - selbst die, die in der höchsten Ebene veröffentlicht wurden - würden aus einer mehr als 2fachen Hinaufregulierung den Schluss ziehen, dass die PAK1-Stelle von Bedeutung ist, und sie für eine biologische Nachbeobachtung empfehlen. Dennoch wurde das Experiment an zwei zusätzlichen biologischen Replikaten durchgeführt und es wurde erkannt, dass die Signifikanz der PAK1-Stelle gering war (p ≤ 0,1), während die AKT-Substrat-1-Stelle beständig, wenn auch nur geringfügig, unterschiedlich war (p < 0,0005). Man ist der Ansicht, dass die proteomische Technologie den signifikanten biologischen und medizinischen Einfluss erst dann völlig realisieren wird, wenn sie routinemäßig eine Detektion und Quantifizierung derselben Protein-Subsets über mehrere Messungen erzielen kann.
Unfähigkeit, Proteintargets, und geringe Empfindlichkeit auszuwählen. Eine weitere Schwachstelle des Schrotschuss-Paradigmas ist die Unfähigkeit, spezifische Proteintargets auszuwählen, was zu Ergebnissen mit punktueller Abdeckung und geringerer Empfindlichkeit im Vergleich zu targetgesteuerten Verfahren führt. Zum Beispiel berichten die bisher umfangreichsten Studien lediglich über die Detektion von etwa der Hälfte der 500 Kinasen in menschlichen Zellen [32-35]. Kinasen regulieren die Zellfunktion und spielen eine besonders wichtige Rolle bei der Signaltransduktion und bei komplexen Funktionen wie dem Zellzyklus [36]. Und doch präsentiert die Schrotschuss-Proteomik Daten über mehrere tausend andere Proteine und wirft so ein großes, aber ungerichtetes Netz aus. In vielen, wenn nicht sogar den meisten Experimenten, wäre eine völlige Abdeckung der gewählten Pfadelemente oder funktionellen Proteingruppen weitaus wertvoller als eine zehn Mal größere Liste mit einer breiten und diffusen Abdeckung. Man stellte dann die Frage, wie viele Proteine targetiert werden müssen, um eine völlige Abdeckung der meisten biologischen Pfade zu erhalten. Zur Beantwortung dieser Frage wurden die 918 Gene-Ontology-(GO)-Kategorien [37] analysiert. Indem Genprodukte nach drei Domänen klassifiziert werden - zelluläre Komponente, molekulare Funktion und biologischer Prozess - tabelliert die Ontologie die Größe bekannter Proteingruppen und Pfadelemente. Anhand von 3 wurde der Schluss gezogen, dass praktisch alle GO-Gruppierungen weniger als 1000 Elemente enthalten (nur 20 sind größer). Somit wurde eine wesentliche Leistungszahl für diese Technologie festgelegt: die Fähigkeit, Gruppen von bis zu 1000 Proteinen mit hoher Reproduzierbarkeit (>95 %) und einer Empfindlichkeit zu targetieren und zu quantifizieren, die genauso gut oder noch besser ist wie die von derzeitigen modernsten gezielten SRM-Ansätzen gemäß dem Stand der Technik.
Selektierte Reaktionsüberwachung (SRM): eine imperfekte Lösung. Die Grenzen der Schrotschuss-Proteomik haben das jüngste Streben nach targetbasierten Verfahren vorangetrieben, bei denen anhand früherer Kenntnisse des Systems Kandidatproteine für Detektion und Abundanzmessung vorgewählt werden. Mit der am schnellsten wachsenden biologischen MS-Technik, SRM, kann die Reproduzierbarkeit erzielt werden, die im Schrotschuss-Ansatz fehlt. Mit ihr kann auch die absolute Abundanz ermittelt werden. Unter Ausnutzung der einzigartigen Fähigkeiten von Dreifach-Quadrupol-MS-Systemen (QqQ) wählt SRM vordefinierte Vorläufer aus und detektiert nacheinander deren Produkt-Ionen (5). Auf diese Weise kann das Verfahren die Empfindlichkeit für targetierte Peptide um Größenordnungen im Vergleich zu entdeckungsgesteuerten Scan-Methoden erhöhen. Das Interesse an QqQ-SRM-Verfahren für gezielte Proteomik ist in den letzten Jahren sprunghaft angestiegen. Dieser Trend veranschaulicht die angestiegene Bedeutung der Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit in proteomischen Experimenten.
Abgesehen davon gibt es viele Hindernisse, die eine weit verbreitete Nutzung von SRM-Technologien behindern. Das Experiment erfordert (1) ein QqQ-System, eine Hardware-Plattform, die im Vergleich zu den weiter verbreiteten Entdeckungsvorrichtungen sehr unterschiedlich ist, und (2) Spezialisten, sogar innerhalb von Fachlabors. Das Verfahren ist auch aufwändig. Da jeweils ein Kanal überwacht wird, ist eine parallele Detektion nicht möglich. Ferner kann die der Detektion mit dem QqQ-System innewohnende niedrige Auflösung Interferenzen verursachen, insbesondere bei niedrigen Signal-Rausch-Verhältnissen (S/N) [18, 19]. Schließlich hat das Verfahren einen bemerkenswert niedrigen Durchsatz: das Quantifizieren von nur ein paar Proteinen (weniger als 20) erfordert häufig einen Arbeitaufwand von mehreren Monaten. Die ideale Lösung kombiniert eine wenigstens 50fache Zunahme des Durchsatzes mit der derzeitigen Fähigkeit, gewählte Pfade mit hoher Reproduzierbarkeit zu targetieren.
Die OrbiQ-Hybride. 4 zeigt ein Schaubild der Quadrupol-Orbitrap-Hardware (OrbiQ). Die OrbiQ-Konfiguration ist eine Kreuzung zwischen der leistungsstarken LTQ-Orbitrap-Entdeckungsplattform und dem QqQ. Im Folgenden ist ausführlich beschrieben, wie diese Hardware-Anordnung bessere Leistung erbringen kann als ihre Vorgänger. Und während die physische Anordnung der Vorrichtung eine entscheidende Komponente beim Erzielen dieser Leistung ist, wird diese Technologie durch eine neue, äußerst innovative Instrumentensteuerlogik und Datenerfassungsstrategie (MaeStro) angetrieben.
Stärken der OrbiQ-Geometrie. OrbiQ hat eine Geometrie ähnlich der der derzeitigen handelsüblichen LTQ-Orbitrap; allerdings ist die lineare lonenfalle durch einen hochauflösenden Quadrupol-Massenfilter ersetzt. Aus einer solchen Anordnung ergeben sich mehrere Vorteile. Zunächst kann die Größe einer Vorläuferionenpopulation um wenigstens das 10fache erhöht werden, da die lonenfalle durch Raumladung mit großen lonenpopulationen nachteilig beeinflusst wird [38-42]. Die lineare lonenfalle isoliert zwar effizient Targets für kleine lonenpopulationen (z.B. < 100.000 Ladungen), aber sie kann keine größeren Populationen isolieren. Mit einem Quadrupol-Massen-Filter erfolgt die Isolierung in einem Transmissionsanstatt in einem Einfang-Modus, so dass ohne weiteres 1.000.000 Ladungen von jedem gewählten Vorläufer akkumuliert werden können. Zweitens können die Ladungen eines gewählten Vorläufers selbst in Anwesenheit von weitaus abundanteren Kontaminanten akkumuliert werden, weil der Massenfilter extrem hochauflösende Isolierungen durchführt: ~ 0,2 m/z, was etwa 10 Mal besser ist als das, was routinemäßig mit dem linearen lonenfallensystem erzielt wird. Wenn eine Spezies bei der Isolierung abundanter ist, wird mit lonenfallen das Reinigen einer ebenfalls anwesenden Komponente mit relativ geringer Konzentration - d.h. das Erzielen einer hohen Empfindlichkeit - problematisch.
OrbiQ, im Wesentlichen ein QqQ, bei dem Q3 durch eine Orbitrap ersetzt ist, verbessert auch die Auflösung im Vergleich zum standarmäßigen QqQ. Aus dieser Perspektive ist erkennbar, wie sich die Vorrichtung die selektierte Reaktionsüberwachung (SRM) QqQ zunutze macht, während Durchsatz, Massengenauigkeit und Auflösungsleistung erhöht werden. Aufgrund der inhärenten geringen Auflösung von QqQ muss jeder Vorläufer-zu-Produkt-Übergang unabhängig überwacht werden. Ferner geht das Erhöhen der Anzahl von überwachten Übergängen auf Kosten der Empfindlichkeit, da der Experimentator weniger Zeit pro Übergang verbringt. Mit der durch OrbiQ gegebenen hohen Auflösung lässt sich jedes Produkt-Ion leicht auflösen, so dass alle von einem Vorläufer erzeugten Produkt-Ionen gleichzeitig überwacht werden können (5). Es ist auch möglich, die von mehreren Vorläufern erzeugten Produkt-Ionen zu überwachen (5).
Zusätzlich ergibt eine parallele Reaktionsüberwachung (PRM) mit OrbiQ eine verbesserte Empfindlichkeit gegenüber SRM mit QqQ. 6 zeigt eine Empfindlichkeitsbeurteilung von SRM (QqQ) und PRM (OrbiQ). Ein komplexes Gemisch aus Hefepeptiden im Bereich von 20 bis 20.000 Attomol (amol) wurde mit mehreren synthetischen Peptiden gespickt. Die geringste detektierbare Menge jeder Peptidsequenz wird angezeigt. Mit PRM konnten Peptide in Mengen von nur 200 amol detektiert werden. Die geringste durch SRM detektierte Peptidmenge betrug 2 Femtomol (fmol). Dies repräsentiert eine Differenz von einer Größenordnung. Mit anderen Worten, mit der OrbiQ-Plattform wird eine parallele Reaktionsüberwachung (PRM) zur Realität, wobei die Nachteile des geringen Durchsatzes von SRM praktisch beseitigt werden.
Instrumentensteuerung und Datenerfassung. Die stochastische Natur der datenabhängigen Erfassung (DDA) ist eine zentrale Ursache für die Nicht-Reproduzierbarkeit in Schrotschusss-Experimenten [43]. Demzufolge ist ein bedeutender Faktor beim Entwurf der OrbiQ-Geometrie die Kompatibilität mit neuen und innovativen Datenerfassungsmethodiken. Im Laufe der vergangenen Jahre haben zahlreiche Gruppen DDA-Alternativen untersucht [11, 13, 14, 44-54]. Diese Arbeiten können in zwei Kategorien gruppiert werden: (1) datenunabhängig und (2) gezielt. Bei den datenunabhängigen Verfahren werden MS²-Scans nicht von den MS¹-Spektren ausgelöst; stattdessen werden feste Isolierungsbreiten, Aktivierungsparameter und Scan-Bereiche benutzt und über einen LC-Gradienten zyklisiert. Diese Strategie verbessert den dynamischen Bereich aufgrund von Gasphasenfraktionierung [55-57]. Darüber hinaus behebt sie die stochastische Natur des DDA-Verfahrens. Obwohl die Reproduzierbarkeit nicht ausgiebig verglichen wurde, weisen diese frühen Ergebnisse letztendlich auf starke Verbesserungen gegenüber DDA hin. Der Hauptnachteil der derzeitigen datenunabhängigen Implementierung ist ein 10-20facher Verlust an Durchsatz, da die Probe sehr oft analysiert werden muss, um den gesamten Vorläufermassenbereich abzudecken. Gezielte Ansätze beinhalten SRM sowie Einschluss/Ausschluss-Listen. Sowohl bei Einschluss als auch bei Ausschluss wird das Grundgerüst des DDA-Verfahrens verwendet. Beim Einschluss werden nur MS¹-Signale abgefragt, die in spezifische, vorgewählte m/z-Bereiche fallen; beim Ausschluss werden Merkmale, die in spezifische, vorgewählte m/z-Bereiche fallen, nicht abgefragt. Der Einschlusslistenansatz ergibt eine geringfügig verbesserte Reproduzierbarkeit (~60 %) dieser vorgewählten Peptide und kann die Empfindlichkeit erhöhen. Die Zahl der Gesamtidentifizierungen fällt jedoch im Vergleich zum DDA-Verfahren erheblich ab, weil nicht aufgeführte Merkmale ignoriert werden. Ferner ist die Empfindlichkeit ohne Gasphasenanreicherung für Listenverfahren geringer als bei einer datenunabhängigen Strategie.
Es wird hierbei ein neuer Datenerfassungs-/Instrumentensteuercode (MaeStro) offenbart, der auf dieser Thematik aufbaut (d.h. SRM, Einschluss/Ausschluss-Liste und datenunabhängig). Die einzigartigen Fähigkeiten der neuen OrbiQ-Hardware-Anordnung lassen eine signifikante Kreativität beim Abtastvorgang zu. Diese Hardware repräsentiert in Kombination mit dem innovativen MaeStro-Steuercode ein „Crossover“-Massenspektrometersystem, das die Lücke zwischen den groß angelegten Entdeckungs- und den gezielten Systemen mit niedrigem Durchsatz schließt. Eine solche Vorrichtung kann Fachlabors wie auch Nicht-Fachlabors eine wahrhaft hypothesegesteuerte Proteomik bieten.
Mitochondrien. Die hierbei beschriebenen Vorrichtungen und Verfahren können beispielsweise zum Betrachten mehrerer offener Fragen in der mitochondrialen Biologie der Säugetiere genutzt werden. Mitochondrien sind ubiquitäre Organellen, die für das Überleben von nahezu jeder eukaryotischen Zelle wesentlich sind. Sie sind zwar am besten für die ATP-Produktion über oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) bekannt, aber sie beherbergen auch eine Unzahl von anderen biochemischen Pfaden und sind Zentren für Apoptose und lonenhomöostase. Eine mitochondriale Dysfunktion verursacht mehr als 50 Krankheiten, von neonatalen Fatalitäten bis hin zur Neurodegeneration, die im Erwachsenenalter beginnt, und trägt wahrscheinlich zu Krebs und Diabetes Typ II bei [58-60]. Eine vom Co-Untersucher Pagliarini geleitete kürzliche Studie brachte ein Kompendium von 1098 mitochondrialen Säugetierproteinen über eine breite Palette von Geweben von gesunden Mäusen hervor [61]. Diese Arbeit gibt einen robusten und doch statischen Überblick über das mitochondriale Proteom. Ein wichtiger nächster Schritt besteht darin, die Veränderungen des mitochondrialen Proteoms zu erfassen, die bei akuten zellulären Belastungen sowie bei chronischen Erkrankungen unter Beteiligung einer mitochondrialen Dysfunktion auftreten.
Der zelluläre Prozess des Produzierens und Veränderns dieser Organellen - mitochondriale Biogenese genannt - ist äußerst kompliziert und beinhaltet das koordinierte Transkribieren, Translatieren und Zusammenfügen von mehr als 1000 Proteinen, die durch zwei Genome kodiert sind [61]. Eukaryotische Zellen haben die Fähigkeit, das mitochondriale Biogeneseprogramm spezifisch an ihre metabolischen Bedürfnisse anzupassen, und die Beweise verdichten sich, dass post-transkriptionale Mechanismen eine Schlüsselrolle bei der Regulierung des Ausmaßes und der Spezifität dieses Prozesses spielen. Beispielsweise sind eine translationale Steuerung durch stromaufwärtige offene Leseraster (uORFs) und submitochondriale Targetierung durch mRNA-Bindungsproteine für einige mitochondriale Gene wichtig [62-65]. Darüber hinaus ist die globale Korrelation zwischen Protein- und mRNA-Konzentrationen für mitochondriale Proteine recht dürftig, was darauf hinweist, dass viele andere post-transkriptionale Mechanismen auf ihre Entdeckung warten [66].
Die hier beschriebene Technologie hat ein revolutionäres Potential für die Weiterentwicklung des Verständnisses der mitochondrialen Biogenese und Regulierung, da sie eine vollständige und präzise Überwachung von Veränderungen der mitochondrialen Proteinkonzentrationen als Reaktion auf physiologische Belastungen zulässt. Ein besonderer Schwerpunkt kann dabei auf die Überwachung dieser Veränderung bei Eisenmangel in Skelettmuskelzellen gelegt werden. Diese physiologische Belastung wurde aus drei Hauptgründen gewählt: 1) Eisenmangel ist die weltweit am häufigsten vorkommende Ernährungsstörung [20], 2) diese Belastung ist für die mitochondriale Funktion besonders schädlich, bei der Eisen ein wesentlicher Cofaktor für eine Reihe von Stoffwechselpfaden ist, und 3) es ist allgemein bekannt, dass Veränderungen der Eisenkonzentrationen eine post-transkriptionale Regulierung der zellulären Genexpression induzieren [67, 68]. Der wesentliche Mechanismus beinhaltet die Verwendung von mRNA-Bindungsproteinen, die unter Eisenmangelzuständen aktiv werden. Nach der Aktivierung binden sich diese Proteine an spezifische mRNA-Motive, was zu Veränderungen der mRNA-Stabilität oder Translationsrate führt [67].
Daten legen den Schluss nahe, dass eine Reihe von gewählten mitochondrialen Proteinen post-transkriptional nach akutem Eisenstress durch einen Mechanismus reguliert werden, der durchaus ein ähnlicher eisenregulierter Mechanismus ist (7). Es wird vermutet, dass ein großer Teil des restlichen mitochondrialen Proteoms auf ähnliche Weise beeinflusst wird; dies wurde jedoch noch nie in einem Großversuch getestet. Durch Verwenden der OrbiQ-MaeStro-Plattform und abgestimmter Mikroarray-Analysen können Veränderungen der Proteine und Pfade verdeutlicht werden, die der mitochondrialen Adaption an Eisenmangel zugrunde liegen, und, allgemeiner, es kann ein Rahmen zur Identifizierung von post-transkriptionalen Mechanismen bereitgestellt werden, die das mitochondriale Biogeneseprogramm antreiben.
Ein Quadrupol-Orbitrap-Hybrid-MS-System (OrbiQ). Dieses einzigartige „Crossover“-Massenspektrometer kann die hohe Selektivität bieten, die derzeit nur mit einer QqQ-Ausrüstung im SRM-Modus erzielt wird. OrbiQ kann jedoch eine hohe Scan-Geschwindigkeit (10 Hz), hohe Auflösung (> 10.000) und hohe Massengenauigkeit (<5 ppm, externe Kalibrierung, MS¹ und MS²) liefern. Diese außerordentlichen Leistungszahlen ermöglichen gezielte Experimente mit hohem Durchsatz, da zahlreiche neue Erfassungsstrategien möglich werden.
Parallele Reaktionsüberwachung (PRM). Dieses Konzept wird durch das hochauflösende Orbitrap-Analysegerät ermöglicht und kann Abhilfe für das Problem des extrem niedrigen Durchsatzes von SRM schaffen. Die hohe Auflösungsleistung des Orbitrap-Analysegeräts macht das Unterscheiden zwischen Targetprodukt-Ionen und Kontaminanten zu einer unkomplizierten Angelegenheit. Hierbei präsentierte Daten demonstrieren dieses Konzept. Die wesentliche Frage ist die, wie die Empfindlichkeit von OrbiQ PRM im Vergleich zu QqQ SRM abschneidet. Den derzeitigen Berechnungen und Daten zufolge kann sie besser sein.
Echtzeit-Targetbestätigung (rtTC). Durch Bestätigen der Detektion eines Targets während der Analyse wird der Weg für die nächste Generation der MS-Datenerfassung bereitet - dies ist eine äußerst befähigende und aufregende Innovation. Das rtTC-Verfahren wurde auf einem existierenden Velos-Orbitrap-MS (hierbei näher beschrieben) implementiert.
MaeStro-Steuerlogik. Diese Datenerfassungsansätze können die proteomische Landschaft neu gestalten, indem sie ein direktes und einfaches Mittel zum reproduzierbaren Überwachen großer Proteinnetzwerke und -pfade (z.B. bis zu 1000) mit beispielloser Empfindlichkeit bieten. Es wurden Versionen beider MaeStro-Algorithmen auf einem existierenden Velos-Orbitrap-MS (hierbei näher beschrieben) implementiert. Die Scan-Geschwindigkeit des OrbiQ führt zu einer etwa dreifachen Durchsatzerhöhung. Zusätzliche Verfahren beinhalten die Nutzung von Retentionsreihenfolgegruppierung, Fraktionierung und Peptidspektralbibliotheken für die Targetvorhersage (z.B. PeptideAtlas). Dies kann zu einer etwa 10fachen Erhöhung der Targetkapazität führen, um mehrere Peptide von jedem der 1000 Proteintargets in einem einzigen Experiment ohne weiteres zu detektieren.
Eine dynamische Karte der mitochondrialen Adaption an wesentlichen physiologischen Stress. Zum ersten Mal können mit der Zeit erfolgende Veränderungen des gesamten mitochondrialen Proteoms von Zellen mit Eisenmangel nachgewiesen werden. Durch das Integrieren dieser Daten in passende Mikroarray-Daten kann ein robustes Fundament zur Verdeutlichung von sowohl den metabolischen Veränderungen, die bei der Eisenchelation in dieser Organelle auftreten, als auch den diese Veränderungen antreibenden Mechanismen bereitgestellt werden. Einen Datensatz dieser Tiefe und Deutlichkeit hat es bisher für Mitochondrien oder für irgendein System von vergleichbarer Größe und Komplexität nicht gegeben.
Ein Quadrupol-Orbitrap-Hybrid-MS (OrbiQ). In einer Ausgestaltung kann das OrbiQ-Hybridsystem auf dem neu eingeführten Thermo Scientific Exactive Benchtop Orbitrap-System aufgebaut werden. Das Exactive-System umfasst einen lonentrichter-AP-Einlass, einen Transfer-Multipol, eine c-Falle, eine Stoßzelle und ein Orbitrap-Analysegerät. Das System ist nominell für ein LC/MS-Kleinmolekül-Screening ausgelegt und bietet die ideale Plattform für OrbiQ. Erstens erzielt es die gewünschte Auflösung und Massengenauigkeit (siehe 8), um die hierbei beschriebenen innovativen Instrumentensteuertechnologien zuzulassen. Zweitens kann es eine Scan-Geschwindigkeit von 10 Hz erzielen, etwa das 3fache von der der Velos Orbitrap. Drittens ist die Modifikation des Systems zum Ersetzen des Transfer-Multipols durch ein auflösendes Quadrupol eine einfache Angelegenheit. 4 präsentiert ein Schaubild des Exactive-Instruments und der Modifikationen.
Die primäre Modifikation ist der Zusatz eines hochauflösenden Massenfilters, das die Vorläuferisolierungsfähigkeiten eines modernen QqQ MS bietet. Mit einem Massenfilter anstatt einer linearen lonenfalle werden der lonendurchsatz und die Isolierungstreue erhöht. Ersterer führt zu einem höheren Arbeitszyklus und letzere ermöglicht die Isolierung von Vorläufern unabhängig von lonenzahl oder benachbarten Interferenzen. Wie hierbei beschrieben, kommt es bei lonenfallen oft zu Problemen mit der Isolierungstreue aufgrund ihrer begrenzten Ladungsraumkapazität [38-42]. Es kann ein Quadrupol-Stabsatz vom Thermo Scientific TSQ Quantum MS-System verwendet werden. Das Massenfilter hat währe hyperbolische Stäbe mit r₀ = 6 mm und eine Länge von 250 mm. Länge und Gesamtdesign bieten eine ausgezeichnete Auflösung (~±0,2 m/z Isolierungsbreiten); für ihre Aufnahme muss jedoch die existierende Vakuumkammer vergrößert werden.
Die Exactive-Plattform enthält nicht die elektronische Schaltung zum Ansteuern eines Massenfilters. Das System hat jedoch 4 Reserve-Digital-Analog-Wandler (DACs). Eine Stromversorgung kann die RF-Wellenformen, den Auflösungsgleichstrom und den Verschiebungsgleichstrom liefern, die/der zum Ansteuern des Quadrupols benötigt werden/wird. Diese Stromversorgung ermöglicht alle Spannungen zum Scannen eines Massenbereichs von 50 bis 2000 m/z mit einer Auflösung von besser als eins. Drei Analogeingänge zusammen mit einem Digitaleingang können die Stromversorgung steuern (und somit das Massenfilter). Diese Eingänge können mit den Reserve-DACs des Exactive verbunden werden, um eine komplette und integrierte Kontrolle des Massenfilters zu ermöglichen. Durch den Instrumentensteuercode (ITCL) können die DACs zum Regulieren der Massenauswahl, der Auflösungsleistung und der Gleichstromverschiebung eingestellt werden. Der vierte DAC kann den Betrieb des Massenfilters im Nur-RF- oder im Massenauflösungsmodus ermöglichen. Ein Betrieb im Nur-RF-Modus ermöglicht das Sammeln von MS¹-Scans im Orbitrap. Die ITCL-Steuerung kann das Instrument vielseitig machen und zu automatisierten Experimenten befähigen.
Erzielen der höchsten Leistung vom OrbiQ erfordert jedoch neue Datenerfassungsstrategien. 8 umreißt Leistungszahlen auf der Basis der bekannten Fähigkeiten jeder Komponente und des Betriebs in einem gezielten SRM-Modus. Die Leistung im SRM-Modus kann die der modernsten QqQ-Experimente erreichen oder sogar übertreffen. Diese Schlussfolgerung ist möglicherweise nicht sofort offensichtlich, da eine Detektion auf der Basis von Elektronenvervielfachern (im QqQ benutzt) inhärent empfindlicher ist als Bildstromschemata (Orbitraps). In der Tat ist eine etwa 5 bis 10fache Differenz der Empfindlichkeit zwischen der Detektion auf der Basis von Elektronenvervielfachern und Orbitrap möglich.
Stark verbesserte Massenauflösung und -genauigkeit sind die Antwort. Eine solche Auflösung bietet die Möglichkeit, alle von einem bestimmten Vorläufer erzeugten Fragmente parallel zu überwachen (parallele Reaktionsüberwachung, PRM), was die Signalintensität wiederum erheblich erhöht. Man nehme beispielsweise ein Assay, bei dem 6 Übergänge in einem SRM-QqQ-Experiment targetiert werden. Wenn 50 ms für jeden Übergang gebraucht werden, dann beträgt die Gesamtüberwachungszeit 300 ms. OrbiQ PRM kann alle 6, plus eventuell weitere produzierte Fragmente, auf einmal überwachen. Innerhalb derselben 300 ms hat OrbiQ dann eine 6 Mal längere Injektionszeit: jedes individuelle Fragment hat eine rohe Signalintensität, die 6 Mal höher ist als die, die von QqQ bereitgestellt wird. Ferner erzeugt jeder Vorläufer durchschnittlich 12,8 Fragmente (Trypsin, n=9437): der OrbiQ-Ansatz detektiert wenigstens das Zweifache der Zahl möglicher Fragmente pro Vorläufer im Vergleich zum typischen SRM-Ansatz. Auf diese Weise führt die durch OrbiQ erzielte Massenauflösung und - genauigkeit zu weitaus höheren Gewinnen bei der Detektion und Quantifizierung von Vorläufern, die auf niedrigem Abundanzniveau in komplexen Matrizen vorliegen.
OrbiQ-Test/Validierung. Zunächst können Standards (keine Chromatographie) benutzt werden, um lonentransmission und die Auswirkungen von RF-Amplitude und Gleichstromverschiebungen verschiedener lonenoptik sorgfältig zu beurteilen. Wenn dies einmal verstanden ist, besteht der nächste Schritt in einer sorgfältigen Charakterisierung und Kalibrierung der lonenstabilität im hochauflösenden Quadrupol-Massenfilter. Es ist sorgfältig darauf zu achten, dass der Kompromiss zwischen Isolierungsauflösung und -effizienz verstanden wird. Nachdem diese fundamentale Leistungsmetrik festgelegt wurde, kann Funktionalität auf höherer Ebene, z.B. eine prädiktive automatische Verstärkungsregelung (pAGC), standardmäßige datenabhängige Erfassung, standardmäßige SRM-Verfahren usw., hinzugefügt werden. Eine Festlegung dieser Grundmerkmale ermöglicht einen direkten Vergleich des neuen OrbiQ mit (1) Velos Orbitrap für Schrotschuss-Proteomik und (2) QqQ für gezielte SRM-Experimente. Eine Benchmark-Leistung kann auf fraktioniertem Ganzzellen-Hefelysat im standardmäßigen Schrotschuss-Assay gestützt werden [3, 69, 75-86]. Es können Dutzende von Hefeproteinen über den dynamischen Bereich mit isotopisch markierten Standards durch SRM auf einem QqQ quantifiziert werden [45].
Implementierung eines neuen Massenspektrometer-Datenerfassungsfundaments - MaeStro. Obwohl es sich hier bereits um einen Hardware-Fortschritt an sich handelt, bietet das Koppeln der ursprünglichen OrbiQ-Technologie mit den herkömmlichen DDA- oder gezielten SRM-Erfassungsmodi nur bescheidene Verbesserungen gegenüber derzeitigen hochmodernen Plattformen. Die Leistung kann unter diesen Bedingungen hinter unserer wesentlichen Leistungszahl zurückbleiben: die Fähigkeit, Gruppen von bis zu 1000 Proteinen mit hoher Reproduzierbarkeit (>95 %) und Empfindlichkeit zu targetieren oder zu quantifizieren, die genauso gut oder noch besser ist wie die von derzeitigen gezielten SRM-Ansätzen. Die einzigartigen Fähigkeiten der Hardware - hohe Massengenauigkeit und Auflösung, Empfindlichkeit und hohe Scan-Geschwindigkeit (10 Hz) - bereiten den Weg für die nächste Generation von intelligenter, gerichteter Datenerfassungslogik.
Instrumentensteuerung. Für das Weggehen vom DDA-Ansatz in Richtung auf einen SRM-artigen gezielten Ansatz, werden sowohl Einschlusslisten als auch SRM-Strategien verwendet, um darauf aufzubauen. Der erste Schritt besteht darin, die Gültigkeit der Echtzeit-Targetbestätigung (rtTC) zu bestätigen. Wenn bekannt ist, welche der 1000 Targets detektiert wurden, kann die Datenerfassung so koordiniert werden, dass die gewünschten Leistungszahlen geliefert werden. Dieses Analyseschema ist mit ,Feedback’ in der Elektronik analog, wo der Ausgang eines Geräts zum Modulieren des Eingangs verwendet wird, um den Ausgang weiter zu regulieren oder zu verändern.
Das rtTC-Verfahren ist möglicherweise auf die hohe Massengenauigkeit und Auflösung zurückzuführen, die mit dem Orbitrap-Analysegerät möglich wird. Man betrachte zum Beispiel einen Isolierungsbereich von 400,0-403,0 m/z. Nach einem tryptischen in silico-Verdau der 1098 mitochondrialen Proteine fallen -17.000 Peptidkandidatsequenzen in diesen Bereich. Zunächst werden die meisten dieser Kandidaten eliminiert, weil nur drei oder vier Peptide von jedem Protein von Interesse sind. Wenn nur nach drei Peptiden pro Protein gesucht wird, dann brauchen nur 45 Kandidattargetsequenzen für diesen Vorläufer-m/z-Bereich betrachtet zu werden. Und hier kommt dann die genaue Massenmessung des Orbitrap wirklich zum Tragen. Das rtTC-Verfahren beinhaltet ein einfaches Peptidspektralabgleich-(PSM)-Bewertungsmodell auf der Basis der Zahl theoretischer Fragmentpeaks, gegen die innerhalb einer sehr engen Produkt-m/z-Toleranz abgeglichen wurde (z.B. < 0,01 Th). Die Auswirkung der Massentoleranz auf Peptidspektralabgleiche (PSM) wurde mit einem einfachen Bewertungsmodell anhand eines Datensatzes untersucht, der auf einer Velos Orbitrap gesammelt wurde. Diese Daten zeigen, dass mit abnehmender m/z-Toleranz die durchschnittliche Zahl der Peptidfragmentabgleiche, die zum Beibehalten einer 1 % FDR nötig sind (über eine Umkehr-Decoy-Strategie [87]), stark reduziert wird. Man ist der Ansicht, dass rtTC (1) möglich ist, wenn eine ausreichende Massengenauigkeit vorliegt, und (2) zweckmäßig ist, da nur ein paar Kandidatsequenzen nach jedem MS²-Ereignis betrachtet zu werden brauchen.
Als Nächstes wurde rtTC in die ITCL-Steuersoftware eines Velos Orbitrap MS implantiert. Vor der Analyse wurde eine Liste von -1300 targetierten Peptidsequenzen und deren entsprechenden Vorläufer- und Produkt-Ionen-m/z-Werten in die Steuer-Firmware des Instruments geladen. Jeder im hochauflösenden MS¹-Scan detektierte targetierte Vorläufer-m/z-Peak wurde für eine hochauflösende MS² ausgewählt (standardmäßiger Einschlusslistenbetrieb). Unmittelbar nach dem MS²-Scan vergleicht die Instrumenten-Firmware die m/z-Peaks mit der theoretischen Produkt-Ionenliste (-1 ms pro Scan). Bei diesen Kontrollexperimenten tabellierte das Instrument die Zahl der abgeglichenen Fragmente einfach, anstatt Entscheidungen auf der Basis von abgeglichenen Produkt-Ionen zu treffen. Für ein gegebenes Target wurde die vorhergesagte Sequenz mit der Sequenz verglichen, die über eine traditionelle Nacherfassungs-Gesamtproteom-Datenbanksuche ermittelt wurde. 9 zeigt einen Plot der Übereinstimmungsrate zwischen diesen beiden Sequenzen in Abhängigkeit von den bei der rtTC abgeglichenen Fragmenten. Etwa 99 % der rtTC-Targetdetektionen (≥ 5 abgeglichene Produkte) stimmen mit der Nacherfassungssuche überein.
MaeStro 1: Gerichtete Datenerfassung durch MS¹-Detektion. MaeStro1 ist ein gerichteter Datenerfassungsansatz, der auf der Detektion von targetierten Peptidvorläufern nach einer MS¹-Analyse beruht. Zu Beginn wird auf dem etablierten, aber nicht weithin eingesetzten, Einschlusslistenkonzept aufgebaut. Dieses Verfahren akzeptiert eine statische Liste von Vorläufer-m/z-Targets, die bei Detektion für MS² targetiert werden. Targets, die in dieser Ausgestaltung niemals aus der Liste herausgenommen werden, werden so oft analysiert, wie es einen passenden Vorläuferpeak gibt. Zum Erforschen dieses Verfahrens wurde ein standardmäßiger DDA-Ansatz zum dreifachen Analysieren eines mit Trypsin verdauten Hefeproteinlysats angewendet. Von den insgesamt 7907 identifizierten eindeutigen Peptiden wurden in allen drei Experimenten nur 3684 Peptide beobachtet.
Dann wurden 1328 der 2400 Peptide, die nur in einem der drei Replikate detektiert wurden, ausgewählt, indem Peptide, die mit variablen Modifikationen identifiziert wurden, I/L homologe Sequenzen usw. entfernt wurden. Diese Einzelreplikatpeptide (SRPs) wurden zum Ermitteln des Arbeitszyklus und der Erfolgsrate des standardmäßigen Einschlusslistenansatzes verwendet. Über einen zweistündigen LC-Gradienten unternahm die Einschlussliste 7512 MS²-Versuche, wobei nur 600 der 1328 eindeutigen Peptidtargets erfolgreich auf die Sequenz kartiert wurden (1 % FDR). Da jedes Target zu ~7 MS²-Versuchen führte, ist die Zahl der Targets, die eingeschlossen werden können, begrenzt. Einige der Targets wurden mehr als 200 Mal gewählt. Aufgrund dieser Schwächen kann das Ziel, bis zu 1000 vorgewählte Proteine zu identifizieren, nicht erreicht werden. Dazu müssten wenigstens 3000 eindeutige Peptide (3 Peptide pro Protein) detektiert werden. Ohne ein iteratives Analyseschema, bei dem die detektierten Targets von einem Durchlauf entfernt und neue hinzugefügt werden, hat der standardmäßige Einschlusslistenansatz nicht den notwendigen Durchsatz.
MaeStro1 ist zur Lösung dieses Problems vorgesehen. Die Steuerlogik ist so konstruiert, dass eine große Zahl von Targets in einem einzigen Experiment verfolgt wird. Die Lösung besteht darin, die Zahl der erfolglosen MS²-Versuche zu reduzieren. Hier kann durch Implementieren von rtTC die Entfernung von bestätigten Targets aus der Liste sofort erfolgen. Die Implementierung dieses Ansatzes an derselben Probe führte zur Erzeugung von nur 3121 MS²-Ereignissen und 800 detektierten Targets: es wurden pro Target nur ~3 MS²-Versuche unternommen, und doch wurde die Zahl der detektierten Targets um 33 % erhöht. Dieser Gewinn ergibt sich aus der Detektion von Targets mit niedrigerem Signal, die mit fortschreitendem Durchlauf identifiziert werden, nachdem der rtTC-Algorithmus positiv detektierte Targets von höherer Abundanz entfernt hat.
Zu wissen, wann nach einem Target in einem LC-Gradienten zu suchen ist, führt zu einer weiteren erheblichen Erhöhung von Erfolgsrate, Empfindlichkeit und Arbeitszyklus [88]. Die Retentionszeit korreliert linear mit dem Hydrophobizitätsfaktor (offline mit SSRCalc berechnet [89]), aber die genaue Beziehung kann leicht von einem Durchlauf zum nächsten variieren. Hier wird ein neuartiges Verfahren zur Target-Planung durch Verwenden von rtTC offenbart. Insbesondere wird die relative Hydrophobizitätsreihenfolge (RHO) von in Echtzeit detektierten Peptidzahlen genutzt, um zu ermitteln, welche Targets wahrscheinlich als Nächstes erscheinen werden. Anstelle der Retentionszeit, die in SRM-Verfahren häufig genutzt wird, wird RHO verwendet. Indem die Planung relativ zu den zuvor detektierten Peptiden erfolgt, ist eine absolute Kalibrierung der Retentionszeit nicht notwendig und Variationen von Durchlauf zu Durchlauf lassen sich leicht berücksichtigen. Die Scan-Zahl wird mit dem Hydrophobizitätsfaktorindex (HFI) für die 800 mit MaeStro1 detektierten Targets von den hierbei beschriebenen SRPs verglichen. Es besteht ein starker Zusammenhang zwischen Scan-Zahl und HFI. Die nächste Frage ist die Validität der Verwendung der RHO von zuvor mit rtTC detektierten Targets als prädiktive Maßnahme. 10 zeigt einen Plot der Differenz zwischen der RHO eines detektierten Peptidtargets und der durchschnittlichen RHO der fünf zuvor mit rtTC detektierten Targets. Selbst bei diesem rudimentären Ansatz können Vorhersagen innerhalb von +/- 200 RHO-Einheiten gemacht werden, was bedeutet, dass die Zahl der Targets ohne weitere Optimierung auf etwa ein Drittel der Gesamtzahl reduziert werden kann (d.h. eine Targetliste von 1300 kann jederzeit auf ~400 gekürzt werden). Durch Verwenden komplexerer Algorithmen für Echtzeit-RHO-Berechnungen kann die Vorhersageleistung auf +/- 100 RHO-Einheiten erhöht werden.
Das übergreifende Ziel der MaeStro1-Logik besteht darin, die Zahl der erfolglosen MS²-Ereignisse zu reduzieren, so dass die Größe der Einschlussliste bis zu 1000 oder mehr Proteingruppen aufnehmen kann. Es wurde gezeigt, dass der Durchsatz durch Einbeziehen von rtTC um das 2fache erhöht werden kann. Eine Echtzeit-RHO-Planung kann eine weitere 3fache Erhöhung oder darüber liefern. Schließlich ergibt die OrbiQ-Hardware selbst eine weitere 3fache Verbesserung des Arbeitszyklus (d.h. 10 Hz Erfassungsrate) gegenüber den vorläufigen Daten, die auf einem Velos Orbitrap erfasst wurden, der mit ~3 Hz arbeitet.
MaeStro2: Gerichtete Datenerfassung durch MS²-Detektion. Während MaeStro1 die Reproduzierbarkeit eines proteomischen Experiments erhöht, geschieht dies mit ähnlicher Empfindlichkeit wie beim derzeitigen Schrotschuss-Ansatz. Dies ist darauf zurückzuführen, dass beobachtet werden muss, dass in MS¹ ein Signal MS² auslöst. Von Proteinen mit geringer Abundanz erzeugte Peptide werden oft von den Tausenden von anderen Peptiden verdeckt, die mit weitaus höheren Abundanzen vorliegen [9, 29-31]. Die endgültige Proteindetektionsempfindlichkeit wird mit Hilfe von SRM-Strategien erzielt, wobei MS²-Scans unabhängig davon durchgeführt werden, ob ein Vorläufer-MS¹-Signal existiert. Indem nur der enge m/z-Bereich zugelassen wird, den der Vorläufer von Interesse einnimmt, wird das resultierende Spektrum für diese Spezien stark angereichert. 100fache Zunahmen an Empfindlichkeit sind für SRM-Ansätze typisch; allerdings leiden die Verfahren unter einem äußerst niedrigen Arbeitszyklus, der ihre Anwendung für Experimente mit hohem Durchsatz ausschließt. Es wird bemerkt, dass viele der Proteine in einer/einem gegebenen Gene-Ontology-Gruppe oder -Netzwerk wahrscheinlich auf niedrigem Niveau vorliegen. Um das Ziel des reproduzierbaren Detektierens solcher Gruppen zu erreichen, müssen Geschwindigkeit und Durchsatz von SRM-Experimenten weiterentwickelt werden. Ein solches Erfassungsverfahren-MaeStro2 - wird hierbei für die Verwendung in Kombination mit oder unabhängig von MaeStro1 offenbart.
MaeStro2 nutzt die hohe Scan-Geschwindigkeit und Massengenauigkeit der OrbiQ-Hardware, um herkömmliches SRM im großen Stil zu expandieren. Die hohe Auflösungsleistung von OrbiQ ermöglicht die gleichzeitige Erfassung aller Produkt-Ionenübergänge von einem oder mehreren Targetvorläufern in einem Ansatz, genannt parallele Reaktionsüberwachung (PRM). Man betrachte wiederum die 1098 mitochondrialen Proteintargets, die oben erörtert wurden. Tryptische Verdauung produziert 65.033 theoretische Peptide. Ziel ist es, wenigstens drei eindeutige Peptide von jedem dieser Proteine zu detektieren. Unter der Annahme, dass diese Peptide einen Vorläufer-m/z-Bereich von 1500 Th einnehmen, müssten 500 3-Th-Bins gescannt werden, um eine Chance zu haben sie alle zu sehen. Mehrere Gruppen haben diese Art von Ansatz beschrieben, der als datenunabhängige Analyse (DIA) bezeichnet wird [48, 49, 57]. Selbst bei der Scan-Geschwindigkeit des OrbiQ von 10 Hz müsste jedes Experiment 10-20 Mal durchgeführt werden, um den m/z-Bereich nur einmal abzudecken, unter der Annahme, dass jeder Bereich alle 3 bis 5 Sekunden abgetastet wird, um keine chromatographischen Elutionsprofile zu verpassen. MacCoss, Goodlett und andere haben gezeigt, dass DIA sowohl die Empfindlichkeit als auch die Reproduzierbarkeit verbessert; es sind jedoch eine enorme Menge an Instrumentenanalysen und, was noch schlimmer ist, enorme Probenmengen erforderlich, die häufig nicht zur Verfügung stehen [48, 49].
MaeStro2 vereinigt die SRM- und DIA-Methodiken. Zunächst werden alle 65.003 Kandidatpeptidtargets in definierte m/z-Bins (Kanäle) gruppiert. Die Kanäle werden dann untersucht, um die geringstmögliche wählbare Zahl zu ermitteln, die ein, zwei, drei oder vier repräsentative Peptide pro Protein enthält. Das Konzept besteht darin, nur die geringste Zahl an Isolierungsbereichen auszuwählen, die repräsentative Peptidtargets aller gewählten Proteine enthalten. 11 zeigt eine Berechnung der Zahl der Kanäle, die zum Repräsentieren verschiedener Zahlen von Targetproteinen für eine Kanalbreite von 3 m/z benötigt werden. Anhand dieser Daten wurde beobachtet, dass äußerst empfindliche SRM-Analysen an wenigstens 4 eindeutigen Peptiden von jedem der ca. 1000 mitochrondrialen Proteine durchgeführt werden können, indem nur 40 diskrete Kanäle überwacht werden. Diese Art von Hochdurchsatz-SRM-Experiment wird durch die hierbei beschriebene OrbiQ-Hardware auf einzigartige Weise ermöglicht. Mit einer statischen Verweilzeit von 100 ms können 10 Kanäle pro Sekunde mit einer Auflösungsleistung von 10.000 überwacht werden. Dies bedeutet, dass der Zyklus alle 4 Sekunden komplett ist und dass Peaks mehrere Male über ihr Elutionsprofil ausgewählt werden. Es ist zu bemerken, dass ähnliche Berechnungen mit verschiedenen anderen Proteingruppen durchgeführt wurden und ähnliche Zahlen von benötigten Kanälen erzielt wurden.
Die Durchführung dieser Berechnungen mit allen Kandidatpeptiden führt zu einem potentiellen Problem: der Notwendigkeit für mehr Kanäle als das obige Modell vorhersagt. Dieses Problem könnte die Zahl der Proteine verringern, die MaeStro2 targetieren kann. Eine umfangreiche vorherige Untersuchung in SRM zeigt, dass der Erfolg von der Peptidtargetauswahl abhängt; bestimmte Peptide werden häufig detektiert, während andere von demselben Protein möglicherweise niemals beobachtet wurden. Als Reaktion auf dieses potentielle Problem wurde untersucht, wie viele der 1098 mitochondrialen Proteine bereits durch MS kartiert wurden. Beim Kombinieren von mehreren Peptiddatenbanken wurden 17.491 Peptide von 959 dieser Targets für durchschnittlich 16,85 Peptide/Proteine beobachtet. Dies bedeutet, dass mehr als 90 % der zu targetierenden gewünschten Proteine zuvor beobachtet wurden. Für die übrigen 118 werden Kandidatpeptidtargets durch eine Eignungsbewertung rangmäßig eingeordnet (PeptideAtlas, Details hierbei beschrieben). Auch der rtTC-Detektionsalgorithmus und die Hydrophobizitätsberechnungen wie oben aufgeführt (RHO) sind eingeschlossen. Wenn rtTC Targetpeptide bestätigt, können neue Kanäle eingeschlossen werden und die, die ausgeschöpft sind, können entfernt werden. Kanäle können auch durch einen zusammengesetzten RHO-Score gruppiert werden, so dass die Kanäle, die mit der größten Wahrscheinlichkeit detektierte Targets produzieren, immer dynamisch im Spiel sind. Alle Berechnungen wurden mit einem 3-m/z-Bin durchgeführt. Die Erhöhung der Bin-Breite, um eine höhere Bandbreite zu ermöglichen, kann auf Kosten der Empfindlichkeit gehen.
Straffen der proteotypischen Peptidauswahl für MaeStro1 und MaeStro2. Die Aebersold-Gruppe verwaltet eine Datenbank namens PeptideAtlas zum Organisieren von Peptiden von einem gegebenen Protein, die mit höchster Wahrscheinlichkeit beobachtet werden [91]. Die Daten können in eine mit PeptideAtlas kompatible Form gebracht werden [91]. Zur Planung von MaeStro-gerichteten Studien wird eine Targetproteinliste importiert und jedem vorhergesagten Peptid wird eine Eignungsbewertung (Score) zugeordnet. Für nicht in der Datenbank enthaltene Peptide werden Scores mit Algorithmen vorhergesagt, die in PeptideAtlas und anderen bereits existieren [92-96]. Für MaeStro1 wird die direkte Rangordnung zum Wählen von Targets verwendet. Für MaeStro2 wird die direkte Rangordnung als zusätzlicher Faktor bei der m/z-Bin-Auswahl verwendet.
Reproduzierbarkeit. Eine Hauptmotivation für die Instrumentierung besteht darin, proteomische Reproduzierbarkeit zu erreichen, die im Einklang mit Transkriptomik steht (1). Diese Nicht-Reproduzierbarkeit ist auf DDA zurückzuführen. Kürzliche mehrfache proteomische Labordaten (DDA) wurden auf Reproduzierbarkeit analysiert und zeigten eine Überlappung der Peptididentifizierungen von Replikatpaaren im Bereich von 35-60 % [10]. Die hierbei offenbarten Datenerfassungsverfahren greifen auf SRM, Einschlusslisten und datenunabhängige Ansätze zurück, die alle eine höhere Reproduzierbarkeit ergeben, da die stochastische Natur von DDA eliminiert wird. Vorläufige Daten mit einfachen Implementationen von MaeStro1 und MaeStro2 auf einem Velos-Orbitrap-System zeigen ein ausgezeichnetes Reproduzierbarkeitsmaß (-75-87 %). Die hierbei offenbarten Hardware- und Software-Konzepte können diese Zahlen ohne weiteres auf die gewünschten 95 % oder darüber erhöhen.
Quantifizierung/Fraktionierung. Von vorrangiger Bedeutung für jedes neue MS-Verfahren ist die Fähigkeit, quantitative Informationen zu erhalten. Nachfolgend wird gezeigt, wie eine isobare Tagging-Strategie implementiert werden kann; die MaeStro-Steuerlogik kann jedoch kreative und nützliche neue Gelegenheiten für jede Art von aktuellem Quantifizierungsansatz ermöglichen. Quantitative Signale werden mit rtTC-Targetdetektion verstärkt. Nachdem ein Peptidtarget bestätigt wurde, kann MaeStro zum Beispiel einen selektierten Ionenmassenbereich-(SIM)-Scan auslösen, um ein isotopisch markiertes Paar präzise zu überwachen (z.B. SILAC). Mit diesem Ansatz kann der dynamische Bereich und die Präzision gegenüber der derzeitigen Praxis stark erhöht werden. Für Experimente auf der Basis isobarer Tags löst MaeStro einfach einen zweiten MS²-Scan mit einem sehr engen m/z-Bereich aus, so dass interferierende Spezien die quantitativen Signale nicht stören. Diese Art von Scanning erfolgt nur nach einer Bestätigung, so dass die Gesamtkosten für den Arbeitszyklus gering sind. Keine Änderung wird benötigt, um nicht Isotop-gestützte Quantifizierungsansätze zu liefern.
Ein proteomischer Trend besteht in der extensiven Nutzung von Fraktionierung vor LC-MS/MS. Durch Fraktionierung können komplexe Peptidgemische vereinfacht werden und es werden eine größere Abdeckung und ein größerer dynamischer Bereich ermöglicht. Idealerweise kann die Targetliste so aktualisiert werden, dass vorhergesagte Charakteristiken jedes Peptidtargets auf spezifische Fraktionen kartiert werden. Ein derartiger Betrieb kann erhebliche Vorteile bringen - hauptsächlich den, dass Targetlisten auf spezifische Fraktionen zugeschnitten werden können. Der Schlüssel ist hier die Fähigkeit vorherzusagen, welche Kandidattargets zum Beispiel in einer gegebenen SCX-(starker Kationenaustausch)- oder isoelektrischen Fokussierungsfraktion sind. In jüngster Zeit sind mehrere Berichte über dieses Thema erschienen und diese Algorithmen und ihre Fähigkeit können zum Vorhersagen von Targetorten verwendet werden [97]. Es wird eine absolute prädiktive Leistung benötigt. Wenn beispielsweise nur 50 % der Targets der richtigen Fraktion von 10 zugeordnet werden können, dann wird bei der Targetkapazität ein 5facher Gewinn erzielt.
Gerichtete Systemanalyse von mitochondrialer Adaption an Eisenmangel. Die OrbiQ-Plattform kann wirksam eingesetzt werden, um mitochondriale proteomische Veränderungen zu überwachen, die in Skelettmuskelzellen als Reaktion auf Nährstoffstress auftreten. Dies ist aus mehreren Gründen ein idealer Versuchsgegenstand, der mit dieser neuen Technologie untersucht werden kann. Zunächst sind Mitochondrien für die menschliche Gesundheit von sehr hoher Bedeutung, da heute mehr als 50 Krankheiten mit mitochondrialen Dysfunktionen assoziiert sind. Zweitens passen sich Zellen an externe Belastungen an, indem sie ihre mitochondriale Infrastruktur verändern, allerdings werden das Ausmaß dieser Umstrukturierung und die Mechanismen, die diesen Prozess antreiben, kaum verstanden. Drittens umfasst das mitochondriale Proteinkomplement eine Zahl von 1098 - eine reproduzierbare Detektion von allen diesen Proteinen über mehrere biologische Replikate ist derzeit mit herkömmlichen Instrumenten und Techniken nicht möglich. In der Tat hat Pagliarini kürzlich eine Studie geleitet, die eine eingehende Proteinmassenspektrometrie, Mikroskopie und maschinelles Lernen zum Konstruieren des Kompendiums von 1098 Proteinen des Mitochondriums integrierte, auf der dieses gezielte Experiment basierte [61]. Diese Quelle repräsentiert die bisher umfassendste und genauste molekulare Charakterisierung der Organelle.
Die Veränderungen des mitochondrialen Proteoms, die in Skelettmuskelzellen nach Eisenmangel auftreten, können überwacht werden. Dieses Experiment wird durch die tiefgreifende Bedeutung von Eisen für die mitochondriale Funktion und die menschliche Gesundheit sowie durch die kürzliche Beobachtung motiviert, dass diese Belastung einen rapiden Verlust an mitochondrialen Stoffwechselproteinen verursacht (12). Die Behandlung von Skelettmuskel-Myotuben bei Mäusen mit dem klinisch eingesetzten Eisenchelator Desferrioxamin (DFO) induziert den Verlust an Proteinen, die in einer mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) involviert sind, sowohl auf dosisabhängige als auch zeitabhängige Weise. Aber nicht alle mitochondrialen Proteine werden durch diese Belastung beeinflusst, wie an den unveränderten Konzentrationen des mitochondrialen spannungsabhängigen Anionenkanals (VDAC) in 12 zu sehen ist. Und für ein Subset von analysierten Genen stehen Veränderungen der mRNA-Werte nicht im Einklang mit Veränderungen der Proteinwerte, was darauf hindeutet, dass diese Phänomene mit genomischen Technologien allein nicht erfasst werden können (7). Die vorliegenden Daten legen den Schluss nahe, dass eine Ummodellierung des mitochondrialen Proteoms ein Schlüsselprozess bei der zellulären Adaption an Eisenmangel ist und dass diese Adaption undefinierte post-transkriptionale Prozesse beinhaltet.
Zellkultur/Behandlung. Zum Verdeutlichen des Ausmaßes der Adapation des mitochondrialen Proteoms an Eisenmangel wurden abgestimmte proteomische und Mikroarray-Analysen von Maus-Myotuben-C2C12-Zellen mit Eisenmangel durchgeführt. Zunächst wurden Myoblasten durch Wachstum in Niedrig-Serum-Medium für drei Tage zu Myotuben differenziert (13). Diese reifen Myotuben dienen als Modelle für post-mitotischen Skelettmuskel, dessen Funktion durch niedrige Eisenwerte besonders beeinflusst wird. Nach der Differenzierung wurden die Zellen mit 100 µm DFO behandelt - einer ausreichenden Menge, um einen deutlichen Rückgang an mitochondrialen Proteinen nach 24 Stunden (12), aber keinen Zelltod zu verursachen. Anhand dieser Zellen wurde die Transkript- und Proteindynamik zu 8 Behandlungszeitpunkten verglichen: 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24 und 48 Stunden. Eisenmangel führt zu einer schnellen Hinabregulierung von zytosolischen Proteinen über mRNA-Bindungsproteine [67, 68] und ist auch mit einer Reihe von umfassenderen transkriptionalen Reaktionen verbunden [98]. Eine Beobachtung dieses Zeitbereichs ermöglicht eine Unterscheidung zwischen durch Eisenmangel induzierten transkriptionalen Ereignissen und post-transkriptionalen Ereignissen. Die Experimente können auch die mitochondrialen Modifikationen zeigen, die sowohl bei akuten als auch chronischen Belastungen auftreten.
Analyse. Die mRNA- und Proteinabundanzen für jedes der für die Mitochondrien spezifischen 1098 Gene wurden anhand fünf biologischen Replikaten pro Zeitpunkt gemessen. mRNA kann durch Mikroarray gemessen werden. Proteinmessungen können mittels isobarer 8-plex-Tags (iTRAQ) durchgeführt werden. Diese Methodik ist mit der OrbiQ-Plattform völlig kompatibel. Mittels MaeStro wurden die 1098 mitochondrialen Proteine mit hoher Präzision und Reproduzierbarkeit targetiert. Alle targetierten MS-Daten können einer standardmäßigen Nacherfassungsdatenbanksuche mit einer Decoy-Datenbank unterzogen werden, um einen 1 % FDR-Cutoff zu ermitteln.
Datenanalyse. Mit diesen Daten ist ein direkter Vergleich zwischen Transkript und Protein über alle Bedingungen möglich. Mit dieser Strategie ist es möglich: (1) die spezifischen mitochondrialen Proteine und Pfade zu verdeutlichen, die durch Ionenmangel beeinflusst werden, und (2) die Beziehung zwischen mRNA und Proteinkonzentrationen direkt zu beurteilen. Die Übereinstimmung im Hinblick auf Größe und Richtung von Veränderungen für mRNA und Protein legt den Schluss nahe, dass Veränderungen der Genexpression aufgrund von Eisenverlust hauptsächlich durch Transkription verursacht werden. Nichtübereinstimmung weist hingegen auf die Beteiligung einer post-transkriptionalen Regulierung hin. In diesen Fällen können die verantwortlichen regulatorischen mRNA-Elemente identifiziert werden (14). Dazu wurde sowohl nach neuen kurzen Motiven als auch nach gut charakterisierten längeren Motiven gesucht. Zunächst werden alle mitochondrialen Gene auf der Basis des Übereinstimmungsgrads und der Suche im Hinblick auf die Anwesenheit von kurzen (6-10 bp) konservierten Motiven in mRNA UTRs dieser Gene mit einem Rechenalgorithmus rangmäßig eingestuft [99] (14). Motive, die vorzugsweise mit den nicht übereinstimmenden Genen assoziiert sind, können als regulatorische mRNA-Kandidatmotive angesehen werden. Längere regulatorische mRNA-Elemente, wie z.B. uORFs, Eisenreaktionselemente (IREs) und interne ribosomale Eintrittsstellen (IRESs) sowie die ~50 gut charakterisierten kurzen UTR-Motive können ebenfalls mit online kostenlos erhältlichen Rechen-Tools untersucht werden [100]. Auf der Basis vergangener Leistungen dieses Rechenansatzes und der zunehmenden Implikationen der post-transkriptionalen Genexpressionskontrolle können diese Ansätze zur Identifizierung von regulatorischen mRNA-Motiven führen, die für die Expression mitochondrialer Proteine als Reaktion auf Eisenmangel wichtig sind. Die Funktionalität von Motiven mit hoher Bewertungsziffer kann anhand von quantitativer PCR und Luminometrie validiert werden, wie bereits früher durchgeführt [101].
Grundprinzip für Fünffachmessungen. Eine empfindliche Detektion von regulierten Genen und Proteinen erfordert mehrere biologische Replikatmessungen - die gesamte Basis für den wachsenden gerichteten MS-Bereich. Die Durchführung von biologischen Fünffachexperimenten gewährleistet die Detektion einer 50%igen Veränderung zwischen beliebigen zwei Genprodukten mit 95%iger Wahrscheinlichkeit bei einer Standardabweichung von 20 % oder weniger. Mit iTRAQ fünffach durchgeführte Experimente zeigten, dass 75 bis 90 % der Transkripte und Proteine, die sich um das 1,5fache oder mehr veränderten, diese Kriterien erfüllen und statistisch signifikante Ereignisse repräsentieren. Der Hauptnutzen der Replikatmessung besteht darin, eine Beurteilung der Signifikanz für nahezu alle überwachten Gene zu liefern. Für eine Korrektur im Hinblick auf mehrfache Hypothesetests und eine weitere Verbesserung der statistischen Leistung wird FDR anhand einer kombinierten Analyse der mRNA- und Proteinkonzentrationen unter Verwendung von SAM berechnet [102, 103]. Diese Analyse ermöglicht einen Vergleich zwischen Protein- und mRNA-Konzentrationen zu einem bestimmten Zeitpunkt und das Testen auf Trendveränderungen im Laufe der Zeit.
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BEISPIEL .2: VORLÄUFERAUSWAHL MIT HILFE EINES ARTIFICIAL- INTELLIGENCE-ALGORITHMUS ERHÖHT ABDECKUNG UND REPRODUZIERBARKEIT VON PROTEOMISCHEN PROBEN
Während sich die Proteomik von auf Entdeckung beruhenden Experimenten in Richtung auf hypothesegesteuerte Analysen bewegt, ist das Erfolgsmaß nicht mehr die absolute Zahl der identifizierten Proteine, sondern die Identifizierung spezifischer Proteine von Interesse. Dieser Trend wird durch das rasch wachsende Interesse an SRM-(selektierte Reaktionsüberwachung)-gestützten Protein-Assays veranschaulicht - ein leistungsstarkes Tandem-Massenspektrometrieverfahren, das zum Überwachen von Targetpeptiden innerhalb eines komplexen Proteinverdaus angewendet werden kann. Diese Experimente beinhalten typischerweise eine sorgfältige Optimierung von Fragmentierungsparametern, eine enge Regulierung von Flüssigchromatographie-(LC)-Bedingungen und eine komplexe Verfahrensplanung. Bisher war das Spektrometer in allen Protein-Assays auf Massenspektrometerbasis ein passives Mittel. Der Benutzer weist das Instrument an, wie es die Vorläufer-lonenpopulation prüfen soll, welche Vorläufer es abfragen soll und wie diese Vorläufer abgefragt werden sollen. Diese Instrumente verlangen im Wesentlichen eine sorgfältige und genaue Handhabung durch den Benutzer, wodurch aufwändige Verfahren zum Erzeugen empfindlicher, spezifischer und reproduzierbarer Ergebnisse erforderlich sind.
Wie hierbei beschrieben wurde ein Artificial- Intelligence-Algorithmus entwickelt, der das Instrument befähigt, die bei der laufenden Analyse gesammelten Informationen zu interpretieren. Anhand dieser Informationen kann das Instrument bestimmte Analysen gegenüber anderen priorisieren. Auf diese Weise sammelt das Instrument sehr effizient Daten, anhand derer mit hoher Wahrscheinlichkeit Peptide und Proteine von Interesse mit minimalen Eingaben vom Benutzer identifiziert werden können.
Massenspektrometer-Instrumentenspezifikationen. Die Vorläuferionenauswahl in Echtzeit mit Hilfe eines Artificial-Intelligence-Algorithmus beruht auf der Fähigkeit, eine positive Identifizierung von den Fragment-Ionen des dissoziierten Vorläufers zu machen. Mit einer Massengenauigkeit von 10 bis 20 ppm werden nur etwa 5 Fragmentpeak-Übereinstimmungen benötigt, um ein Peptid eindeutig zu identifizieren. Mit abnehmender Massengenauigkeit nimmt die Zahl der benötigten Peak-Übereinstimmungen zu. Bei einer Genauigkeit von über etwa 100 ppm kann die Zahl der falsch-positiven Identifizierungen stark zunehmen, was den Nutzen dieses Ansatzes begrenzt. Die beiden Grunderfordernisse eines Massenspektrometers für Echtzeitidentifizierungen sind die Fähigkeit, die Mutter-Ionen zu fragmentieren, und die Fähigkeit, die Fragment-Ionen-m/z-Werte mit einer Genauigkeit von mehr als 100 ppm zu analysieren. Weitere benötigte Instrumentenfunktionalitäten variieren in Abhängigkeit von dem Verfahren, das der Identifizierung des Mutter-Ions folgen soll. Es folgen einige Beispiele für handelsübliche Instrumente mit Fragmentierungsfähigkeiten und Massengenauigkeiten von mehr als 100 ppm:
QTOF-Instrumente: Waters QTOF Ultima, Waters QTOF Micro, MDS Sciex Qstar XL und Bruker BioTOF.
ICR-(FT-MS)-Instrumente: Bruker Apex IV, Ion Spec 1, Thermo LTQ FT, Thermo Velos Orbitrap und Thermo Exactive Orbitrap.
In einer Ausgestaltung ist die einzige vom Algorithmus benötigte Eingabe eine Liste von Peptiden und Proteinen von Interesse. Während des Betriebs konzentriert sich das Instrument auf die Spektralmerkmale, die den vorhergesagten m/z-Werten der Vorläufer (Proteine/Peptide) von Interesse entsprechen. Mit fortschreitender Analyse sammelt der Algorithmus Informationen über das laufende Elutionsprofil durch Identifizieren von Peptiden von Interesse, während diese eluieren. Diese Informationen werden verwendet, um (1) unnötige Erfassungswiederholungen desselben Merkmals auszuschließen, (2) zu ermitteln, welche anderen Peptide von Interesse auf der Basis von Hydrophobizitäten möglicherweise co-eluieren, und (3) die Analysetiefe zu erhöhen, indem eine Abfrage von Peptiden für ein bestimmtes Protein ausgeschlossen wird, nachdem es identifiziert wurde.
Durch Verlagern der Kontrolle über das Instrument vom Benutzer auf den Artificial-Intelligence-Algorithmus wird das Instrumentenverfahren sehr dynamisch (d.h. das Instrumentenverfahren passt sich an sich ändernde LC-Bedingungen in einem zeitlichen Rahmen an, der niemals möglich wäre, wenn das Instrument von einem Menschen bedient würde). Da der Algorithmus zahlreiche Metriken beim Sammeln von Daten berücksichtigt (Retentionszeit, m/z, Intensität usw.), wird die stochastische Natur von typischen datenabhängigen Analysen größtenteils negiert und die Reproduzierbarkeit von einem Durchlauf zum anderen steigt drastisch an.
In einer Ausgestaltung werden Verfahren zum Identifizieren von Peptiden und Proteinen in einem Gemisch durch Priorisieren der Datenerfassung auf der Basis der vorhergesagten m/z-Werte von Interesse bereitgestellt. In einer Ausgestaltung werden auch Verfahren zum Auswählen und Analysieren auf der Basis der Hydrophobizitäten der Peptide bereitgestellt.
Einschlusslisten, bei denen der Benutzer die Proteine und Peptide von Interesse definiert, sind ein aktiver Forschungsbereich für kommerzielle Zwecke. Existierende Lösungen können jedoch nicht bestätigen, dass die Proteine und Peptide korrekt identifiziert werden. Was noch wichtiger ist, existierende Algorithmen nutzen nicht die erlangten Informationen, um die von der Vorrichtung durchgeführten Abfrage dynamisch zu steuern.
Der hierbei beschriebene Echtzeit-Targetbestätigungsalgorithmus (rtTC) funktioniert aus zwei Hauptgründen: (1) die Zahl der möglichen Vergleiche jedes Tandem-Massenspektrums ist auf die Zahl der in die Instrumenten-Firmware heraufgeladenen Targets begrenzt, und (2) diese Berechnungen können zweckmäßig durchgeführt werden, weil das Abgleichen bei einer hohen Massengenauigkeit erfolgt (z.B. 10 ppm oder besser für einen Abgleich). Auf dieser Basis wurde gefunden, dass nur 5 Produkt-Ionen-Übereinstimmungen in einigen Fällen nötig sind, um ein Target positiv zu identifizieren (~1 % FDR).
Das rtTC-Verfahren bietet zahlreiche eindeutige stromabwärtige Datenerfassungsmöglichkeiten. Ein einfacher Ansatz besteht darin, beliebige identifizerte Targets vom Einschluss zu entfernen. Dadurch wird das Hinzufügen neuer Targets oder ein engerer Fokus auf existierende ermöglicht. Man könnte auch Peptidtargets entfernen, die einem Protein entsprechen, wenn andere Targets von demselben Protein als vorhanden bestätigt wurden.
Ein weiterer Vorteil besteht in der Verwendung der Informationen darüber, welches Target eluiert, um vorherzusagen, welche Targets möglicherweise als Nächstes eluieren. Beispielsweise lässt sich die Retentionsreihenfolge von Targetpeptiden vor der Analyse leicht berechnen. Diese Reihenfolge wird dann zusammen mit der Targetliste in die Instrumenten-Firmware geladen. Wenn ein Target in Echtzeit bestätigt wird, dann kann die Retentionsreihenfolgeliste zum Ermitteln eines Subsets der Targets verwendet werden, die mit der höchsten Wahrscheinlichkeit zu diesem Zeitpunkt oder in naher Zukunft eluieren werden. Die MS-Erfassung kann dann so verändert werden, dass besondere Aufmerksamkeit auf diejenigen Targets gelenkt wird, die als vorhanden vorhergesagt werden. Diese Liste wird natürlich ständig aktualisiert, wenn neuere Targets genommen werden. Die Implementation dieses besonderen Verfahrens kann auf wenigstens drei verschiedene Weisen erfolgen: (1) zum Anleiten des Instruments, um vorgegebene m/z-Peaks im vollständigen MS¹-Scan zu untersuchen (d.h. diejenigen, die als eluierend vorhergesagt werden); (2) zum Isolieren von engeren Regionen des MS¹ m/z-Wertes für eine erhöhte Empfindlichkeit - d.h. m/z-Regionen, in denen sich das Target laut Vorhersage befindet; und (3) zum Nicht-Erfassen von MS¹-Informationen und einfach Zulassen von engeren m/z-Regionen für direktes MS/MS-Scannen, die der der vorhergesagten m/z-Region des eluierenden Targetvorläufers entsprechen.
Wird ein Target bestätigt, dann können diese Informationen zum Ermitteln verwendet werden, ob genügend quantitative Informationen im MS/MS-Scan vorhanden sind. Ist dies nicht der Fall, d.h. das MS¹-Vorläufersignal oder das isobare Tag-Reporter-Signal liegt unter einem vom Benutzer definierten Qualitätsschwellenwert (wie z.B. ein Signal-Rausch-Verhältnis), dann können zusätzliche Scans an dem eluierenden Target ausgelöst werden. Diese Scans können iterativ durchgeführt werden, bis der Qualitätsschwellenwert erreicht ist. Ein Beispiel hierfür ist in 15 dargestellt, die Folgendes zeigt: einen vollständigen MS¹-Scan mit einem SILAC-Paar, dessen schwerer Ionenpeak heavy on list (Der Begriff „heavy on list“ in 15, Abs. [0100] und Abs. [0302] soll bedeuten, dass der schwere Ionenpeak des speziellen SILAC-Paares auf der Erfassungsliste eines Targets ist. Da das schwere Ion zu einem vorhergesagten Target auf der Liste passt, wird das kreisförmige Paar an Peaks einem zusätzlichen SIM-Scan unterzogen) in Feld A ist; den Schritt des Untersuchens des Signal-Rausch-Verhältnisses des am wenigsten intensiven SILAC-Peak-Paares in Feld B; das Verschmälern des MS¹-Scan-Fensters, um das Signal-Rausch-Verhältnis der SILAC-Paar-Peaks in Feld C zu erhöhen; und das erneute Prüfen des Signal-Rausch-Verhältnisses der SILAC-Paar-Peaks in Feld D.
Ein weiterer relevanter Scan kann von der rtTC-Bestätigung eines Targets ausgelöst werden. Zum Beispiel wenn ein Target eine Stelle mit post-translationaler Modifikation (PTM) enthält und es mehr als eine mögliche Aminosäure in der Sequenz gibt, die die Modifikation enthalten könnte. Die Instrumenten-Firmware kann einen Algorithmus ausführen, um zu ermitteln, ob die MS/MS-Informationen ausreichen, um die PTM auf einer bestimmten Stelle zu lokalisieren: Kann die Stelle anhand der vorliegenden Informationen nicht lokalisiert werden, dann können zusätzliche Prozeduren sofort ausgeführt werden. Dissoziationsparameter können beispielsweise verändert und nachfolgende MS/MS-Scans gesammelt werden. Es könnten auch andere Dissoziationsverfahren ausgelöst werden. Eine weitere Möglichkeit, möglicherweise gleichzeitig, besteht in einer Spektralmittelung, um ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten, so dass eine Stellenlokalisierung durchgeführt werden kann.
Vorläufige Daten haben gezeigt, dass für große, komplexe, tryptische Verdauung von Hefelysaten das Instrumentensteuerverfahren auf Algorithmusbasis mehr als 90 % der Peptide auf einer Liste identifizieren kann, die eine Länge von -5000 Einträgen hat. Im Gegensatz dazu decken standardmäßige datenabhängige Analysen -70 % dieser Liste ab. Der Algorithmus wurde auch an einer Liste mit schwierigen Peptiden getestet (z.B. niedrige Intensität, schlechte Fragmentierungseigenschaften, usw.), die -2000 Einträge enthält. Das vorliegende Verfahren erzielt etwa 2 Mal mehr Identifizierungen als das standardmäßige datenabhängige Verfahren (-1000 im Vergleich zu ~500).
Die Beschreibung hierbei enthält zwar zahlreiche Einzelheiten, diese sind aber nicht als den Umfang der Erfindung begrenzend anzusehen, sondern sollen lediglich Illustrationen für einige der Ausgestaltungen der Erfindung sein.
BEISPIEL 3: SOFORTIGE SPEKTRALZUORDNUNG FÜR FORTSCHRITTLICHE ENTSCHEIDUNGSBAUM-GESTEUERTE MASSENSPEKTROMETRIE
Hinweis: die Zahlen in Klammern beziehen sich auf die am Ende von BEISPIEL 3 aufgeführten Literaturquellen.
Das vorliegende Beispiel stellt einen Sequenzidentifizierungsalgorithmus (inSeq) bereit, der Tandem-Massenspektren in Echtzeit mit den Bordprozessoren des Massenspektrometers (MS) verarbeitet. inSeq beruht auf genauen Massen-Tandem-MS-Daten für einen schnellen Spektralabgleich mit hoher Genauigkeit. In einer Ausgestaltung braucht die sofortige Spektralverarbeitungstechnologie -16 ms für den Ablauf und liefert Informationen, die eine autonome Echtzeit-Entscheidungsfindung durch das MS-System ermöglichen. Mit inSeq und seiner fortschrittlichen Entscheidungsbaum-(DT)-Logik kann Folgendes demonstriert werden: (1) Echtzeitvorhersage von Peptidelutionsfenstern en masse (~3 Minuten Breite, 3000 Targets), (2) erhebliche Verbesserung der quantitativen Präzision und Genauigkeit (~3facher Anstieg bei detektierten Proteindifferenzen) und (3) erhöhte Lokalisierungsraten mit Bezug auf PTM-(posttranslationale Modifikations)-Stellen (90 % Übereinstimmung in Echtzeit gegenüber Offline-Lokalisierungsrate und ein Gewinn von ~25 % mit Bezug auf lokalisierte Stellen). Die durch inSeq aktivierte DT-Logik geht die seit langem bestehenden Probleme mit dem herkömmlichen datenabhängigen Erfassungsparadigma an und bietet eine direkte Route zu einer gestrafften und zweckmäßigen gezielten Proteinanalyse.
Einleitung.
Das Schrotschuss-Sequenzierungsverfahren, bei dem Proteine zu Peptiden verdaut, chromatographiert und durch Massenspektrometrie (MS) detektiert werden, hat sich im Laufe der letzten beiden Jahrzehnte rasch entwickelt (1, 2). Bei dieser Strategie werden die Masse-zu-Ladung-(m/z)-Werte der eluierenden Peptidkationen im MS¹-Scan gemessen. Dann werden, in der Reihenfolge der Abundanz, Vorläufer-m/z-Werte für eine Reihe von sequentiellen Tandem-MS-Ereignissen (MS²) ausgewählt. Diese Abfolge wird für die Dauer der Analyse zyklisch wiederholt. Der Prozess, der als datenabhängige Erfassung (DDA) bezeichnet wird, ist das Kernstück der Schrotschussanalyse und hat sich seit mehr als fünfzehn Jahren nicht verändert; MS-Hardware jedoch schon. Es wurden bedeutende Verbesserungen im Hinblick auf die MS-Empfindlichkeit, die Scan-Geschwindigkeit, die Massengenauigkeit und die Auflösung erzielt. Orbitrap-Hybridsysteme erzielen beispielsweise routinemäßig eine Massengenauigkeit im unteren ppm-Bereich mit MS/MS-Wiederholraten von 5-10 Hz (3,4). Ein konstanter Betrieb solcher Systeme erzeugt Hunderttausende von Spektren innerhalb von Tagen. Diese MS²-Spektren werden dann mit Datenbanksuchalgorithmen auf eine Sequenz kartiert (5-7).
Die DDA-Abtaststrategie bietet eine elegante Einfachheit und hat sich über praktisch jede MS-Plattform für entdeckungsgesteuerte Proteomik als äußerst nützlich erwiesen. In den letzten Jahren hat sich der Schwerpunkt jedoch von der Proteinidentifizierung auf die Peptidkonzentrationsquantifizierung verlagert - häufig im Hinblick auf bestimmte Targets. In diesem Zusammenhang traten Mängel im DDA-Ansatz zunehmend hervor. Der DDA-Ansatz hat zwei Hauptbegrenzungen: erstens, eine schlechte Reproduzierbarkeit von einem Durchlauf zum anderen, und zweitens, die Unfähigkeit, Peptide von Interesse effektiv zu targetieren (8). NichtReproduzierbarkeit wird durch die überaus stochastische Natur verursacht, die beim Wählen, welche m/z-Peaks abgetastet werden sollen, vorliegt. Oft co-eluieren Dutzende oder sogar Hunderte von Peptiden, so dass Signale mit geringem Pegel häufig in einem Durchlauf gewählt werden, im nächsten aber nicht. Und das Auswählen von m/z-Peaks zum Sequenzieren nach Abundanz bietet sicherlich keine Gelegenheit, das System über vorgewählte Targets zu informieren.
Es wurden mehrere DDA-Zusätze und Alternativen untersucht. Die Abtasttiefe kann beispielsweise dadurch erhöht werden, dass die Auswahl eines m/z-Wertes, der in einem früheren technischen Replikat identifiziert wurde, verhindert wird (PANDA) (9). Der NichtReproduzierbarkeit kann in einem gewissen Maße dadurch entgegengewirkt werden, dass der DDA-Algorithmus über die Vorläufer-m/z-Werte von gewünschten Targets informiert wird (Einschlussliste) - wenn beobachtet, kann dadurch ihre Auswahl für MS² gewährleistet werden. Oft haben Peptide mit niedriger Abundanz jedoch möglicherweise keine Vorläufersignale über Rauschpegel, so dass ein MS²-Scan, der für eine Identifizierung erforderlich ist, niemals ausgelöst wird. Dieses Problem wird im datenunabhängigen Datenerfassungsansatz (DIA) gänzlich vermieden (10). Hier wird der Vorläuferabundanz, oder sogar der Anwesenheit, keine Aufmerksamkeit geschenkt, stattdessen werden aufeinanderfolgende m/z-Isolierungsfenster dissoziiert und massenanalysiert. Ein Hauptnachteil des DIA-Ansatzes ist, dass er erheblich mehr Instrumentenanalysezeit benötigt, da MS²-Scans von jedem m/z-Fenster gesammelt werden müssen (11). Somit bleibt die DDA-Analyse das vorherrschende Verfahren für die MS-Datenerfassung.
Neben Verbesserungen in der MS-Analysegeräteleistung wurden kürzlich auch zahlreiche alternative Dissoziationsverfahren und Scan-Typen weiterentwickelt. Dazu gehören die Stoß-, Elektronen- und/oder photonengestützte Fragmentierung (d.h. trapHCD, HCD, ETD, IRMPD usw.), spezialisierte Quantifizierungs-Scans (d.h. selektierte lonenüberwachung (SIM) oder Vorläuferreinigungsverfahren (QuantMode, QM)) oder einfach die Analyse mit verschiedenen Vorläuferionentargets, m/z-Genauigkeit usw. (12-17). Jede dieser Techniken ist für irgendein Subset von Peptidvorläufern geeignet und erbringt hervorragende Leistungen. Das Ergebnis ist eine verwirrende Buchstabensuppe aus Techniken, Scan-Typen und Parameterraum, die sich nicht ohne weiteres in das derzeitige Datenerfassungsparadigma integrieren lässt. Kürzlich wurde ein Entscheidungsbaum-(DT)-Algorithmus eingeführt, der m, z und m/z von Vorläufern verwendete, um in Echtzeit automatisch zu ermitteln, ob CAD oder ETD bei MS² angewendet werden soll (18). Der Ansatz verbesserte die Sequenzierungserfolgsraten erheblich und war ein wichtiger erster Schritt in einer Bewegung in Richtung auf die Entwicklung einer informierten Erfassung. Leider kann von den sehr grundlegenden Informationen von m, z und Abundanz nur eine begrenzte Menge an Erkenntnissen gewonnen werden.
Hier wird der nächste Fortschritt in der DT-Erfassungstechnologie beschrieben - sofortige Sequenzbestätigung (inSeq). Der inSeq-Algorithmus verarbeitet MS²-Spektren im Augenblick der Sammlung mit Bordverarbeitungsleistung des MS-Systems. Wenn die Sequenz vorliegt, kann das MS-Erfassungssystem diese Kenntnis verarbeiten, um autonome Echtzeitentscheidungen darüber zu fällen, welcher Scan-Typ als Nächstes auszulösen ist. Mit dem inSeq-Sofortidentifizierungsalgorithmus wird hier das einfache DT-Verfahren durch Hinzufügen mehrerer neuer Entscheidungsknoten erweitert. Diese Knoten ermöglichen neuartige automatisierte Funktionalitäten wie z.B. unter anderem: Echtzeit-Elutionsvorhersage, fortschrittliche Quantifizierung, PTM-Lokalisierung, groß angelegte gezielte Proteomik und erhöhte Proteomabdeckung. Diese Technologie bietet einen direkten Pfad zur Transformation des derzeitigen passiven Datensammlungsparadigmas (d.h. DDA). Insbesondere lässt die Kenntnis der Identität eines Peptids, das gerade in das MS-System eluiert, einen Satz fortschrittlicher, automatisierter Entscheidungslogik zu.
Ergebnisse.
Sofortige Sequenzbestätigung (inSeq). Ein Ansatz zur Entwicklung eines fortschrittlichen DT-Erfassungsschemas, das die Vielzahl von spezialisierten Prozeduren und Scans, die bei modernen MS-Systemen zur Verfügung stehen, nahtlos integrieren kann, besteht darin, den Spektralanalyseprozess zu beschleunigen - d.h. von offline auf Echtzeit. Von diesen Sofortanalysen gewonnene Erkenntnisse ermöglichen es der automatisierten Entscheidungslogik, die meistmöglichen Informationen aus einer MS-Analyse zu extrahieren. Es gibt zwei Routen zur Integration einer Echtzeit-Spektralanalyse in ein MS-System. Der erste Ansatz exportiert Spektren zur Verarbeitung mit einem externen Rechensystem, gefolgt vom Import des Suchergebnisses (19). Eine zweite, elegantere Strategie besteht darin, sämtliche Berechnungen im MS-Bordrechensystem durchzuführen (20). Der erstere Ansatz umgeht Komplikationen beim Zugreifen auf Instrumenten-Firmware und erlaubt die Verwendung von höher entwickelter Verarbeitungsleistung; eine gravierende Beschränkung ist jedoch die Zeit, die zum Importieren/Exportieren der Informationen benötigt wird (d.h. -40 ms). Aus diesem Grund wurde Technologien und Rechenalgorithmen nachgegangen, die Echtzeit-Spektralanalyse in die Bordprozessoren und Firmware des MS-Systems integrieren. Dieses Verfahren wurde als „sofortige Sequenzbestätigung“ oder „inSeq“ bezeichnet.
Um Robustheit über Plattformen zu erzielen, wurde inSeq auf zwei getrennten MS-Systemen implementiert (die mit unterschiedlichen Codebasen arbeiten) - einer Doppelzellen-Quadrupol-Linearionenfallen-Orbitrap-Hybride (LTQ-Velos Orbitrap) und einer Quadrupol-Massenfilter-Orbitrap-Hybride (Q-Exactive). In beiden Fällen wurde die Instrumenten-Firmware modifiziert und erweitert, um MS/MS-Spektren schnell (~<20 ms im Falle des moderneren Q-Exactive-Systems) und genau (<2 % False Discovery Rate (FDR)) auf eine Sequenz zu kartieren. Der eingebettete Peptiddatenbank-Abgleichalgorithmus verarbeitet MS/MS-Scans sofort (14A-B) durch Vergleichen von Produkt-Ionen, die im MS/MS-Scan vorhanden sind, mit denen von Peptidkandidaten, die zuvor in die Firmware des Instruments geladen wurden. Man beachte, dass die Kandidatsequenzen zunächst gefiltert werden, so dass nur Sequenzen berücksichtigt werden, deren Masse innerhalb von 30 ppm der abgetasteten Vorläuferneutralmasse liegt (14C). Für jede Kandidatsequenz wird die Zahl von +1 Produkt-Ionen (+2 Ionen sind für Vorläufer >+2 eingeschlossen) aufgezeichnet, die mit dem Spektrum bei einer Massentoleranz <10 ppm übereinstimmten (14C). Der Algorithmus wendet Memoisationsoptimierungstechniken zum Berechnen von Produkt-Ionen-Informationen an, d.h. die Informationen werden nur einmal berechnet und die Ergebnisse werden in einer Schnellnachschlagtabelle gespeichert. Als Nächstes wird eine einfache Bewertungsmetrik verwendet, die genügend Nachweise für die Bestätigung einer vermeintlichen Sequenz bietet, ohne das System mit unwesentlichen Berechnungen zu belasten. Auf beiden MS-Plattformen wurde der Echtzeit-Bestätigungsalgorithmus zweckmäßig ausgeführt, erforderte keine Hardware-Modifikation und brauchte im Durchschnitt 16 ms zur Ausführung (Q-Exactive, 19). Man beachte, dass ähnliche Verarbeitungszeiten mit dem älteren Velos-Orbitrap-System erzielt wurden; allerdings war ein zusätzlicher Overhead von -100 ms eingeschlossen, da die existierende Firmware eine vollständige Sammlung des transienten Orbitrap-Signals vor der inSeq-Analyse benötigte.
Zur Charakterisierung des inSeq-Algorithmus wurde ein nHPLC-MS/MS-Experiment an tryptischen Peptiden durchgeführt, die von humanen embryonalen Stammzellen abstammten. Vor der Analyse wurde eine Datenbank auf den Bordcomputer des Instruments (Q-Exactive) heraufgeladen, die aus allen theoretischen tryptischen Peptiden (bis zu drei verpasste Spaltungen, mit einer Länge von 6-50) bestand, die im menschlichen Proteom enthalten sind. Es wurde ein datenabhängiges Top-10-Verfahren angewendet und die Analyse erfolgte wie gewöhnlich, mit der Ausnahme, dass nach jedem MS/MS-Scan der inSeq-Algorithmus ausgeführt und die Ergebnisse protokolliert wurde(n). Dieses Manifest von Sofortidentifizierungen wurde dann mit solchen verglichen, die nach der Erfassung über traditionelle Datenbanksuchen mit 1 % FDR (Umkehr-Decoy-Verfahren) gemacht wurden. Es wurde angenommen, dass der herkömmliche Nacherfassungsansatz die echte Antwort repräsentierte und die Zahl der korrekten sofortigen Spektralidentifizierungen in Abhängigkeit der abgeglichenen Produkt-Ionen verglich (14D). Anhand dieser Daten wurde der Schluss gezogen, dass die Detektion von >6 Produkt-Ionen mit hoher Massengenauigkeit (<10 ppm) mit dem inSeq-Algorithmus in >98 % der Fälle die korrekte Sequenzidentifizierung ergibt.
inSeq repräsentiert einen einfachen und zweckmäßigen Ansatz zum Korrelieren von Sequenz mit Spektrum und es sieht so aus, dass er zu einer wesentlichen Technologie beim Transformieren des derzeitigen passiven Datensammelparadigmas werden wird. Insbesondere lässt das Herausfinden der Identität eines Peptids, das gerade in das MS-System eluiert, einen Satz fortschrittlicher, automatisierter Entscheidungslogik zu. Diese Konzepte bauen auf der vorherigen Entwicklung des datenabhängigen Entscheidungsbaum-(DT)-Verfahrens auf. Dort wurde ein Bordalgorithmus eingebettet, um unbeaufsichtigte Echtzeitentscheidungen darüber zu treffen, welches Fragmentierungsverfahren aktiviert werden soll, auf der Basis von Vorläuferladung (z) und m/z. Mit dem Sofortidentifizierungsalgorithmus inSeq wird hier das einfache DT-Verfahren durch Hinzufügen mehrerer neuer Entscheidungsknoten erweitert. Diese Knoten ermöglichen automatisierte Funktionalitäten wie z.B. unter anderem: Echtzeit-Elutionsvorhersage, fortschrittliche Quantifizierung, PTM-Lokalisierung, groß angelegte gezielte Proteomik und erhöhte Proteomabdeckung (14F).
Vorhersage der Peptidelution. Flüssigchromatographie ist der konventionelle Ansatz zum Fraktionieren von äußerst komplexen Peptidgemischen vor einer Messung durch MS. Die höchste MS-Empfindlichkeit wird erreicht, wenn das MS-System so eingestellt wird, dass es ein gegebenes Target detektiert (d.h. Ausführen von MS/MS), und zwar unabhängig von seiner Anwesenheit im vorherigen MS¹-Ereignis (d.h. selektierte Reaktionsüberwachung). SRM-Messungen bieten sowohl Empfindlichkeit als auch Reproduzierbarkeit auf Kosten von Bandbreite. Insbesondere wenn die Elutionszeit eines Targets nicht bekannt ist, muss die Dauer der nHPLC-MS/MS-Analyse auf Bedingungen für diese spezifische Entität angepasst werden. Wenn die Elutionszeiten bekannt sind, dann können mehrere SRM-Scan-Ereignisse programmiert werden, die eine Detektion mehrerer Targets zulassen; chromatographische Bedingungen müssen jedoch identisch bleiben, da die geplanten SRM-Elutionsfenster sonst nicht mehr aufeinander ausgerichtet sind. Dennoch ist die Bandbreite bei diesem Ansatz niedrig, ~100 Peptidtargets pro nHPLC-MS/MS-Analyse, und das Zusammenstellen eines solchen Experiments ist äußerst aufwändig (21).
Es wurde vermutet, dass inSeq das MS-System ohne menschlichen Eingriff darüber informieren könnte, welche Peptidtargets mit der höchsten Wahrscheinlichkeit nachfolgend eluieren werden. Eine solche Fähigkeit würde eine robuste und groß angelegte Targetierung (>500 pro Analyse) auf automatische Weise ermöglichen. Dieser Ansatz beruht auf einer relativen Peptidelutionsreihenfolge und umgeht demzufolge die Nutzung absoluter Retentionszeiten, die sich je nach den chromatographischen Bedingungen verschieben und von mehreren verschiedenen Experimenten nicht direkt übertragbar sind. Die Peptidelutionsreihenfolge kann auf zwei Weisen erhalten werden. Erstens können Entdeckungsexperimente angewendet werden, um die Retentionsreihenfolge durch Normalisieren der gemessenen Retentionszeit für jede detektierte Peptidsequenz zu ermitteln. Zweitens kann die relative Hydrophobizität für eine Sequenz theoretisch mit existierender Software ermittelt werden (z.B. SSRCalc) (22-24). Auf der Basis früherer Erfahrungen ist man der Ansicht, dass eine experimentell ermittelte Retentionsreihenfolge eine bessere Präzision bietet; und doch werden weiterhin Vorkenntnisse benötigt, die möglicherweise nicht zur Verfügung stehen. Wie auch immer die Retentionsreihenfolge ermittelt wird, der Echtzeit-Bestätigungsalgorithmus bleibt weiterhin ein gleitender Durchschnitt der berechneten Elutionsreihenfolge (CEO - eine Zahl, die die relative Elutionsreihenfolge eines Targetpeptids beschreibt), so dass Targetpeptiden mit nahe gelegenen CEOs speziell nachgegangen wird ( 15B). 15 zeigt eine Übersicht über diesen Ansatz. Dieses Beispiel hebt, 60,39 Minuten im Chromatographen, die letzten fünf inSeq-identifizierten Peptide und deren durchschnittliche CEO (26,926 a.u.) hervor. Der Bordalgorithmus berechnet dann ein asymmetrisches CEO-Fenster (5 a.u., 24,926-29,926), das eine kurze Liste von gewünschten Targets mit CEOs innerhalb dieses Bereichs präsentiert (15C). Mit dieser Information kann das MS-System spezialisierte MS²-Scans auslösen, die für dieses verfeinerte Target-Subset spezifisch sind. Man beachte, dass das CEO-Fenster, während Targets identifiziert werden, dynamisch angepasst wird, so dass Targets präzise dann in den und aus dem Bereich kommen, wenn sie eluieren.
Um diese Technologie zu testen, wurde ein datenabhängiges Top-10-nHPLC-MS/MS-Experiment durchgeführt, bei dem tryptische Peptide von einer humanen ES-Zellprobe über einen 60-Minuten-Gradienten getrennt wurden. Nach der Datensammlung wurden die resultierenden MS/MS-Spektren anhand einer Datenbanksuche auf eine Sequenz kartiert (1 % FDR). Die eindeutigen Peptididentifizierungen (4237) wurden nach beobachteter Retentionszeit sortiert - diese Reihenfolge diente dann als CEO. 3000 dieser Peptide wurden auf Zufallsbasis als „Targets“ ausgewählt und anschließend in die Instrumenten-Firmware (Velos-Orbitrap) zusammen mit ihrer jeweiligen CEO als Datenbestand für inSeq geladen. Die Probe wurde dann mit aktiviertem inSeq erneut analysiert, aber mit doppelter Gradientenlänge (120 min). 15D zeigt das in Echtzeit vom MS-System (inSeq) berechnete CEO-Fenster, das neben der tatsächlichen Elutionszeit von identifizierten Peptiden dargestellt ist. Mehr als 95 % der Peptide (2889) fielen in das gleitende CEO-Fenster und wurden sowohl durch inSeq als auch Nacherfassungssuche identifiziert. Ferner betrug die gleitende CEO-Fensterbreite im Durchschnitt ~4 Minuten für jedes dieser 3000 Targets. Mit der derzeitigen Kapazität können Fensterbreiten ähnlich denen, die in Experimenten des absoluten Planungstyps (-3-6 Minuten) verwendet werden, mit minimalem Aufwand auf einem Maßstab erzielt werden, der 30 Mal höher ist (z.B. 3000 Targets gegenüber 100) (21, 25). Ferner lässt sich dieser Ansatz leicht an verschiedene chromatographische Bedingungen ohne negative Auswirkungen anpassen ( 15D). Der Schlüssel zur hohen Übertragbarkeit und Einfachheit dieses Algorithmus ist die Verwendung von inSeq für eine kontinuierliche Echtzeit-Neuausrichtung.
Verbesserung der quantitativen Genauigkeit. Das Verfahren der stabilen Isotopmarkierung hat die groß angelegte quantitative Analyse stark vorangetrieben (26-31). Diese Techniken sind zwar allgemein robust, aber sie können punktuelle Daten für bestimmte Peptid- und Proteingruppen hervorbringen - hauptsächlich solche, die in niedrigen Abundanzen vorhanden sind. Bei SILAC resultieren Vorläuferpeaks mit niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) im MS¹-Scan häufig entweder in einem Wegfall dieses speziellen Merkmals oder in einer quantitativen Ungenauigkeit, sofern einbezogen (32). Beim isobaren Tagging induzieren Reporter-Ionensignale (MS²) mit geringer Intensität ähnliche Nachteile (33). Es wurde vermutet, dass inSeq eingesetzt werden könnte, um diesen Beschränkungen entgegenzuwirken.
Zunächst wurde ein inSeq-Modul entwickelt, um die Qualität von Messungen auf der Basis isobarer Markierungen zu verbessern. Das Modul analysiert MS²-Spektren mit inSeq und die Qualität der quantitativen Daten wird beurteilt, wenn ein Peptid von Interesse detektiert wird. Sollte das Reporter-Ionensignal unter einen bestimmten Schwellenwert fallen, dann löst inSeq Folge-Scans aus, um ein stärkeres Signal genau dann zu erzeugen, wenn das Targetpeptid eluiert. In einer Implementation wurde inSeq instruiert, automatisch drei quantitative Scans auszulösen, und zwar mit Hilfe des kürzlich entwickelten QuantMode-(QM)-Verfahrens, um quantitative Daten überlegener Qualität für Targets von hohem Wert zu erzeugen (17). Das Auslösen von drei zusätzlichen MS/MS-Scans erfordert ~1 Sekunde an Instrumentenzeit für einen einzigen Vorläufer. Ein grundlegender Betrieb in diesem Modus würde den Arbeitszyklus erheblich behindern; aber das Auslösen der Scan-Sequenz bei nur ein paar hundert vorgewählten Targets von hohem Wert nimmt nur eine bescheidene Menge an Zeit in Anspruch und kann bemerkenswerte quantitative Informationen über die vom Benutzer ausgewählten Peptidtargets liefern. Das Trio von QM-Scans wird dann offline summiert.
Zur Beurteilung dieses Entscheidungsknotens wurde eine Probe, die drei biologische Replikate von humanen embryonalen Stammzellen (ESCs) umfasste, vor und zwei Tage nach einer Behandlung mit knochenmorphogenetischem Protein 4 (BMP4) analysiert (d.h. TMT 6-plex, drei Vorbehandlungs- und drei BMP4-Nachbehandlungs-Zellpopulationen). BMP4, ein Wachstumsfaktor, der kontextabhängige Differenzierung in pluripotenten Stammzellen induziert, wird weithin zum Studieren von Differenzierungen zu biologisch relevanten Zellstammbäumen, wie Mesoderm und Endoderm, verwendet. 16A demonstriert den Vorzug der Summierung von isobaren Tag-Intensitäten von ein, zwei oder drei aufeinanderfolgenden Quantifizierungs-Scans für ein /nSeq-identifiziertes Targetpeptid mit der Sequenz FCADHPFLFFIR von dem Protein SERPINB8. Hier ist das Änderungsverhältnis zwischen Kontroll- und Behandlungszelllinien, das in einem QM-Scan gemessen wurde, groß (5,86), aber nicht signifikant (P = 0,067, Student-t-Test mit Storey-Korrektur) (34). Man beachte, dass ein Signifikanztest durch Beurteilen der Variation innerhalb der drei biologischen Replikate von sowohl Behandlungs- als auch Kontrollzelllinien durchgeführt wurde. Das gemessene Verhältnis bleibt relativ unverändert (5,22 und 5,43), wenn Reporter-Tag-Signale von zusätzlichen Quantifizierungs-Scans hinzugefügt werden; allerdings gehen die entsprechenden P-Werte auf 0,014 und 0,012 zurück, wenn zwei oder drei Quantifizierungs-Scans summiert werden. Durch graphisches Darstellen des log₂-Verhältnisses von quantifizierten Proteinen von den drei biologischen Replikaten gegenüber der durchschnittlichen Intensität von isobaren Markierungen (16B) wurde demonstriert, dass diese verbesserte Signifikanz von einem verstärkten Reporter-Signal-Rausch-Verhältnis resultiert. Idealerweise würde dieses log₂-Verhältnis Null betragen, was eine perfekte biologische Replikation anzeigt; wenn jedoch nur ein Quantifizierungs-Scan verwendet wird, dann weicht dieses Verhältnis mit abnehmender Tag-Intensität erheblich von Null ab. Um die Datenqualität insgesamt zu verbessern und potentielle fehlerhafte Messungen zu vermeiden, können arbiträre Reportersignal-Cutoffs (gestrichelte vertikale Linie in 16B) verwendet werden. Diese Cutoffs eliminieren viele Peptide mit niedriger Abundanz, die oft. Proteine von Interesse repräsentieren. Die Summierung von zusätzlichen Quantifizierungs-Scans erhöht die durchschnittliche Reporter-Tag-Intensität und hebt nahezu alle Proteinmessungen über den Intensitäts-Cutoff-Wert an (74, 9 und 4 Proteine unter Verwendung von jeweils einem, zwei und drei Quantifizierungs-Scan(s) weggelassen). Dieser Quantifizierungsentscheidungsknoten erhöhte auch die Zahl der Proteine innerhalb 25 % einer perfekten biologischen Replikation (horizontale gestrichelte Linie).
Um zu ermitteln, ob das Verfahren die Zahl der statistisch signifikanten Differenzen zwischen den Zellpopulationen verbessern konnte, wurde das log₂-Verhältnis von Behandlung gegenüber Kontrolle (d.h. 2 Tage/0 Tage) für jedes der 596 quantifizierten Proteine berechnet (P<0,05, Student-t-Test mit Storey-Korrektur, 16C). Um sowohl das Veränderungsvielfache als auch die Signifikanz anzuzeigen, wurde der P-Wert für jede Proteindifferenz gegenüber dem entsprechenden Verhältnis graphisch dargestellt. Nur 28 Proteine zeigen eine signifikante Veränderung, wenn ein QM-Scan benutzt wird. Durch einfaches Hinzufügen des Reporter-Tag-Signals von einem zusätzlichen Scan nimmt die Zahl der sich signifikant verändernden Proteine nahezu um das Dreifache zu, von 28 auf 83. Wenn alle drei QM-Scans zusammen analysiert werden, dann steigt die Zahl der sich signifikant verändernden Proteine geringfügig - auf 91.
Viele stabile Isotopeinbautechniken messen schwere und leichte Peptidpaare in MS¹ (z.B. SILAC). Dieser Ansatz verlangt natürlich die Detektion beider Partner; man beachte, dass Peptide mit niedriger Abundanz häufig mit einem niedrigen (oder ohne) Vorläufersignal in MS¹ identifiziert werden. Man ist der Ansicht, dass das Hinzufügen eines weiteren inSeq-Entscheidungsknotens dieses Problem umgehen könnte. Humane embryonale Stammzellen (ESCs) wurden in leichten und schweren Medien kultiviert (d.h. Lysin[¹³C₆-¹⁵N₂]). Proteinextrakt von diesen Kulturen wurde zu 5:1 (leichtschwer) vor einer Verdauung über Nacht mit LysC gemischt. Der SILAC-Knoten wurde entwickelt, um Vorläufer von einem MS¹-Scan nur dann auszuwählen, wenn die monoisotopische Masse innerhalb von 30 ppm eines beliebigen Targets auf einer Liste lag, die 4000 schwere und leichte Peptide von einem vorherigen Entdeckungslauf enthielt. Targets wurden nur dann ausgewählt, wenn das SILAC-Verhältnis von dem erwarteten Verhältnis von 5 um 25 % abwich, d.h. das Subset mit dem größten Fehler. Nach MS/MS wurden die resultierenden Spektren mit inSeq analysiert. Wenn ein Target von Interesse identifiziert wurde, dann wies inSeq das System an, sofort einen SIM-Scan aufzuzeichnen, wobei das leichte/schwere Paar mit einem kleinen, ladungsabhängigen Isolierungsfenster umgeben wurde (~8-10 Th). Der enge Isolierungsbereich ergibt eine Gasphasenanreicherung von Targetvorläufern mit niedriger Abundanz und ermöglicht eine genaue Quantifizierung von vielen Peptiden, deren Daten sonst verworfen würden.
Das durchschnittliche Verhältnis der leichten und schweren Peptide verschob sich subtil, aber signifikant, von 4,47 unter normaler Analyse auf 5,34 bei durch inSeq ausgelösten SIM-Scans (Student-t-Test, p-Wert < 6×10^-20). Noch wichtiger ist, dass sich die Zahl der nutzbaren Messwerte, d.h. wenn beide Partner des Paares beobachtet wurden, um ~20 % erhöhte (2887 unter normaler Analyse auf 3548 mit inSeq). Die Gesamtverteilung dieser Daten ist in 17A graphisch dargestellt. Feld B von 17 zeigt ein Beispiel für den durch inSeq ausgelösten SIM-Scan und die Zunahme des S/N und die Genauigkeit, die sich ergibt. Hier wurde der MS/MS-Scan des leichten Partners in Echtzeit auf die Sequenz IEELDQENEAALENGIK kartiert, ein vordefiniertes Target. Dieses Ereignis löste einen hochauflösenden SIM-Scan aus (8-Th-Fenster), der das Verhältnis von 4,99:1 ermittelte (korrektes Verhältnis 5:1). Hier war die Gasphasenanreicherung wesentlich, um die relative Abundanz zu quantifizieren, da die isotopische Hülle des schweren Partners nicht beobachtet wurde, selbst bei einer umfangreichen Spektralmittelung von aufeinanderfolgenden MS¹-Scans (~30 s, 17B). Ob für MS¹- oder MS²-zentrische Verfahren, ist man der Ansicht, dass inSeq-Technologie die Qualität von quantitativen Daten mit nur einem minimalen Einfluss auf den Arbeitszyklus erheblich verbessern wird.
Lokalisierung post-translationaler Modifikationsstellen. Das Vorhandensein oder das Fehlen von post-translationalen Modifikationen (PTMs) auf Proteinen spielt eine bedeutende Rolle bei der Zellfunktion und -signalisierung. Eine eindeutige Lokalisierung von PTMs auf einem Rest verlangt eine Beobachtung von Produkt-Ionen, die aus der Spaltung der Reste neben der Modifikationsstelle resultieren, d.h. stellenbestimmende Fragmente (SDFs). Die Phosphorylierungsanalyse verbreitet sich zunehmend; in einer typischen Analyse kann jedoch nur etwa die Hälfte der identifizierten Phosphorylierungsstellen mit einer einzelnen Aminosäureauflösung kartiert werden. Diese nicht eindeutigen Spektren behindern Datenanalysen auf Systemebene und verhindern die Verwendung von Tausenden von identifizierten Phosphopeptiden. Man argumentierte, dass inSeq wirksam eingesetzt werden könnte, um PTM-Lokalisierungsraten durch dynamisches Modifizieren der MS²-Erfassungsbedingungen bei Bedarf zu erhöhen. Somit wurde ein Online-PTM-Lokalisierungsentscheidungsknoten entwickelt, um innerhalb von Millisekunden zu ermitteln, ob ein MS/MS-Spektrum SDFs enthält, um die PTM eindeutig zu lokalisieren. Sollten SDFs fehlen, dann veranlasst inSeq sofort eine weitere Abfrage.
Der PTM-Lokalisierungsknoten wird aktiviert, wenn inSeq die Detektion eines PTM tragenden Peptids bestätigt. Nach dem Bestätigen der Sequenz beurteilt inSeq die Konfidenz, mit der die PTM(s) auf einem bestimmten Aminosäurerest lokalisiert werden kann/können. Dieser Vorgang wird durch Berechnen einer Online-Wahrscheinlichkeitsbewertungsziffer ähnlich wie bei Nacherfassungs-PTM-Lokalisierungssoftware durchgeführt - d.h. AScore (35). Unter Verwendung der eingebetteten Prozessoren des MS-Systems vergleicht inSeq alle möglichen Peptidisoformen mit dem MS/MS-Spektrum. Für jedes SDF wird die Zahl der Übereinstimmungen bei <10 ppm Toleranz gezählt und es wird ein AScore berechnet (inSeq verwendet eine ähnliche Arithmetik). Wenn der AScore der am besten passenden Isoform über 13 (p < 0,05) liegt, dann wird die PTM als lokalisiert ausgewiesen und die inSeq-Routine endet. Ist der AScore niedriger als 13, dann löst inSeq jedoch eine weitere Charakterisierung des eluierenden Vorläufers aus, bis entweder die Stelle als lokalisiert angesehen wird oder alle Entscheidungsknoten erschöpft sind. Eine zusätzliche Charakterisierung kann viele Prozeduren wie z.B. unter anderem die Erfassung von MS/MS-Spektren mit verschiedenen Fragmentierungsverfahren (z.B. CAD, HCD, ETD, PD usw.), unterschiedlichen Fragmentierungsbedingungen (z.B. Stoßenergie, Reaktionszeit, Laserfluenz usw.), erhöhter Spektralmittelung, MSⁿ, Pseudo-MSⁿ, modifiziertem dynamischem Ausschluss und veränderten AGC-Zielwerten beinhalten (36).
Um Proof-of-Concept-Ergebnisse zu erhalten, wurde ein einfacher inSeq-Knoten geschrieben, der einen ETD MS/MS-Scan von Phosphopeptiden auslöste, die nach HCD MS² nicht lokalisiert wurden. Ein Beispiel dafür, wie diese Logik funktionieren kann, wird in 18 gegeben, wo ein Targetphosphopeptid bei einem Schrotschuss-Experiment detektiert wurde. Es wurde bestätigt, dass die Sequenz RNSSEASSGDFLDLK eine Phosphorylgruppe enthielt; der inSeq-Algorithmus konnte die PTM jedoch nicht zuverlässig auf einem der vier Ser-Reste lokalisieren (AScore = 0). inSeq ermittelte die wahrscheinlichsten Stellen entweder als Ser 3 oder Ser 4. Als Nächstes löste inSeq einen ETD MS²-Scan desselben Vorläufers aus (18B). Es folgte dann eine Analyse des resultierenden Spektrums auf Anwesenheit der SDFs, c₃/z·₁₂. Beide dieser Fragmente waren anwesend und die Phosphorylierungsstelle wurde auf Ser 3 mit einem AScore von 31,0129 lokalisiert (p < 0,00079). Die Nacherfassungsanalyse bestätigte die Ergebnisse des Online-inSeq-Ansatzes - beide Spektren (HCD und ETD) wurden zuverlässig identifiziert und ihre berechneten AScores waren jeweils 0 und 45,58. Bei einem Vergleich auf einer globalen Skala hatten 993 der 1134 inSeq-identifizierten Phosphopeptide Lokalisierungsbeurteilungen, die mit der A-Score-Analyse nach der Erfassung übereinstimmten (18). Diese Daten demonstrieren, dass der Lokalisierungsknoten beim sofortigen Ermitteln, ob eine PTM-Stelle lokalisiert werden kann, äußerst wirksam ist. Und doch muss man auf diese Informationen hin tätig werden, um deutlich verbesserte Lokalisierungsergebnisse zu erzielen. Leider wurden nur marginale Gewinne bei dieser einfachen Implementation erzielt, da die meisten Vorläufer doppelt geladen waren und daher durch ETD nicht effektiv sequenziert wurden. Als Nächstes wurde der inSeq-Entscheidungsknoten modifiziert, um ein Dissoziationsverfahren DT aufzunehmen. Hier wurde ein Folge-ETD- oder ein kombinierter lonenfallen-CAD/HCD-Scan je nach Vorläuferladung (z) und m/z ausgelöst. Mit dem wenig entwickelten Algorithmus detektierte das inSeq-Verfahren 998 Phosphopeptide in einem einzigen Schrotschuss-Experiment. Es wurde festgestellt, dass 324 dieser Identifizierungen die Informationen zum Lokalisieren der PTM-Stelle fehlten, und in diesen Fällen wurde der neue Dissoziationsentscheidungsknoten ausgelöst. 78 dieser nicht lokalisierbaren Stellen wurden zuverlässig mit dieser Technik kartiert - so dass nahezu 25 % der nicht lokalisierten Stellen gewonnen wurden (20D). Diese ermutigenden Ergebnisse zeigen, dass inSeq die Probleme der PTM-Lokalisierung auf eine hochautomatisierte Weise angeht. Die offenbarten Verfahren sind auch auf eine Reihe verschiedener anderer nützlicher Vorrichtungsparameter und MS-Bedingungen anwendbar, wie z.B. Stoßenergie, Reaktionszeit, Laserfluenz, Spektralmittelung, MSⁿ, Anpassung von AGC-Zielwerten, Targetierung eines anderen Ladungszustands, usw., in dem Bestreben, diesen PTM-Lokalisierungsentscheidungsknoten fortlaufend weiterzuentwickeln.
Diskussion
Hier wird ein Sofortsequenzierungsalgorithmus (inSeq) beschrieben, der mit den gegebenen Prozessoren des Massenspektrometers arbeitet. inSeq beruht auf genauen MS²-Massendaten für einen zweckmäßigen Spektralabgleich mit hoher Genauigkeit. Eine schnelle Echtzeitsequenzierung ergibt mehrere neuartige Datenerfassungsmöglichkeiten. Um diese Möglichkeiten zu koordinieren, wurde eine fortschrittliche Entscheidungsbaumlogik konstruiert, die die frühere Nutzung des Verfahrens auf eine intelligente Auswahl des Dissoziationstyps erweitert. Mit diesem Ansatz können seit langem mit dem herkömmlichen DDA-Paradigma bestehende Probleme umgangen werden. Hier werden drei solche Beispiele gegeben. Zunächst kann die Kenntnis, welche Peptidsequenzen eluieren, die Vorhersage erleichtern, welche Targets bald eluieren werden. Es gibt gute Anhaltspunkte dafür, dass dieses Verfahren die Art und Weise revolutionieren wird, in der gezielte Proteomik durchgeführt wird. Zweitens wurden quantitative Entscheidungsknoten verwendet, die aktiv wurden, wenn inSeq eine Peptidsequenz von Interesse detektierte. Sowohl mit SILAC als auch mit isobarem Tagging wurden erhebliche Gewinne bei quantitativen Ergebnissen dokumentiert. Drittens wurde inSeq mit einem PTM-Stellen-Sofortlokalisierungsalgorithmus ausgestattet, um genau in dem Augenblick, in dem das Peptid von Interesse eluiert, zu ermitteln, ob eine gründlichere Nachbeobachtung eingeleitet werden soll oder nicht. Es wird gezeigt, dass der inSeq-Stellenlokalisierer äußerst effektiv ist (90 % Übereinstimmung mit der Nacherfassungsanalyse) und dass die Auslösung eines einfachen Dissoziationsverfahrens DT die Stellenlokalisierung um -25 % verbessern kann. Eine Weiterentwicklung wird zweifellos weitere Gewinne mit sich bringen.
Gezielte Proteomik ist ein Bereich von zunehmender Bedeutung. Nach einer Entdeckungsanalyse ist es selbstverständlich, die Liste von mehreren tausend detektierten Proteinen auf mehrere hundert „Hauptakteure“ auszusortieren. Unter idealen Umständen werden diese Schlüsselproteine dann in Dutzenden oder sogar Hunderten von Proben mit hoher Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit überwacht, ohne strenge Verfahrensentwicklung. Und dies muss natürlich auf äußerst angemessene Weise geschehen, da Hunderte von Proben beteiligt sind. Es wird erwartet, dass eine fortschrittliche DT-Analyse mit inSeq eine solche Plattform bieten könnte. Mit Hilfe des hier eingeführten Retentionszeit-Vorhersagealgorithmus kann der inSeq-Algorithmus vorhergesehen werden und es können schnell und präzise Hunderte von Peptiden ohne den großen Arbeitsaufwand und die Vorausplanung überwacht werden, der/die von der SRM-(selektierte Reaktionsüberwachung)-Technik, dem heutigen Stand der Technik (37), verlangt wird. Weitere Möglichkeiten beinhalten eine automatisierte Pfadanalyse, bei der vom Benutzer definierte Proteine, innerhalb einer Sammlung von Pfaden, einfach auf das MS-System heraufgeladen werden. Anschließend ermittelt inSeq automatisch die besten Peptide zur Weiterverfolgung, deren Retentionszeiten, und konstruiert das Verfahren. Die Hauptvorteile gegenüber der derzeitigen SRM-Technologie machen diesen Vorgang möglich. Erstens sind keine Kenntnisse der spezifischen Fragmentierungsübergänge notwendig, da alle Produkte mit hoher Massengenauigkeit überwacht werden. Zweitens ist keine präzise Elutionszeitplanung notwendig, da inSeq CEO, experimentell oder theoretisch, nutzen kann, um die vorhergesagte Elution von Targets dynamisch anzupassen. Auf diese Weise können die mühsamsten Komponenten des SRM-Arbeitsablaufs vermieden werden.
Materialien und Verfahren
Zellkultur, Zelllyse, Verdauung, isobares Markieren und Phosphopeptidanreicherung. Zellen wurden durch Beschallen lysiert und Protein wurde extrahiert. Für SILAC-Experimente wurden Proteine von den beiden Zellkulturen vor der Verdauung zu 5:1 (leichtschwer) gemischt. Bei allen Experimenten wurden Proteine entweder durch LysC oder LysC/Trypsin vor dem Entsalzen verdaut. Für isobar markierte Experimente wurden Peptide vor der nHPLC-MS/MS-Analyse markiert, gemischt und entsalzt. Für Phosphopeptidexperimente wurden Phosphopeptide über IMAC angereichert. Weitere Einzelheiten sind im SI-Text enthalten.
inSeq-Konfiguration, nHPLC, MS, Datenbanksuche, Phosphositlokalisierung und Peptid- und Proteinquantifizierung. Für alle Experimente wurden inSeq-Targetlisten und Verfahrensparameter in die Instrumenten-Firmware geladen. Alle Experimente wurden auf LTQ-Orbitrap-Velos- und Q-Exactive-Massenspektrometern (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Alle MS/MS-Spektren wurden mit OMSSA (Open Mass Spectrometry Search Algorithm) durchsucht. Peptid-FDR, Protein-FDR und Peptid- und Proteinquantifizierung mit isobaren Markierungen erfolgten mit Hilfe von COMPASS. Phosphositlokalisierung und SILAC-Quantifizierung wurden mit hauseigener Software durchgeführt. Zusätzliche Einzelheiten sind im SI-Text enthalten.
Zellkultur. Humane embryonale Stammzellen (Linie H1) wurden in einem Feederunabhängigen Medium wie zuvor beschrieben gehalten (Chen et al.). Für SILAC-Experimente wurde DMEM/F12 ohne Lysin und Arginin (Mediatech Inc.) durch leichtes Arginin (Sigma-Aldrich) und entweder schwerem markiertem Lysin (Cambridge Isotopes Laboratories) oder leichtem Lysin (Sigma-Aldrich) ergänzt. Zellen wurden auf Matrigel (BD Biosciences) kultiviert und 1:8 bei etwa 80 % Konfluenz unter Verwendung von 0,1 mM EDTA gesplittet. Zum Ernten von Zellen wurde TripLE Express (Invitrogen) fünf Minuten lang bei 37 Grad C aufgebracht. Nach der Zellablösung wurde vor dem Zentrifugieren ein äquivalentes Volumen an eiskalter DPBS (Invitrogen) zugegeben. Zellpellets wurden anschließend zweimal in eiskalter DPBS gewaschen und bei -80 Grad C gelagert. Mit BMP4 behandelte Zellen wurden wachsen gelassen und wie zuvor beschrieben geerntet, mit der Ausnahme, dass 5 ng/ml BMP4 (R&D Systems) dem Medium zugegeben wurden, und die Zellen wurden mit TrypLE (Invitrogen) gesplittet. Für BMP4-Experimente wurden einzelne Zellen mit einer Dichte von 4 X 104/cm2 für 1, 1,5, 2, 3 und 4 Behandlungstage plattiert. Etwa 108 Zellen wurden für jede Analyse gesammelt (zu Lyse-, Markierungs-, Anreicherungs- und n-LC-Verfahren siehe ergänzende Informationen).
Zelllyse. Für alle Analysen wurden humane embryonale Stammzellen in eiskaltem 8 M Harnstoff, 40 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 8), 2 mM MgCl2, 50 mM NaF, 50 mM b-Glycerophosphat, 1 mM Natriumorthovanadat, 10 mM Natriumpyrophosphat, 1X Mini EDTA-free Proteaseinhibitor (Roche Diagnostics) und 1X phosSTOP-Phosphataseinhibitor (Roche Diagnostics) lysiert. Zum Solubilisieren von Protein und zum Gewährleisten einer vollständigen Lyse wurden die Proben dreimal 15 Sekunden lang mit jeweils 30 Sekunden Pause beschallt. Das gesamte Protein wurde dann mit einem BCA-Protein-Assay-Kit (Thermo Scientific Pierce) quantifiziert.
Probenpräparation für isobare Markierung. Zur Analyse wurden 250 ug Protein von jeder Probe durch die Zugabe von DTT bis zu einer Endkonzentration von 5 mM reduziert und vor dem endgültigen Capping mit 5 mM DTT mit 15 mM Iodacetamid alkyliert. Die Verdauung erfolgte durch Zugeben von LysC (Wako Chemicals) mit einem Enzym-Protein-Verhältnis von 1:100 und 2-stündiges Inkubieren bei 37 Grad C. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Lysat mit 25 mM Tris (pH 8) auf eine endgültige Harnstoffkonzentration von 1,5 M verdünnt und 12 Stunden lang bei 37 Grad C mit Trypsin (Promega) mit einem Enzym-Protein-Verhältnis von 1:100 weiter verdaut. Dann wurden Peptide mit TFA angesäuert, um die Reaktion zu quenchen, und mit C-18 Festphasenextraktions-(SPE)-Säulen (Waters) entsalzt. Die TMT-Markierung erfolgte gemäß Anweisungen des Herstellers (Thermo Scientific Pierce). Proben wurden vor der Analyse in einem Verhältnis von 1:1:1:1:1:1 gemischt.
SILAC-Probenpräparation. Protein von den leichten und schweren embryonalen Stammzellkulturen wurde in einem Verhältnis von 5:1 (leicht:schwer) durch Poolen von 2,5 mg leichtem Protein und 0,5 mg schwerem Protein gemischt. Die Probe wurde durch die Zugabe von DTT bis zu einer Endkonzentration von 5 mM reduziert und vor dem endgültigen Capping mit 5 mM DTT mit 15 mM lodacetamid alkyliert. Die Verdauung erfolgte durch Zugeben von LysC (Wako Chemicals) mit einem Enzym-Protein-Verhältnis von 1:100 und Inkubieren über Nacht bei 37 Grad C. Peptide wurden dann mit TFA angesäuert, um die Reaktion zu quenchen, und mit C-18 Festphasenextraktions-(SPE)-Säulen (Waters) entsalzt.
Phosphopeptid-Probenpräparation. Von einer embryonalen Stammzellkultur wurde 1 mg Protein durch die Zugabe von DTT bis auf eine Endkonzentration von 5 mM reduziert und vor dem endgültigen Capping mit 5 mM DTT mit 15 mM lodacetamid alkyliert. Der Verdau erfolgte durch Zugeben von LysC (Wako Chemicals) mit einem Enzym-Protein-Verhältnis von 1:100 und 2-stündiges Inkubieren bei 37 Grad C. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Lysat mit 25 mM Tris (pH 8) bis auf eine Harnstoffendkonzentration von 1,5 M verdünnt und 12 Stunden lang bei 37 Grad C mit Trypsin (Promega) mit einem Enzym-Protein-Verhältnis von 1:100 weiter verdaut. Peptide wurden dann mit TFA angesäuert, um die Reaktion zu quenchen, und mit C-18 Festphasenextraktions-(SPE)-Säulen (Waters) entsalzt.
Phosphopeptide wurden durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) mit Hilfe von Magnetperlen (Qiagen) angereichert. Nach einer Äquilibrierung mit Wasser wurden die Perlen mit 40 mM EDTA (pH 8,0) 30 Minuten lang unter Schütteln behandelt und dreimal erneut mit Wasser gewaschen. Die Perlen wurden dann mit 100 mM FeCl3 30 Minuten lang unter Schütteln inkubiert und schließlich dreimal mit 80 % Acetonitril/0,1 % TFA gewaschen. Proben wurden ebenso in 80 % Acetonitril/0,15 % TFA resuspendiert und 45 Minuten lang unter Schütteln mit Perlen inkubiert. Das resultierende Gemisch wurde dreimal mit 1 ml 80 % Acetonitril/0,1 % TFA gewaschen und mit 1:1 Acetonitril:0,7 % NH4OH in Wasser eluiert. Eluierte Phosphopeptide wurden sofort mit 4 % Ameisensäure angesäuert und auf ~5 µl lyophilisiert.
Nano-Hochleistungsflüssigchromatographie. Für alle Proben wurde eine Online-Umkehrphasenchromatographie mit einem NanoAcquity UPLC System (Waters) durchgeführt. Peptide wurden auf eine Vorsäule (75 µm ID, mit 7 cm C18-Partikeln gepackt, Alltech) 10 Minuten lang mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 µm/min geladen. Proben wurden dann über eine Analysesäule (50 µm ID, mit 15 cm C18-Partikeln gepackt, Alltech) unter Verwendung eines 60- oder 120-minütigen linearen Gradienten von 2 % bis 35 % Acetonitril mit 0,2 % Ameisensäure und einer Fließgeschwindigkeit von 300 nl/min eluiert.
Erstellen einer Targetliste und inSeq-Einrichtung. Für alle Experimente wurden monoisotopische Masse, Ladungszustand und zuvor ermittelte Retentionszeit von Targetpeptiden für die Verwendung durch den inSeq-Algorithmus eingeschlossen. Zusätzlich wurden auf Methioninen oder Tyrosinen modifizierte Peptide aus allen Targetlisten weggelassen. Für Peptidelutions- und isobare Markierungsquantifizierungs-inSeq-Experimente wurde eine Targetliste von 4000 Peptiden von einem vorherigen nHPLC-MS/MS-Experiment unter Verwendung eines 90 min nHPLC-Gradienten erstellt. Für SILAC-inSeq-Experimente wurden mit 1 % FDR in einem nHPLC-MS/MS-Entdeckungsexperiment identifizierte Peptide analysiert, um das Verhältnis zwischen leichtem und schwerem Partner zu ermitteln. Es wurde eine Targetliste von 2000 Peptidpaaren (4000 Gesamtpeptide) erstellt, deren Verhältnis vom erwarteten Wert von 5 um wenigstens 25 % abwich. Dieses Subset von Peptiden beinhaltete zahlreiche Messungen, bei denen das Signal-Rausch-Verhältnis niedrig war oder ein Partner fehlte. Für inSeq-Phosphorylierungsexperimente wurden mit 1 % FDR in einem nHPLC-MS/MS-Entdeckungsexperiment identifizierte Phosphopeptide mit dem Phosphinator analysiert, um Phosphositstellen zuzuordnen. Es wurde eine Targetliste mit 2174 Phosphopeptiden erstellt und sowohl für Nur-ETD- als auch Entscheidungsbaum-(DT)-inSeq-Verfahren verwendet.
Targetlisten wurden in die Firmware des Instruments für einen Sofortzugriff bei der Erfassung geladen. Peptidlisten wurden in einer internen Datenbank gespeichert und auf der Basis ihrer Vorläufermasse für ein schnelles Nachschlagen mit einem binären Suchalgorithmus sortiert. Eine Parameterdatei wurde vor jedem Experiment in die Firmware vorgeladen, um für das beabsichtigte Experiment benötigte Sequenzen und Instrumentenparameter spezifisch zu scannen.
Massenspektrometrie. Alle Experimente fanden auf Thermo LTQ Orbitrap Velos- und Q-Exactive-Massenspektrometern statt. LTQ Orbitrap Velos verwendete Firmware Version 2.6.0.1065 SP3 mit zusätzlichen ITCL-(lonenfallen-Steuersprache)-Modifikationen, um einen inSeq-Betrieb zu ermöglichen. MS1-Scans wurden im Orbitrap mit einer Auflösung von 30.000 bei maximaler Injektionszeit von 500 ms und einem Zielwert von 1e6 durchgeführt. MS2-Scans wurden ebenfalls im Orbitrap mit einer Auflösung von 7500 und mit einer normalisierten HCD-Stoßenergie (NCE) von 27 % für eine maximale Füllzeit von 500 ms durchgeführt. Q-Exactive wurde mit Version 2.0 Build 142800 mit einer modifizierten Python-Codebasis für inSeq-Datenerfassungssteuerung betrieben. Q-Exactive-MS1-Scans wurden mit einer Auflösung von 70.000 für eine maximale Injektionszeit von 120 ms oder bis zum Erreichen des AGC-Zielwertes von 1e6 gesammelt. MS2-Ereignisse wurden mit einer Auflösung von 17.500 bei einem Zielwert von 1e5, einer maximalen Injektionszeit von 120 ms und 26 % NCE gemessen. Instrumentenverfahren für sowohl LTQ Orbitrap Velos als auch Q-Exactive wurden bei der Erfassung durch die Firmware des Instruments umgangen, um einen dynamischen inSeq-Betrieb zu erzielen.
Datenbanksuche und FDR-Schätzung. MS/MS-Daten wurden mit der Coon OMSSA Proteomics Software Suite (COMPASS) analysiert (38). Der Open Mass Spectrometry Search Algorithm (OMSSA; Version 2.1.8) wurde zum Durchsuchen von Spektren anhand der International Protein Index (IPI)-Humandatenbank Version 3.85 verwendet (39). Die Vorläufermassentoleranz wurde auf ± 4,5 Da gesetzt und die monoisotopische Massentoleranz wurde auf ± 0,015 Da für Fragment-Ionen gesetzt. Für alle Experimente wurde Carbamidomethylierung von Cysteinen als feste Modifikation einbezogen, während die Oxidation von Methioninen als variable Modifikation genommen wurde. Für TMT-Experimente wurden TMT auf dem N-Terminus und TMT auf Lysinen als feste Modifikationen einbezogen und TMT auf Tyrosinen wurde als variable Modifikation hinzugefügt. Für SILAC-Experimente wurde schweres Lysin als variable Modifikation hinzugefügt. Die Ergebnisse wurden auf 1 % FDR auf sowohl Peptid- als auch Proteinebene gefiltert. Für Phosphopeptide wurde die Phosphinator-Software zum Lokalisieren der Phosphorylierungsstellen verwendet (30).
Protein- und Peptidquantifizierung. Eine TMT-Quantifizierung wurde mit TagQuant in COMPASS durchgeführt. Dieses Programm extrahiert Reporter-Ionen-Intensitäten, multipliziert sie mit Injektionszeiten, um Zahlen zu ermitteln. Eine Reinheitskorrektur fand wie zuvor beschrieben statt. Tag-Intensitäten wurden normalisiert, um sicherzustellen, dass das Gesamtsignal von jedem Kanal gleich war. Zur Beurteilung von mehreren QuantMode-(QM)-Scans wurden Daten auf Peptidebene analysiert, indem nur der erste, die Summe aus erstem und zweitem oder die Summe aus erstem, zweitem und drittem QM-Scan mit TagQuant quantifiziert wurde. Peptide wurden dann zu Proteingruppen kombiniert (ProteinHerder) und auf Proteinebene (ProteinTagQuant) in COMPASS quantifiziert. Experimentelle Verhältnisse und p-Werte (Student-t-Test unter Annahme einer gleichen Varianz) wurden mit Microsoft Excel bestimmt. Für eine Korrektur im Hinblick auf mehrfache Hypothesetests wurde eine Storey-Korrektur mit dem frei verfügbaren Programm QVALUE angewendet (34).
SILAC-Quantifizierung wurde mit hauseigener Software durchgeführt, die die Peak-Intensitäten beider SILAC-Partner entweder von einem einzigen durch inSeq ausgelösten SIM-Scan (monoisotopischer Peak) abrief oder ein extrahiertes lonenchromatogramm (30-sec-Fenster) eines identifizierten Vorläufers ausführte. Ein Partnerabundanzverhältnis wurde nur dann berechnet, wenn beide SILAC-Partner eine Intensität von wenigstens dem Zweifachen von der des Rauschpegels hatten.
PRM: Testen der Detektionsfähigkeiten. Nachdem demonstriert wurde, dass mehrere Peptide gleichzeitig mit durch inSeq ausgelöstem PRM targetiert werden können, während eine normale Erfassung des DDA-Typs beibehalten wird, wurde untersucht, wie das inSeq-Verfahren im Vergleich zu normaler DDA-Erfassung abschnitt. inSeq-PRM wurde auf der Q-Exactive-Vorrichtung durchgeführt, um die Detektionsfähigkeiten des Systems zu testen. Fünfundzwanzig humane schwere AQUA™-Peptide (Sigma-Aldrich) wurden in eine 1 µg/µl Hefe-Hintergrundmatrix gespickt. Zwei fmol der Peptide wurden auf eine Säule geladen und mit inSeq-PRM targetiert. Acht dieser Peptide wurden mit 5 HCD-Scans (1 Hz/Peptid, 2,0 TH), gefolgt von 1 SIM für den gesamten Durchlauf (90 min, 0,2 Hz/Peptid, 3,0 TH Iso) targetiert (23). In 23 sind die resultierenden SIM- und PRM- extrahierten lonenchromatogramme (XIC) bei 10 ppm für diese Peptide dargestellt. Mit inSeq konnte jedes der 8 Peptide bei 2 fmol detektiert werden (Peptidspektralabgleich durch OMSSA bei 1 % FDR), während nur 1 bis 3 dieser Peptide bei 2 fmol mit datenabhängiger Top-10-Erfassung (DDA) detektiert wurden.
inSEQ: Sofortige Sequenzbestätigung
Die 25-30 zeigen schematische Schritte 1-6 für eine sofortige Sequenzbestätigung mit inSeq. In Schritt 1 wird eine Liste von Peptidtargets anhand vorheriger DDA-Experimente erstellt und nach Elutionsreihenfolge (CEO) sortiert. Wie in der in 25 gezeigten Teilliste illustriert, kann die komplette Liste ein oder mehrere Targetpeptide enthalten, wie z.B. die acht AQUA™-Peptide aus den vorherigen Experimenten. In Schritt 2 wird eine DDA mit einer Einschlussliste von der in das Instrument geladenen Liste von Peptiden durchgeführt (26). Die Peptide, die mit inSeq identifiziert werden, können zum Aktualisieren des CEO-Fensters verwendet werden. In Schritt 3 wird der PRM-Zyklus für ein Targetpeptid eingeleitet, wenn sich die durchschnittliche CEO der CEO für dieses Target nähert (27). In Schritt 4 werden PRM-Scans mit einer regelmäßigen Frequenz (z.B. 0,5 Hz) für einen festgelegten Zeitraum gestartet (28). In Schritt 5 wird mit dem DDA-Scan fortgefahren, um das CEO-Fenster zu aktualisieren, sobald die Vorrichtung für den Start zusätzlicher Scans verfügbar ist (29). In Schritt 6 wird der Vorgang wiederholt und DDA wird mit der Einschlussliste durchgeführt, bis sich das nächste Target dem CEO-Fenster für dieses Target nähert, wobei ein neuer PRM-Zyklus gestartet wird (30). Idealerweise wird das Abtasten früh genug begonnen, um die gesamte Peptidelution zu erfassen.
inSeq-Implementation und Datenstrukturen
31 zeigt ein ausführliches Flussdiagramm, das die Arbeitsschritte eines EchtzeitinSeq-Prozesses zeigt. Der in dieser Figur dargestellte Prozess enthält zwei Datenstrukturen zum Speichern von anstehenden Scans, die vom Massenspektrometer durchzuführen sind: 1) eine Scan-Queue-(SQ)-Datenstruktur und 2) eine Echtzeit-Heap-(rtHeap)-Datenstruktur.
SQ ist eine FIFO-(First In - First Out)-Warteschlange, bei der der erste zur Warteschlange hinzugefügte Scan auch der erste entfernte Scan ist. Zu Beginn des Experiments ist der einzige in der SQ gespeicherte Scan ein MS¹-Scan. Nach einem MS¹-Ereignis, bei dem es sich um den anfänglichen MS¹-Scan oder einen nachfolgenden MS¹-Scan handeln kann, werden die höchsten Peaks von dem MS¹-Scan ausgewählt und ein neuer Scan wird für jeden gewählten Peak erzeugt. Jeder neu erzeugte Scan wird an das Ende der SQ angefügt. Der MS¹-Scan selbst wird dann an das Ende der Warteschlange gesetzt, so dass sich der Prozess wiederholen kann, bis das Experiment den Endzeitpunkt erreicht.
Im Gegensatz dazu speichert rtHeap Scans auf sortierte Weise. Wenn neue Scans zur Warteschlange hinzugefügt werden, werden sie nach ihrer Retentionszeit in der Warteschlange positioniert. Der Scan mit der geringsten Retentionszeit wird an den Anfang der Warteschlange gesetzt. Wenn die Retentionszeit des Experiments den Wert im tp-Scan im rtHeap übersteigt, dann wird der oberste Scan entfernt und sofort ausgeführt. Scans in der rtHeap-Warteschlange erhalten Vorrang gegenüber Scans in der SQ, d.h. werden vor diesen ausgeführt. Wenn die rtHeap-Warteschlange leer ist, geht das System zum obersten Scan in der SQ über. Wenn der SQ-Scan in einer MS/MS-Analyse resultiert und ein neues Target identifiziert wird, dann fügt das System das Target zur rtHeap hinzu, wenn festgestellt wird, dass sich das Target im aktuellen CEO-Fenster befindet.
LITERATURQUELLEN FÜR BEISPIEL 3

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AUSSAGEN IN BEZUG AUF DEN EINSCHLUSS DURCH BEZUGNAHME UND VARIATIONEN
Jede hierbei angegebene Referenz ist in ihrer Gesamtheit hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen. Wenn jedoch Uneinheitlichkeiten zwischen einer angegebenen Referenz und der vorliegenden Offenbarung entstehen, dann hat die vorliegende Offenbarung Vorrang. Einige hierbei angegebene Referenzen sind durch Bezugnahme eingeschlossen, um Einzelheiten in Bezug auf den Stand der Technik vor der Einreichung der vorliegenden Anmeldung zu geben, andere Referenzen wurden möglicherweise angegeben, um zusätzliche oder alternative Vorrichtungselemente, zusätzliche oder alternative Materialien, zusätzliche oder alternative Analyseverfahren oder Anwendungen der Erfindung zu geben. In der Spezifikation erwähnte Patente und Veröffentlichungen lassen auf das Kompetenzniveau der Fachperson schließen, an die die Erfindung gerichtet ist. Hierbei angegebene Referenzen sind in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen, um den Stand der Technik an ihrem Veröffentlichungs- oder Einreichungsdatum anzuzeigen, und diese Informationen können, falls benötigt, hierbei benutzt werden, um spezifische Ausgestaltungen auszuschließen, die zum Stand der Technik gehören.
Die provisorische US-Patentanmeldung Nr. 61/471,464 , eingereicht am 4. April 2011, ist hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme in dem Ausmaß eingeschlossen, in dem sie nicht mit der vorliegenden Beschreibung inkonsistent ist.
Die hierbei verwendeten Begriffe und Ausdrücke werden zur Beschreibung und nicht zur Begrenzung benutzt, und durch die Verwendung solcher Begriffe und Ausdrücke sollen keine Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon ausgeschlossen werden, sondern es wird erkannt, dass verschiedene Modifikationen im Rahmen der beanspruchten Erfindung möglich sind. So ist es zu verstehen, dass die Erfindung zwar speziell durch bevorzugte Ausgestaltungen, beispielhafte Ausgestaltungen und optionale Merkmale offenbart wurde, die Fachperson aber auf Modifikationen und Variationen der hierbei offenbarten Konzepte zurückgreifen kann, und solche Modifikationen und Variationen werden als in den Umfang der vorliegenden Erfindung, wie durch die beiliegenden Ansprüche definiert, fallend angesehen. Die hierbei gegebenen spezifischen Ausgestaltungen sind Beispiele für nützliche Ausgestaltungen der Erfindung, und es wird für die Fachperson offensichtlich sein, dass die Erfindung mit einer großen Zahl von Variationen der Vorrichtungen, Vorrichtungskomponenten und Verfahrensschritten, wie in der vorliegenden Beschreibung dargelegt, durchgeführt werden kann. Es wird für die Fachperson offensichtlich sein, dass für die vorliegenden Verfahren nützliche Verfahren und Vorrichtungen eine große Zahl von optionalen Zusammensetzungs- und Verarbeitungselementen und -schritten beinhalten können.
Die durchschnittliche Fachperson wird erkennen, dass andere Vorrichtungselemente sowie Materialien, Formen und Abmessungen von Vorrichtungselementen sowie andere Verfahren als die speziell exemplifizierten in der Umsetzung der Erfindung ohne unzumutbares Experimentieren verwendet werden können. Alle in der Technik bekannten funktionellen Äquivalente solcher Materialien und Verfahren sollen als in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen angesehen werden. Die verwendeten Begriffe und Ausdrücke werden zur Beschreibung und nicht zur Begrenzung benutzt, und durch die Verwendung solcher Begriffe und Ausdrücke sollen keine Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon ausgeschlossen werden, sondern es wird erkannt, dass verschiedene Modifikationen im Rahmen der beanspruchten Erfindung möglich sind. So ist es zu verstehen, dass die vorliegende Erfindung zwar speziell durch bevorzugte Ausgestaltungen und optionale Merkmale offenbart wurde, die Fachperson aber auf Modifikationen und Variationen der hierbei offenbarten Konzepte zurückgreifen kann, und solche Modifikationen und Variationen werden als in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallend angesehen.
Wenn eine Markush-Gruppe oder eine andere Gruppierung hierbei verwendet wird, dann sollen alle individuellen Mitglieder der Gruppe und alle Kombinationen und möglichen Subkombinationen der Gruppe individuell in der Offenbarung eingeschlossen sein. Wenn nicht anders angegeben, dann können alle hierbei beschriebenen oder exemplifizierten Kombinationen von Komponenten oder Materialien zur Umsetzung der Erfindung genutzt werden. Die durchschnittliche Fachperson wird erkennen, dass andere als die speziell exemplifizierten Verfahren, Vorrichtungselemente und Materialien bei der Umsetzung der Erfindung ohne unzumutbares Experimentieren verwendet werden können. Alle in der Technik bekannten funktionellen Äquivalente solcher Verfahren, Vorrichtungselemente und Materialien sollen als in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen angesehen werden. Wo immer in der Spezifikation ein Bereich angegeben wird, z.B. ein Temperaturbereich, ein Frequenzbereich, ein Zeitbereich oder ein Zusammensetzungsbereich, sollen auch alle Zwischenbereiche und alle Unterbereiche sowie alle individuellen Werte, die in den angegebenen Bereichen eingeschlossen sind, als in die Offenbarung fallend angesehen werden. Ein oder mehrere individuelle Mitglieder eines/einer hierbei offenbarten Bereichs oder Gruppe können aus einem Anspruch der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen werden. Die hierbei auf geeignete Weise illustrativ beschriebene Erfindung kann in Abwesenheit von (einem) Element(en), (einer) Begrenzung(en) umgesetzt werden, die hierbei nicht speziell offenbart sind.
Das hierbei verwendete Wort „umfassend“ ist mit „einschließlich“, „enthaltend“ oder „gekennzeichnet durch“ synonym und ist inklusiv und nicht auschließlich und schließt zusätzliche, nicht erwähnte Elemente oder Verfahrensschritte nicht aus. Der hierbei verwendete Begriff „bestehend aus“ schließt jedes Element, jeden Schritt oder jeden Bestandteil aus, das/der in dem Anspruchselement nicht angegeben ist. Der hierbei verwendete Begriff „im Wesentlichen bestehend aus“ schließt keine Materialien oder Schritte aus, die die grundlegenden und neuartigen Charakteristiken des Anspruchs nicht wesentlich beeinflussen. Der Begriff „umfassend“ soll weiter sein als die Begriffe „im Wesentlichen bestehend aus“ und „bestehend aus“, allerdings soll der hierbei verwendete Begriff „umfassend“ in seinem weitesten Sinne auch die engeren Begriffe „im Wesentlichen bestehend aus“ und „bestehend aus“ umschließen, und so kann der Begriff „umfassend“ durch „im Wesentlichen bestehend aus“ ersetzt werden, um Schritte auszuschließen, die die grundlegenden und neuartigen Charakteristiken der Ansprüche nicht wesentlich beeinflussen, und „umfassend“ kann durch „bestehend aus“ ersetzt werden, um nicht angegebene Anspruchselemente auszuschließen.
Die verwendeten Begriffe und Ausdrücke werden zur Beschreibung und nicht zur Begrenzung benutzt, und durch die Verwendung solcher Begriffe und Ausdrücke sollen keine Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon ausgeschlossen werden, sondern es wird erkannt, dass verschiedene Modifikationen im Rahmen der beanspruchten Erfindung möglich sind. So ist es zu verstehen, dass die vorliegende Erfindung zwar speziell durch bevorzugte Ausgestaltungen und optionale Merkmale offenbart wurde, die Fachperson aber auf Modifikationen und Variationen der hierbei offenbarten Konzepte zurückgreifen kann, und solche Modifikationen und Variationen werden als in den Umfang der vorliegenden Erfindung, wie durch die beiliegenden Ansprüche definiert, fallend angesehen.
Die Beschreibung hierbei enthält zwar viele spezifische Angaben, diese sind aber nicht als den Umfang der Erfindung begrenzend anzusehen, sondern veranschaulichen lediglich einige der Ausgestaltungen der Erfindung.

Claims

Verfahren zum Identifizieren oder Quantifizieren eines Analyten in einer Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Bereitstellen einer Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen, wobei die Liste 25 bis 5.000.000 Targetanalyten enthält; (b) Berechnen einer Chromatographiesäulen-Elutionsreihenfolge des Analyten in der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen, um dadurch eine Elutionsreihenfolgeliste zu erzeugen; (c) Sortieren der Elutionsreihenfolgeliste vom ersten eluierenden Analyten bis zum letzten eluierenden Analyten, um dadurch eine sortierte Elutionsreihenfolgeliste zu erzeugen; (d) Bereitstellen einer einen Analyten enthaltenden Probe; (e) Fraktionieren der Probe mit einer Chromatographiesäule; (f) Erzeugen einer Verteilung von Vorläuferanalyt-Ionen aus der fraktionierten Probe mittels Elektrospray-Ionisation oder matrixgestützter Laser-Desorption-/Ionisation (MALDI); (g) Fragmentieren von Vorläuferanalyt-Ionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen; (h) Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Produkt-Ionen in einem Massenanalysegerät, wobei das Massenanalysegerät eine Massengenauigkeit von wenigstens 1000 ppm hat, um dadurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; und (i) Anwenden eines Artificial- Intelligence-Algorithmus zum Identifizieren von Targetanalyt-Produktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Targetanalyten entsprechen, um dadurch einen Targetanalyten zu identifizieren; Vergleichen des identifizierten Targetanalyten mit der sortierten Elutionsreihenfolgeliste bei der Datenerfassung; und (j) Identifizieren von einem oder mehreren Targetanalyten aus der sortierten Elutionsreihenfolgeliste, die innerhalb von X Analyten des identifizierten Analyten sind, wobei X gleich 20 % der Gesamtzahl der Targetanalyten in der Elutionsreihenfolgeliste ist, um dadurch eine Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten zu erzeugen; um dadurch einen Analyten in der Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie zu identifizieren oder zu quantifizieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei: die Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen Targetpeptide und Targetpeptid-Produktinformationen umfasst, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen; der Analyt Peptide umfasst, die Proteinen entsprechen; und der Schritt des (g) Fragmentierens von Vorläuferanalyt-Ionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen, das Fragmentieren von Vorläuferpeptid-Ionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen beinhaltet, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 2, das ferner Folgendes beinhaltet: Identifizieren von Targetpeptiden oder Peptidproduktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Targetpeptid entsprechen, um dadurch ein Targetpeptid zu identifizieren; und Entfernen des identifizierten Targetpeptids oder der Peptidproduktinformationen aus der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen, das einem oder mehreren Proteinen entspricht, bei der Datenerfassung.
Verfahren nach Anspruch 2, das ferner Folgendes umfasst: Auswählen eines Targetpeptids mit einer oder mehreren post-translationalen Modifikationsstellen; Vergleichen der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, um zu ermitteln, ob die Stellen des Targetpeptids mit einer oder mehreren post-translationalen Modifikationen eindeutig identifiziert werden können; und Einstellen eines Fragmentierungsparameters bei der Datenerfassung, bis Stellen des Targetpeptids mit den ein oder mehreren post-translationalen Modifikationen eindeutig identifiziert werden können; wobei der Fragmentierungsparameter Fragmentierungsdruck, Gas, Elektronenenergie, Wellenlänge von elektromagnetischer Strahlung, Leistung von elektromagnetischer Strahlung, Beleuchtungszeit von elektromagnetischer Strahlung, Fluss von elektromagnetischer Strahlung, Gesamtdosis an elektromagnetischer Strahlung, Stoßenergie oder Reaktionszeit entspricht.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner Folgendes umfasst: Identifizieren von einem oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten bei der Datenerfassung; Auswählen eines Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von Vorläufer-Ionen, die den ein oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten entsprechen; und Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse des Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, die den ein oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten entsprechen, um dadurch Vorläufer-Massenspektrometriedaten zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner Folgendes umfasst: Identifizieren von einem oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten bei der Datenerfassung; wobei in Schritt (g) die Vorläuferanalytionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen den ein oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten entsprechen.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner Folgendes umfasst: Identifizieren von einem oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten bei der Datenerfassung; Auswählen eines Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von Vorläufer-Ionen, die den ein oder mehreren Analyten in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten entsprechen; Fragmentieren von Vorläufer-Ionen mit Masse-zu-Ladung-Verhältnissen in dem gewählten Bereich von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; und Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der fragmentierten Vorläufer-Ionen, um dadurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von mehreren Produkt-Ionen gleichzeitig gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die mehreren Produkt-Ionen von verschiedenen Vorläuferanalytionen erzeugt werden.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, das ferner Folgendes umfasst: Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferanalytionen, um dadurch Vorläuferanalytionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; und Optimieren der Analytidentifizierung oder -quantifizierung bei der Datenerfassung durch Vergleichen der Vorläuferanalytionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen, wobei die genannte Liste ferner Targetanalyt-Vorläuferioneninformationen und Landmark-Vorläuferionensignalinformationen umfasst.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, das ferner Folgendes umfasst: Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse eines Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, die der Verteilung von Vorläuferanalytionen entsprechen, um dadurch Vorläufer-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; Ermitteln eines Signal-Rausch-Verhältnisses von zwei oder mehr Peaks in den Vorläufer-Massenspektrometriedaten, die einem oder mehreren Analyten in der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produkten entsprechen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, bei der Datenerfassung; wobei wenigstens einer der zwei oder mehr Peaks in den Vorläufer-Massenspektrometriedaten, die einem oder mehreren Analyten entsprechen, einem markierten Analyten entspricht und wenigstens einer einem unmarkierten Analyten entspricht; und Wiederholen der Schritte (f) - (j), wenn das Signal-Rausch-Verhältnis des am wenigsten intensiven der zwei oder mehr Peaks in den Vorläufer-Massenspektrometriedaten, die einem oder mehreren Analyten in der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produkten entsprechen, kleiner als 2:1 ist.
Massenspektrometersystem zum Analysieren eines Analyten, wobei das System Folgendes umfasst: eine lonenquelle zum Erzeugen von Ionen von dem Analyten; erste lonentrennoptik in Verbindung mit der lonenquelle zum Trennen von Ionen gemäß ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; lonenfragmentierungsoptik in Verbindung mit der ersten lonentrennoptik zum Erzeugen von Produkt-Ionen; ein Massenanalysegerät in Verbindung mit der lonenfragmentierungsoptik zum Trennen von Ionen gemäß ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; wobei das Massenanalysegerät einen Ionendetektor zum Detektieren von Ionen umfasst, die gemäß ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen getrennt wurden; eine Chromatographiesäule in Verbindung mit der lonenquelle zum Fraktionieren der Probe; eine Steuerung, die funktionell mit der ersten und der zweiten lonentrennoptik, dem ersten lonendetektor und der lonenfragmentierungsoptik verbunden ist; wobei die Steuerung ein Speichermodul umfasst; wobei die Steuerung das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor steuert, um: (a) eine Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen im Speichermodul zu empfangen, wobei die Liste 25 bis 5.000.000 Targetanalyten enthält; (b) eine Chromatographiesäulen-Elutionsreihenfolge der Peptide in der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen zu berechnen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, um dadurch eine Elutionsreihenfolgeliste zu erzeugen; (c) die Elutionsreihenfolgeliste vom ersten eluierenden Peptid bis zum letzten eluierenden Peptid zu sortieren, um dadurch eine sortierte Elutionsreihenfolgeliste zu erzeugen; (d) eine einen Analyten enthaltende Probe bereitzustellen; (e) die Probe mit der Chromatographiesäule vor dem Erzeugen einer Verteilung von Vorläuferpeptidionen aus der Probe zu fraktionieren; (f) eine Verteilung von Vorläuferanalytionen aus der Probe zu erzeugen; (g) Vorläuferanalytionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen zu fragmentieren, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen; (h) die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Produkt-Ionen in dem Massenanalysegerät zu messen, wobei das Massenanalysegerät eine Massengenauigkeit von wenigstens 1000 ppm hat, um dadurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; und wobei (i) eine Artificial- Intelligence-Algorithmus angewendet wird zum Identifizieren von Targetanalyt-Produktinformationen in den Produktlonen-Massenspektrometriedaten, die einem Targetanalyten entsprechen, um dadurch einen Targetanalyten zu identifizieren; und wobei der identifizierte Targetanalyte mit der sortierten Elutionsreihenfolgeliste bei der Datenerfassung verglichen wird; und wobei (j) ein oder mehrere Targetanalyten aus der sortierten Elutionsreihenfolgeliste identifiziert wird, die innerhalb von X Analyten des identifizierten Analyten sind, wobei X gleich 20 % der Gesamtzahl der Targetanalyten in der Elutionsreihenfolgeliste ist, um dadurch eine Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Analyten zu erzeugen.
System nach Anspruch 12, wobei die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät, die Chromatographiesäule und den Detektor steuert, um: ein oder mehrere Peptide in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide bei der Datenerfassung zu identifizeren; einen Bereich von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von Vorläufer-Ionen auszuwählen, die den ein oder mehreren Peptiden in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide entsprechen; und die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse des Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen zu messen, die den ein oder mehreren Peptiden in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide entsprechen, um dadurch Vorläufermassenspektrometriedaten zu erzeugen.
System nach Anspruch 12, wobei die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät, die Chromatographiesäule und den Detektor steuert, um: ein oder mehrere Peptide in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide bei der Datenerfassung zu identifizieren; wobei in Schritt (g) die Vorläuferpeptidionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen den ein oder mehreren Peptiden in der Liste der nächsten vorhergesagten eluierenden Peptide entsprechen.
System nach Anspruch 14, wobei die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor steuert, um: Targetanalyt-Produktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu identifizieren, die einem Targetanalyten entsprechen, um dadurch einen Targetanalyten zu identifizieren; und den identifizierten Targetanalyten aus der Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen bei der Datenerfassung zu entfernen.
System nach einem der vorherigen Ansprüche 12-15, wobei die Steuerung ferner das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor steuert, um: Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen zur Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen bei der Datenerfassung hinzuzufügen.
System nach einem der vorherigen Ansprüche 12-16, wobei die Steuerung das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor steuert, um die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von mehreren Produkt-Ionen gleichzeitig zu messen.
System nach einem der vorherigen Ansprüche 12-17, wobei die Steuerung das Speichermodul, die lonenoptik, das Massenanalysegerät und den Detektor steuert, um mehrere Vorläuferanalytionen zu fragmentieren, um Produkt-Ionen zu erzeugen, wobei die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der von den mehreren Vorläuferanalytionen erzeugten Produkt-Ionen gleichzeitig gemessen werden.
Verfahren zum Identifizieren oder Quantifizieren eines Analyten in einer Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Bereitstellen einer Liste von Targetpeptiden, wobei die Targetliste 25 bis 5.000.000 Targetpeptide umfasst; (b) Berechnen einer Chromatographiesäulen-Elutionsreihenfolge und Elutionszeit der Peptide in der Liste von Targetpeptiden, um dadurch eine Elutionsreihenfolgeliste und vorhergesagte Elutionszeiten für jedes Targetpeptid zu erzeugen; (c) Sortieren der Elutionsreihenfolgeliste vom ersten eluierenden Peptid bis zum letzten eluierenden Peptid, um dadurch eine sortierte Elutionsreihenfolgeliste zu erzeugen; (d) Bereitstellen einer einen Analyten enthaltenden Probe, wobei der genannte Analyt Peptide umfasst, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen; (e) Erzeugen einer Verteilung von Vorläuferanalytionen aus der Probe zu Elutionszeiten, die den vorhergesagten Elutionszeiten für die Targetpeptide entsprechen, wobei die genannten Analyt-Ionen Peptid-Ionen umfassen; (f) Fragmentieren von Vorläuferanalytionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferanalytionen, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen; (g) Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Produkt-Ionen, die in einem Massenanalysegerät gesammelt wurden, wobei das Massenanalysegerät eine Massengenauigkeit von wenigstens 1000 ppm hat, um dadurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; und (h) Identifizieren von Targetpeptiden oder Peptidproduktinformationen in den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, die einem Targetpeptid entsprechen, durch Anwenden eines Artificial- Intelligence-Algorithmus zum Vergleichen der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten mit der Liste von Targetpeptiden und Targetpeptid-Produktinformationen und zum Durchführen einer positiven Identifikation aus den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten. , um dadurch einen Analyten in der Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie zu identifizieren oder zu quantifizieren.
Verfahren nach Anspruch 19, das ferner das Ausführen von einem oder mehreren datenabhängigen Erfassungs-Scans umfasst, die Folgendes umfassen: Erzeugen einer zweiten Verteilung von Vorläuferanalytionen aus der Probe, wobei die Elutionszeiten der zweiten Verteilung von Vorläuferanalytionen nicht mit den vorhergesagten Elutionszeiten für die Targetpeptide korrelieren; Fragmentieren von Vorläuferanalytionen von wenigstens einem Teil der zweiten Verteilung von Vorläuferanalytionen, um dadurch einen zweiten Satz von Produkt-Ionen zu erzeugen; und Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse des zweiten Satzes von Produkt-Ionen, um dadurch datenabhängige Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 20, das ferner Folgendes umfasst: (i) Identifizieren von einem oder mehreren Peptiden in der sortierten Elutionsliste als Peptide, deren Elution als nächstes vorhergesagt wurde, bei der Datenerfassung; (j) Auswählen eines Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von Vorläufer-Ionen, die den ein oder mehreren Peptiden entsprechen, deren Elution als nächstes vorhergesagt wurde; und (k) Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse des Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, die den ein oder mehreren Peptiden entsprechen, deren Elution als nächstes vorhergesagt wurde, um dadurch Vorläufermassenspektrometriedaten zu erzeugen.
Verfahren zum Identifizieren oder Quantifizieren eines Analyten in einer Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Erzeugen einer Sequenzierungswarteschlange, die einen auszuführenden MS1-Scan und ein oder mehrere auszuführende Massenspektrometrie-Scans enthält, wobei die genannten auszuführenden Massenspektrometrie-Scans in der Sequenzierungswarteschlange mit Analyt-Ionenpeaks mit einer vorhergesagten Elutionszeit korrelieren und der genannte MS1-Scan nicht mit einer Elutionszeit assoziiert ist; (b) Erzeugen einer Echtzeit-Heap-Warteschlange, die ein oder mehrere auszuführende Target-Scans enthält, wobei die genannten auszuführenden Target-Scans mit Peptiden oder Targetpeptiden mit einer vorhergesagten Elutionszeit korrelieren, wobei immer dann, wenn ein neuer Massenspektrometrie-Scan oder Target-Scan auszuführen ist, Target-Scans in der Echtzeit-Heap-Warteschlange vor Massenspektrometrie-Scans aus der Sequenzierungswarteschlange ausgeführt werden; (c) Bereitstellen einer einen Analyten enthaltenden Probe; (d) Ausführen des MS1-Scans, wenn keine anderen Scans in der Sequenzierungswarteschlange oder der Echtzeit-Heap-Warteschlange vorhanden sind, wobei das Ausführen des MS1-Scans das Erzeugen einer Verteilung von Vorläuferanalytionen aus der Probe und das Messen von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von wenigstens einem Teil der Produkt-Ionen in einem Massenanalysegerät beinhaltet, um dadurch ein oder mehrere Analyt-Ionenpeaks zu erzeugen; (e) Auswählen von einem oder mehreren Analyt-Ionenpeaks, Erzeugen eines neuen Massenspektrometrie-Scans, der jedem der gewählten Analyt-Ionenpeaks entspricht, und Hinzufügen des neuen Massenspektrometrie-Scans zur Sequenzierungswarteschlange; (f) Ausführen von einem oder mehreren Massenspektrometrie-Scans aus der Sequenzierungswarteschlange, wobei Massenspektrometrie-Scans, die vor kürzerer Zeit der Sequenzierungswarteschlange hinzugefügt wurden, nach Massenspektrometrie-Scans ausgeführt werden, die der Sequenzierungswarteschlange früher hinzugefügt wurden, wobei das Ausführen von einem oder mehreren Massenspektrometrie-Scans Folgendes umfasst: (i) Fragmentieren von Vorläuferanalytionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen; (ii) Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Produkt-Ionen in einem Massenanalysegerät, um dadurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; (g) Identifizieren eines Targetanalyten aus den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, Berechnen einer Elutionszeit für den Targetanalyten, Erzeugen eines neuen Target-Scans, der dem Targetanalyten und der berechneten Elutionszeit entspricht, und Hinzufügen des neuen Target-Scans zur Echtzeit-Heap-Warteschlange; (h) Ausführen von einem oder mehreren Target-Scans aus der Echtzeit-Heap-Warteschlange, wobei Target-Scans zu Elutionszeiten ausgeführt werden, die den berechneten Elutionszeiten für die Targetanalyten entsprechen, wobei das Ausführen von einem oder mehreren Target-Scans Folgendes umfasst: (i) Fragmentieren von Vorläuferanalytionen mit einer vorgewählten Verteilung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen, um dadurch Produkt-Ionen zu erzeugen; (ii) Messen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Produkt-Ionen in dem Massenanalysegerät, um dadurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten zu erzeugen; und (iii) Anwenden eines Artificial- Intelligence-Algorithmus zum Vergleichen von Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten mit einer Liste von Targetanalyten und Targetanalyt-Produktinformationen und zum Durchführen einer positiven Identifikation aus den Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten; um dadurch einen Analyten in der Probe unter Anwendung von Massenspektrometrie zu identifizieren oder zu quantifizieren.