JP6136771B2 - 物質同定方法及び該方法を用いる質量分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、ＭＳⁿ測定（ただしｎは２以上の整数）を行うことが可能な質量分析装置を用いて試料に含まれる物質を同定する物質同定方法、及び、該方法を用いて試料中の物質を同定する質量分析装置に関する。

生命科学の研究や医療、医薬品開発などの分野においては、生体試料を対象として、タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖など様々な物質を網羅的に同定することがますます重要になってきている。特にタンパク質やペプチドを対象とするこうした網羅的な解析手法はショットガン・プロテオミクス（Shotgun Proteomics）と呼ばれている。こうした解析のためには、ＬＣ（液体クロマトグラフ）やＣＥ（キャピラリ電気泳動）などのクロマトグラフィと、ＭＳⁿ型質量分析装置（タンデム型質量分析装置）とを組み合わせた分析手法が非常に威力を発揮している。

ＭＳⁿ型質量分析装置を用いた生体試料中の各種物質の一般的な網羅的同定法の手順は次のとおりである。
［ステップ１］分析対象である試料に含まれる各種物質をＬＣ、ＣＥ等により分離し、その溶出液を分取・分画して多数のサンプルを調製する（以下、分取・分画により得られた個々のサンプルを「分画試料」と呼ぶ）。なお、試料を分取・分画する際には、予め決めた一定の時間間隔で分画を行う又は一定量の試料液を採取するように分画を行うことにより、該試料中の物質ができるだけ漏れなくいずれかの分画試料に含まれるようにする。

［ステップ２］各分画試料に対しＭＳ¹測定をそれぞれ行ってＭＳ¹スペクトルを取得し、該ＭＳ¹スペクトル上で同定対象の物質群に由来すると推測し得るピークを選択する。
［ステップ３］上記ステップ２で選択されたピークをプリカーサイオンに設定して当該分画試料に対しＭＳ²測定を実行し、その測定結果に基づくデータベース検索やデノボシーケシングサーチを行い、その分画試料に含まれる物質を同定する。

［ステップ４］充分な確度で特定の物質が同定されなかった場合には、ＭＳ¹スペクトル上で見つけた別のピークをプリカーサイオンに設定してＭＳ²測定を実行するか、或いは、ＭＳ²スペクトル上で観測される特定のイオンをプリカーサイオンとしたさらに高次（つまりｎが３以上）のＭＳⁿ測定を実行し、その測定結果に基づくデータベース検索やデノボシーケンスサーチなどにより、分画試料に含まれる物質を同定する。
［ステップ５］上記ステップ２〜４の処理を複数の分画試料に対してそれぞれ行い、元の試料に含まれている様々な物質を網羅的に同定する。

上記のような網羅的同定において、高い確度で以て物質を同定するには、同一の分画試料に含まれる物質の種数が少ない（できれば１種類のみである）ことが望ましい。しかしながら、そのためには１つの分画の時間を短くする必要があり、そうすると分画数自体が非常に多くなってしまう。そこで、限られた測定時間又は測定回数でできるだけ多くの物質を同定するためには、つまり、網羅的同定のスループットを向上させるためには、ＭＳ¹スペクトル上で観測される複数のピークの中で、同定に成功する確率（以下「同定確率」という）が高いピークを優先的にプリカーサイオンとして選択し且つ適切な測定条件で以てＭＳⁿ測定を行う必要がある。

或る試料に対して得られたＭＳ¹スペクトル上で観測されるピークの中からＭＳ²測定のためのプリカーサイオンを選択する方法としては、ピーク強度が高いものから順に選択する方法が従来知られている（特許文献１参照）。或る１つの試料に対してＭＳ²測定を実行する時間や回数に制約がある場合には、ピーク強度の高い順に所定個数のピークに対応するイオンをプリカーサイオンとして選択する等の制御が行われている。他方、測定時間又は測定回数が充分に確保できる場合には、プリカーサイオンの選択個数に制約を設けずに、信号強度が所定閾値以上であるピークを全て抽出してプリカーサイオンとする方法も知られている。

これらの方法はあくまでも、ピーク強度の高いイオンが同定確率が高いとの仮定に基づいていると考えられる。この仮定自体は定性的に誤りであるというわけではないが、ピーク強度の高さは必ずしも同定確率の高さを示すものではない。そのため、プリカーサイオン候補であるピークが複数存在するときに、いずれのピークでも同程度の高い確率で以て同定に至る場合と、一部のピークしか同定に至ることが期待できない場合とがあるが、ピーク強度からそうした状況の相違を充分に識別することはかなり困難である。

これに対し、本出願人は、ＭＳ²測定を実行する前にそのＭＳ²測定結果を利用した物質同定の確率を定量的に推定し、これを評価して同定される物質数の期待値を最大化するようにＭＳ²プリカーサイオンや測定条件を選択する新たな手法を特許文献２において提案している。これによれば、定量的な評価結果に基づいて、同定に至る確率が高い、より適切なピークをプリカーサイオンとして選択したり、より適切な順序で以て複数のピークをプリカーサイオンとして選択したりすることが可能である。

特許第３７６６３９１号公報 特開２０１３−１０１０３９号公報

ところで、ＬＣやＧＣで分離された成分を分取・分画する場合、一つの成分が連続する複数の分画に亘って含まれることがよくある。特に、一定の時間間隔でカラムからの溶出した試料液を分画する時間分画を行う場合、複数の分画試料に含まれる同成分の濃度が近いことがあり、その成分を同定するのにいずれの分画試料を用いるのが適切か判定する必要がある。
また、ＭＡＬＤＩ（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）イオン源を用いた質量分析装置では、レーザ光照射毎に生成される試料成分由来のイオンの量のばらつきが比較的多いため、同一試料に対する測定を複数回繰り返し、その複数回の測定結果を積算することで同定のためのスペクトルを算出する。その際、測定の繰り返し回数、つまりは積算回数を多くすれば、同定の精度は向上するもののそれだけ時間が掛かることになる。そこで、或る成分を同定しようとする際にＭＳ²プリカーサイオンの選択を最適化するだけでなく、積算回数も最適化することが好ましい。
特許文献２に記載された従来の手法では、こうした分画試料の最適な選択、或いは積算回数の最適化は考慮されておらず、それらについての最適な選択を行うことはできない。

本発明はこうした課題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、単なるプリカーサイオンの選択だけでなく、積算回数の最適化や分画試料の選択の最適化も行いつつ、試料中に含まれる多数の物質を効率的に、つまりはできるだけ少ない測定回数で以て又はできるだけ短い測定時間で以て得られた質量分析データに基づき高い確度で同定することができる、物質同定方法、及び該方法を用いる質量分析装置を提供することである。

上記課題を解決するために成された本発明の第１の態様による物質同定方法は、各種物質が含まれる試料を分離用パラメータに従って分離し分画することで得られた複数の分画試料に対しＭＳⁿ測定（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することで得られたＭＳⁿスペクトルに基づいて、各分画試料に含まれる物質を同定する物質同定方法であって、
a)所定の試料から得られた複数の分画試料に対するＭＳ^n-1測定により求まるＭＳ^n-1ピークのＳＮ比、及び該各ＭＳ^n-1ピークをプリカーサイオンとして実行されたＭＳⁿ測定の結果に基づく物質同定の結果を利用して、同種試料に由来するＭＳ^n-1ピークのＳＮ比と複数のＭＳ^n-1ピークをＳＮ比順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳⁿ測定及び同定を実行していったときに充分な確度で何らかの物質が同定できたピークの累積数との関係を示す同定確率推定モデルを求め、該同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶する同定確率推定モデル構築ステップと、
b)同定対象である目的試料から得られた時間的に連続する２以上の分画試料に対するＭＳ^n-1測定が終了した状況で、それらＭＳ^n-1測定により求まったＭＳ^n-1ピークの中でＭＳⁿ測定のためのプリカーサイオンの候補である複数のＭＳ^n-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出し、前記同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、前記プリカーサイオン候補である複数のＭＳ^n-1ピークのＳＮ比から各ＭＳ^n-1ピークの同定確率推定値を算出する同定確率推定ステップと、
c)同一のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定を複数回行ってその測定結果を積算したときの同定確率の改善度合を想定した上で、所定の複数の分画試料に対する全てのプリカーサイオン候補であるＭＳ^n-1ピークについて前記同定確率推定ステップにおいてそれぞれ推定された同定確率推定値に基づいて、ＭＳ^n-1ピークの選択の組み合わせを変えるとともに積算回数を１から所定回数まで変化させたときの同定確率の総和を最大化する目的関数を定め、少なくとも、前記所定の複数の分画試料に対するＭＳⁿ測定の実行回数の総和、及び、１つの分画試料に対するＭＳⁿ測定の実行回数の総和を制約条件として前記目的関数を最大化する解を求めることにより、ＭＳⁿ測定すべきＭＳ^n-1ピークと各ＭＳ^n-1ピークに対する積算回数を求める測定条件最適化ステップと、
を有することを特徴としている。

また上記課題を解決するために成された本発明の第２の態様による物質同定方法は、各種物質が含まれる試料を分離用パラメータに従って分離し分画することで得られた複数の分画試料に対しＭＳⁿ測定（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することで得られたＭＳⁿスペクトルに基づいて、各分画試料に含まれる物質を同定する物質同定方法であって、
a)所定の試料から得られた複数の分画試料に対するＭＳ^n-1測定により求まるＭＳ^n-1ピークのＳＮ比、及び該各ＭＳ^n-1ピークをプリカーサイオンとして実行されたＭＳⁿ測定の結果に基づく物質同定の結果を利用して、同種試料に由来するＭＳ^n-1ピークのＳＮ比と複数のＭＳ^n-1ピークをＳＮ比順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳⁿ測定及び同定を実行していったときに充分な確度で何らかの物質が同定できたピークの累積数との関係を示す同定確率推定モデルを求め、該同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶するステップであって、同一のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定を複数回行ってその測定結果を積算する回数を変えたときの物質同定の結果を利用して、積算回数毎の同定確率推定モデルを求め、該同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶する同定確率推定モデル構築ステップと、
b)同定対象である目的試料から得られた時間的に連続する２以上の分画試料に対するＭＳ^n-1測定が終了した状況で、それらＭＳ^n-1測定により求まったＭＳ^n-1ピークの中でＭＳⁿ測定のためのプリカーサイオンの候補である複数のＭＳ^n-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出し、前記同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、前記プリカーサイオン候補である複数のＭＳ^n-1ピークのＳＮ比から各ＭＳ^n-1ピークの同定確率推定値を積算回数毎に算出する同定確率推定ステップと、
c)所定の複数の分画試料に対する全てのプリカーサイオン候補であるＭＳ^n-1ピークについて前記同定確率推定ステップにおいてそれぞれ推定された同定確率推定値に基づいて、ＭＳ^n-1ピークの選択の組み合わせを変えるとともに積算回数を１から所定回数まで変化させたときの同定確率の総和を最大化する目的関数を定め、少なくとも、前記所定の複数の分画試料に対するＭＳⁿ測定の実行回数の総和、及び、１つの分画試料に対するＭＳⁿ測定の実行回数の総和を制約条件として前記目的関数を最大化する解を求めることにより、ＭＳⁿ測定すべきＭＳ^n-1ピークと各ＭＳ^n-1ピークに対する積算回数を求める測定条件最適化ステップと、
を有することを特徴としている。

本発明において、試料に含まれる各種物質を分離する手段はＬＣ、ＣＥなどである。該手段がＬＣなどカラムを用いたものである場合には、上記分離用パラメータとは時間（保持時間）である。即ち、或る１つの分画試料は所定の時間範囲内にカラムから溶出してきた１乃至複数の物質を含む。また、試料に含まれる各種物質を分離する手段がＣＥである場合には、上記分離用パラメータとは移動度である。

また、ＭＳⁿスペクトルに基づいて物質を同定する同定方法は特に限定されず、例えばデノボシーケンスサーチ、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ、など任意のアルゴリズムを用いることができる。ただし、同定確率推定モデル構築ステップ（及び手段）において同定を実行するときと、目的試料から得られた同定試料に対して同定を実行するときとでは、同じアルゴリズムを使用する必要がある。

本発明の第１の態様による物質同定方法において、同定確率推定モデル構築ステップでは、ＭＳ^n-1測定、ＭＳⁿ測定、及びその測定結果を利用した同定結果（同定の成否）が全て得られているデータを用いて、同定確率推定モデル情報を求める。同定確率推定モデルは、複数（通常はかなり多数）のＭＳ^n-1ピークのＳＮ比と、その複数のＭＳ^n-1ピークをＳＮ比の高い順又は低い順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳⁿ測定及び同定を実行していったときに充分な確度で何らかの物質が同定できた、つまりは同定に成功したピークの累積数と、の関係を示す。したがって、この同定確率推定モデルは、全てのＭＳ^n-1ピークの中で、或るＳＮ比を示す１つのＭＳ^n-1ピークよりもＳＮ比が高い又は低いＭＳ^n-1ピークが同定成功となる割合を示している。なお、或るＭＳ¹ピークのＳＮ比は、そのＭＳ¹ピークの信号強度と、該ピークが存在するＭＳ¹スペクトル（ノイズ除去などの加工がされていないプロファイル）から求めたノイズレベルとから求まるものとすることができる。

具体的には、複数のＭＳ^n-1ピークをＳＮ比の高い順又は低い順に１つずつ選択した累積数と、その中で同定に成功したＭＳ^n-1ピークの総数との関係は、階段状に増加する形状になる。そこで、上記同定確率推定モデル構築ステップでは例えば、ＭＳ ^n-1 ピークの累積数と同定成功数との連続的な関係を求めるべくフィッティングを行って滑らかなフィッティングカーブを求め、このカーブの形状を示す関数式又はその関数式に含まれる係数や定数を同定確率推定モデル情報とすればよい。

第１の態様による物質同定方法では、同定確率推定モデル構築ステップにおいて、ＭＳ^n-1ピークに対しＭＳⁿ測定を１回のみ実施したときの、つまりは積算回数を考慮しない（或いは積算回数は１である）同定確率推定モデル情報を求める。これに対し、第２の態様による物質同定方法では、同一ＭＳ^n-1ピークに対しＭＳⁿ測定を複数回実行してその結果を積算する積算回数を考慮した、即ち、積算回数が１だけではなく１から所定値までの各積算回数における同定確率推定モデル情報も求める。第１の態様では、積算回数が１でない場合の同定確率は積算回数が１である同定確率から推定する必要があるが、第２の態様では、そうした推定は必要なく、任意の積算回数の同定確率を同定確率推定モデル情報から直接的に求めることができる。

なお、適切な同定確率推定モデルは試料の種類、より厳密には試料に含まれる各種物質の種類に依存する。換言すれば、同定対象の物質の種類が同一又は類似していれば、同一の同定確率推定モデル情報を用いることができる。例えば生体試料中のタンパク質を同定するといった目的に対しては、同定済みのタンパク質を各種物質として含む試料について得られたＭＳ^n-1ピーク等に基づいて同定確率推定モデル情報を取得しておけばよい。

例えば、含有物質が未知である試料から得られた複数の分画試料に対してＭＳ^n-1測定が実行され、その結果から次にＭＳⁿ測定を行うＭＳ^n-1ピークを決定する際には、同定確率推定ステップにおいてまず、各分画試料に対するＭＳ^n-1スペクトル上で観測される複数のＭＳ^n-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出する。ＳＮ比の算出方法は同定確率推定モデル作成時と同方法とする。そして、同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、各ＭＳ^n-1ピークのＳＮ比から同定確率推定値をそれぞれ算出する。これにより、実際に或るＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定を行うことなく、そのＭＳⁿ測定を実行した結果に基づく同定成否の推定確率が定量的に求まる。

そのあと測定条件最適化ステップにおいて、総合的に同定される物質の数が極力多くなるように、ＭＳⁿ測定対象とするプリカーサイオンの選択を行うとともに積算回数を決定する。上述したように、同一成分由来のＭＳ^n-1ピークが連続する複数の分画試料に対するＭＳ^n-1スペクトルに現れる場合があるから、ここでいうプリカーサイオンの選択とは、単に１つの分画試料の中におけるＭＳ^n-1ピークの選択だけではなく、複数の分画試料に跨るＭＳ^n-1ピークについてその複数の分画試料におけるＭＳ^n-1ピークの中の選択も含む。

第１の態様の測定条件最適化ステップでまず、同一のＭＳ^n-1ピークにおける積算回数の増加に対する同定確率の改善度合を想定する。一例としては、積算回数をｍ倍にした際の同定確率をＳＮ比が√ｍ倍である同定確率であると想定すればよい。一方、上述したように第２の態様では、積算回数毎に同定確率推定モデル情報が用意されているので、第１の態様のような想定は不要である。

いずれにしても測定条件最適化ステップでは、所定の複数の分画試料に対する全てのプリカーサイオン候補であるＭＳ^n-1ピークについてそれぞれ推定された同定確率推定値に基づいて、ＭＳ^n-1ピークの選択の組み合わせを変えるとともに積算回数を１から所定回数まで変化させたときの同定確率の総和を最大化する目的関数を定める。また、少なくとも、所定の複数の分画試料に対するＭＳⁿ測定の実行回数の総和、及び、１つの分画試料に対するＭＳⁿ測定の実行回数の総和を、制約条件として設定する。これ以外に、例えば同一成分由来のＭＳ^n-1ピークは１つの分画試料からのみ選択する、といった別の制約条件を加えてもよい。そして、そうした制約条件の下で、上記目的関数を最大化する解を求めることによって、ＭＳⁿ測定すべきプリカーサイオンとしてのＭＳ^n-1ピークを選択するとともに、選択した各ＭＳ^n-1ピークに対する最適な積算回数を求める。

こうして本発明に係る第１及び第２の態様による物質同定方法では、同定確率モデルに基づいて算出される同定確率の定量値を利用して、極力多くの物質が同定されるように適切なプリカーサイオンの選択及びＭＳⁿ測定の実行回数の決定を事前に、つまり実際のＭＳⁿ測定の実行前に行うことができる。

なお、測定対象である試料の量が限られているような場合、測定毎の試料の消費による試料量の減少を考慮する必要がある。一般的には、ＳＮ比の低いピークほど試料の枯渇の影響を受け易いから、上述したようにＭＳⁿ測定すべきＭＳ^n-1ピークが求まったならば、例えば、その中でＳＮ比の小さいＭＳ^n-1ピークから優先的にＭＳⁿ測定を実行するとよい。これによって、試料の枯渇の影響を最小限に抑えて多くの物質を同定することができる。

また本発明に係る物質同定方法において好ましくは、上記測定条件最適化ステップは、線形計画問題として目的関数及び制約条件を定め、該目的関数を最大化する解を求めるようにするとよい。より具体的には、線形計画問題の一つである0-1整数計画問題として目的関数及び制約条件を定め、その0-1変数が１となるＭＳ¹ピーク及び積算回数を目的関数を最大化する解として求めるようにするとよい。なお、線形計画問題の解法自体は従来提案されている各種の方法を用いることができ、特にその解法は問わない。

また本発明に係る物質同定方法では、目的試料に対する測定に先立って所定の試料に対する測定を実行し、上記同定確率モデル構築ステップではその測定結果に基づいて同定確率推定モデルを作成することが好ましい。同定確率モデル構築用の所定試料に対する測定を目的試料に対する測定の直前に実行することにより、例えばノイズ環境が殆ど同一である等、測定条件がほぼ揃う。それにより、所定試料について求めた同定確率推定モデルの適用精度が向上し、同定確率推定値自体の精度も向上して、より的確な優先順位を求めることが可能となる。

また本発明に係る物質同定方法では、ＭＳⁿ測定の実行に先立って、同定確率推定ステップ及び測定条件最適化ステップにおける一連の処理の結果に基づいてＭＳⁿ測定の測定シーケンスを決定するとよい。この場合、最初に決められた測定シーケンスに従って複数のＭＳ^n-1ピークのそれぞれをプリカーサイオンとしたＭＳⁿ測定を実行すればよいので、ＭＳⁿ測定の制御は簡単で済む。

また本発明に係る物質同定方法では、ＭＳⁿ測定の実行に先立って、同定確率推定ステップ及び測定条件最適化ステップにおける一連の処理の結果に基づいてＭＳⁿ測定の測定シーケンスを決定するとともに、該測定シーケンスに従ってＭＳⁿ測定を開始しその測定の途中段階で得られた同定結果を利用してその測定シーケンスを変更するようにしてもよい。

例えば、測定シーケンスに従って順次異なる又は同一のＭＳ^n-1ピークについてＭＳⁿ測定を実行する途中で、ＭＳⁿ測定結果に基づく同定ができない状態が続いたならば、その時点でその測定シーケンスに従ったＭＳⁿ測定を中止し、次の分画試料に対するＭＳⁿ測定及び同定処理に移行してもよい。これにより、同定確率推定モデルと実際の同定結果との乖離がある程度存在する場合に、無駄なＭＳⁿ測定の実行をできるだけ少なくし、同定効率が下がることを回避することができる。

また本発明に係る質量分析装置は、上記本発明に係る物質同定方法を用いて物質同定を行うＭＳⁿ測定可能な質量分析装置であって、上記測定条件最適化ステップで得られた結果に基づくＭＳⁿ測定の測定シーケンスに従って自動的にプリカーサイオン及び積算回数を自動的に設定したＭＳⁿ測定を実施する制御部を備えることを特徴としている。この質量分析装置は、特定の質量電荷比を有するイオンの選択と該イオンに対する解離操作とが可能な質量分析装置であれば、特にその構成は問わない。

本発明に係る質量分析装置によれば、上記物質同定方法によってＭＳⁿ測定の実行前に決定されたプリカーサイオンや積算回数に従って自動的にＭＳⁿ測定が実施されるので、分析者自身がＭＳⁿ測定の条件等を入力する必要がなく、分析者の手間を省いて効率的に目的試料の同定作業を行うことができる。

本発明に係る物質同定方法によれば、目的試料中に含まれる多数の未知物質を同定するためにＭＳⁿ測定を行う前に、できるだけ多くの物質が同定されるように１つの分画試料中のＭＳ^n-1ピークをプリカーサイオンとして選択したり、同一物質由来で複数の分画試料に跨るＭＳ^n-1ピークの１つをプリカーサイオンとして選択したり、さらには、それぞれのＭＳ^n-1ピークに対する最適なＭＳⁿ測定回数を求めたりすることができる。それにより、例えば、従来と同程度の数の物質の同定を成功させるのに要する測定時間を短縮する又は測定回数を減らすことができる。また、従来と同じ測定時間や測定回数であれば、それだけ多くの物質を同定することができるようになる。

本発明に係る物質同定方法を実施する質量分析装置の概略ブロック構成図。 本発明に係る物質同定方法における同定確率推定モデル構築の際の処理フローチャート。 本発明に係る物質同定方法において同定確率推定モデルに基づくＭＳ²測定シーケンス最適化処理のフローチャート。 ノイズレベル評価処理を説明するためのＭＳ¹プロファイル（マススペクトル）の一例を示す図。 ２つのＭＳ¹プロファイルに対するノイズレベル算出結果例を示す図。 質量電荷比m/zとＳＮ比とに対するＭＳ¹ピークの分布状況の一例を示す図。 ＭＳ¹ピークをＳＮ比で順位付けしたときの、同定に成功したＭＳ¹ピークの経験累積分布関数の概念を示す模式図。 同定に成功したＭＳ¹ピークの経験累積分布関数、該分布関数に対するフィッティング関数、及び該フィッティング関数に基づく同定確率推定値の変化を示す図。 ＭＳ¹スペクトルのヒートマップ表示の一例を示す図。 通常の積算回数におけるＳＮ比と同定確率推定値との関係の一例を示す図。

以下、本発明に係る物質同定方法の一実施例、及び該方法による物質同定を実施する質量分析装置の一実施例について、添付図面を参照して詳細に説明する。

本発明に係る物質同定方法は、目的試料からＬＣ等により分離・分画されることで得られた時間的に連続した多数の分画試料に対し、それぞれＭＳ^n-1測定を実行して得られるＭＳ^n-1スペクトル上に現れる１又は複数のＭＳ^n-1ピークをプリカーサイオンに選出して該プリカーサイオンに対するＭＳⁿ測定を行い、それにより得られるＭＳⁿスペクトルを利用して目的試料に含まれる各種物質を同定する質量分析装置（又は化合物同定システム）において、実際にＭＳⁿ測定を実施する前に、ＭＳ^n-1スペクトル上のＭＳ¹ピークについて物質の同定が成功する確率を定量的に推定し、それに基づいて、ＭＳⁿ測定のプリカーサイオン選択の最適化、同一成分由来のプリカーサイオンに対するＭＳⁿ測定回数（積算回数）の最適化、及び、同一成分由来で複数の分画試料に跨るＭＳ¹ピークのうちの１つの選択の最適化、を含むＭＳⁿ測定シーケンスの最適化を行うための処理に特徴を有する。

本発明におけるＭＳⁿ測定シーケンス最適化方法を具体例を挙げて説明する。
この例による方法では、予備的に、つまり同定対象である目的試料の測定及び同定処理に先立って、多くの物質を含む同定確率推定モデル構築用試料（以下、単に「モデル構築用試料」という）に対する測定及び同定処理の結果を利用して、同定確率推定モデルを作成しておく。この同定確率推定モデルは、ＭＳ²測定及び同定実行前のＭＳ¹ピークをプリカーサイオンとしてＭＳ²測定及び同定処理を実行したと仮定したときに同定が成功する確率を推測するための参照データである。モデル構築用試料は目的試料と同種、例えば目的試料がペプチド混合物である場合にはモデル構築用試料もペプチド混合物であることが好ましい。

図２は同定確率推定モデル構築処理の手順を示すフローチャートである。図２を参照して同定確率推定モデルを作成する手順を詳細に説明する。

［ステップＳ１１］同定確率推定モデル構築用データの収集
まず、モデル構築用試料をＬＣで分離して、所定の分画時間毎に分取された多数の分画試料を調製する。そして、各分画試料に対しＭＳ¹測定が実施され、ＭＳ¹スペクトルデータが収集される。さらに、このＭＳ¹スペクトルデータに基づいて抽出される各ＭＳ¹ピークに対して、１回の解離操作を加えたＭＳ²測定が実施されてＭＳ²スペクトルデータが収集され、そのＭＳ²スペクトルデータを用いた同定処理が試みられる。

上述したように保持時間に応じて分画された各分画試料に含まれる物質を同定する場合には、各分画試料のＭＳ¹スペクトルを保持時間の順に並べて３次元的なＭＳ¹スペクトルを求める。そして、該３次元ＭＳ¹スペクトルに対して質量電荷比m/z−保持時間の２次元平面上でピーク検出を行ってＭＳ¹ピーク（後述する２Ｄピーク）を抽出し、該ＭＳ¹ピークの質量電荷比をプリカーサイオンとしてＭＳ²測定を行いＭＳ²スペクトルを取得する。そして、そのＭＳ²スペクトルに基づいて所定の同定アルゴリズム（例えばデノボシーケンスサーチやＭＳ／ＭＳイオンサーチなど）により物質の同定を試みる。この同定はＭＳ¹ピーク毎に行われるから、３次元ＭＳ¹スペクトルから抽出されるＭＳ¹ピーク毎に同定の成功又は失敗（同定不可）が決まる。

［ステップＳ１２］ＭＳ¹スペクトルのノイズレベルの評価
後述する同定確率はＭＳ¹スペクトルのノイズレベルの影響を受ける。そこで、モデル構築用試料に対するＭＳ¹スペクトルのノイズレベルを評価する。本例では、次のステップＳ１２１〜Ｓ１２３の手順により、 ＭＳ¹測定により得られた生データ（加工されていないデータ）であるＭＳ¹ロー（raw）プロファイル（以下、単に「ロープロファイル」という）からノイズレベルを分画試料毎に、つまりＭＳ¹スペクトル毎に評価する。以下の説明では、離散化されたロープロファイルの信号強度をＲ_mとおく。ただし、ｍ＝０、１、…は、評価対象である試料のロープロファイルの、サンプリング点における質量電荷比の順序を示す番号である。ロープロファイルに含まれるサンプリング点全体の集合はＭで表すものとする。

［ステップＳ１２１］ピーク部分及びピーク近傍の情報の除外
ロープロファイルの最大ピーク強度をＰ^(max)とおく。つまり、次の(1)式のようにおく。
Ｐ^(max)＝ max Ｒ_m …(1)
（ただしｍ∈Ｍ）
ここで、ピーク近傍の判定用閾値μ（０＜μ＜１）を適宜に選び、信号強度が最大ピーク強度Ｐ^(max)のμ倍以上であるサンプリング点をピーク部分であるとみなす。そして、ピーク部分に含まれるサンプリング点、つまり信号強度がμ・Ｐ^(max)以上であるサンプリング点からの距離がＷ以内であるサンプリング点、を除いたサンプリング点の集合Ｍ’(Ｗ，μ)を求める。図４（ａ）はm/z 1060-m/z 1080の範囲についてＭＳ¹スペクトルのロープロファイルに対しサンプリング点集合Ｍ’(Ｗ，μ)を求めた例であり、図４（ｂ）は（ａ）のm/z 1070-m/z 1075の範囲の拡大図である。

［ステップＳ１２２］局所的な信号変動量の算定
次に、上記ピーク部分とピーク近傍とを除外したサンプリング点集合Ｍ’(Ｗ，μ)において、通過帯域が半値幅Ｗであるフィルタによりロープロファイルを平滑化した、平滑化プロファイル^*Ｒ_m(ｗ，μ)を求める。つまり、^*Ｒ_m(ｗ，μ)は次の(2)式で求まる。
^*Ｒ_m(ｗ，μ)＝｛１／（２Ｗ＋１）｝ΣＲ_m' …(2)
（ただしｍ∈Ｍ’(Ｗ，μ)）
ここで、Σはｍ’＝−ＷからＷまでの総和である。この平滑化プロファイル^*Ｒ_m(Ｗ，μ)と元のロープロファイルとの差を局所的な信号変動量と定義し、ΔＲ_m(Ｗ，μ)で表す。つまり、ΔＲ_m(Ｗ，μ)は次の(3)式で求まる。
ΔＲ_m(Ｗ，μ)＝Ｒ_m−^*Ｒ_m(Ｗ，μ) …(3)

［ステップＳ１２３］局所的な信号変動量に基づくノイズレベルの算定
ここでは、上記局所的な信号変動量ΔＲ_m(Ｗ，μ)の２乗平均のｃ倍をノイズレベルＮ(Ｒ_m；Ｗ，μ)と定義する。ｃはノイズレベルを定義するための適当な定数である。つまり、Ｎ(Ｒ_m；Ｗ，μ)の定義式は次の(4)式である。
Ｎ(Ｒ_m；Ｗ，μ)＝ｃ・√｛ΣΔＲ_m(Ｗ，μ)²｝ …(4)
なお、ノイズレベルの定義は上記説明のものに限定されるわけではなく、ＭＳ¹スペクトルのノイズレベルを適切に定義できる方法でありさえすればよい。
実際の２つのＭＳ¹ロープロファイルに基づいて、上記方法によりノイズレベルＮ(Ｒ_m；Ｗ，μ)を算定した結果の例を図５に示す。

［ステップＳ１３］同定成功ＭＳ¹ピークの抽出
図６は、モデル構築用試料由来の全てのＭＳ¹ピークの質量電荷比m/zとＳＮ比とをプロットした結果の例である。ここで、ＳＮ比はピーク強度とステップＳ１２で求めたノイズレベルとの比である。図６に□印で示したプロット点はＭＳ¹ピークを示している。また、●印で示したプロット点は、そのＭＳ¹ピークをプリカーサイオンとしたＭＳ²測定によって物質同定が可能であった、即ち、同定に成功したＭＳ¹ピークを示している。図６を見ると、この例では、ＳＮ比が大きいほど同定に成功するＭＳ¹ピークの割合が大きくなる傾向にあることが分かる。これは本例に限らず、一般的な傾向である。

［ステップＳ１４］ＭＳ¹ピークのＳＮ比と同定成功ＭＳ¹ピーク累積数との関係付け
ＳＮ比の大きい順にＭＳ¹ピークを抽出して「１」から順位付けし（つまりＭＳ¹ピークをＳＮ比が大きい順にソートして順位を付け）、その順位毎にそれまでに同定に成功したＭＳ¹ピークの数（累積数）を求めると、図７に示すように、累積数が右上がりの階段状に増加するグラフが描ける。例えば、図７中の実線で示す階段状の折れ線は、順位１のＳＮ比を示すＭＳ¹ピークは同定に成功し、順位１よりも低いＳＮ比である順位３のＳＮ比を示すＭＳ¹ピークは同定に失敗したことを意味している。この折れ線は、或るＳＮ比以上を示すＭＳ¹ピークのうち幾つのＭＳ¹ピークが同定に成功したのかを示す経験累積分布関数であるといえる。

ただし、図６から分かるように、この例では、同一の質量電荷比に対する複数のＭＳ¹ピーク（ＳＮ比は同一とは限らない）に対してそれぞれ個別に同定が行われている。そのため、質量電荷比の重複が多いと、同定の成否に対する特定の質量電荷比の影響が相対的に強くなり過ぎるおそれがある。そこで、これを避けるために、同一の質量電荷比であるＭＳ¹ピークＮ個（Ｎは２以上の整数）に対してそれぞれ同定がなされた場合には、個々の同定は１／Ｎ回であるとみなして経験累積分布関数を求めるほうが好ましい。図７に示した例では、順位１、２、４、５、７、及び８において同定に成功した場合を表しているが、図７中の実線は質量電荷比の重複を考慮しない経験累積分布関数である。ここで、順位２及び８に含まれる同定に成功した複数のＭＳ¹ピークが同一質量電荷比を有していた場合には、重複を考慮してその順位２、８のＭＳ¹ピークをそれぞれ１／２とカウントして、経験累積分布関数を図７中に一点鎖線で示すように修正する。

図６に示したＭＳ¹ピークの同定成否分布の例について、上述したように質量電荷比の重複を考慮した経験累積分布関数を求めると、図８中に示すような階段状のプロファイルが得られる。順位が大きくなるほど、つまりはＭＳ¹ピークのＳＮ比が下がるほど、同定に成功するＭＳ¹ピークの数は減るため、同定成功累積数は頭打ちになる（飽和する）ことが分かる。

［ステップＳ１５］同定確率推定モデルとパラメータの算出
ステップＳ１４で得られた階段状のプロファイルに対し解析的な関数を用いてフィッティングを行うことにより、ＳＮ比に従ったＭＳ¹ピークの累積数と同定成功累積数との滑らかなカーブ状の関係を求める。ここでは、フィッティング関数の形状として、次の(5)式の双曲線関数を用いた。
Ｎ^(ident)tanh（ｍ／Ｎ^(all)σ） …(5)
ただし、ここでｍは或る順位よりも上位順位であるＭＳ¹ピークの総数であり、Ｎ^(all)及びＮ^(ident)はそれぞれＭＳ¹ピークの総数及び同定に成功したＭＳ¹ピークの総数である。また、σはフィッティング関数の立ち上がりの速さを定めるパラメータであり、先に求めた階段状のプロファイルにフィットするように算出する。図８中に階段状のプロファイルにフィットさせたフィッティング関数を一点鎖線で示している。このフィッティング関数のカーブが同定確率推定モデルであり、σはこのモデルを規定するパラメータである。

以上のような手順で、同定確率推定モデルを定めるパラメータσを算出することができるから、同定確率を推定するために、このパラメータσを記憶しておく（ステップＳ１６）。

次に、上記のような同定確率推定モデルのパラメータが予め用意されている状況の下で、目的試料をＬＣで分離し分取することで得られた複数の分画試料をＭＳ¹測定して求まるＭＳ¹スペクトルに基づいて、プリカーサイオンとして適切なＭＳ¹ピークを選択するとともに最適なＭＳ²測定シーケンスを決定する際の処理手順を、図３に示すフローチャートに従って説明する。

［ステップＳ２１］目的試料由来のＭＳ¹測定データの収集
まず、目的試料から調製された多数の分画試料に対してそれぞれＭＳ¹測定が実行され、ＭＳ¹スペクトルデータが収集される。そして、各分画試料のＭＳ¹スペクトルを保持時間の順に並べて３次元的なＭＳ¹スペクトルを求める。

［ステップＳ２２］２Ｄピークの検出及びプリカーサイオン候補の抽出
各分画試料に対して得られたＭＳ¹スペクトルを分画の時間順に並べて表示すると、図９（ａ）に示すように、質量電荷比m/z−保持時間の２次元平面上において信号強度を濃淡（又はカラー）で表したヒートマップが得られる。このヒートマップにおいて２次元的にピーク検出を行ってＭＳ¹ピークを抽出する。これによって検出されたピークを２Ｄピークと呼ぶ。図９（ａ）では１個の点が１個の２Ｄピークに相当する。

いま、検出された２ＤピークをＰ_k ^(2D)（ｋ＝１，２，…，Ｋ）とする。各２Ｄピークは試料に含まれていた一つの成分（物質）に対応するが、一つの成分は２Ｄピークの頂点が位置する分画試料だけでなく、前後の連続する複数の分画試料に跨って観測されることがよくある。図９（ｂ）は図９（ａ）の拡大図であり、図９（ｂ）において水平に延伸する点線は分画の区切りを示している。この図から、図９（ａ）では１個の点に相当する縦長形状の２Ｄピークが複数の分画に跨っていることが分かる。この場合、同一成分由来の同じ質量電荷比を持つＭＳ¹ピークが連続する分画試料において観測されることになる。したがって、２ＤピークＰ_k ^(2D)は、同じ質量電荷比を持つ一つ又は複数のＭＳ¹ピークの集合であるとみなすことができる。

いま、各分画試料に時間順に付された番号がｗである分画試料において検出された複数のＭＳ¹ピークのうち、いずれかの２Ｄピークに含まれるものに（ただし、いずれの２Ｄピークに含まれるのかについては問わずに）連番を付し、Ｐ_wj（ｊ＝１，２，…，Ｋ）と表すものとする。例えば、Ｐ₁₁はｗ＝１である分画試料において検出された複数のＭＳ¹ピークの中でｊ＝１である、つまり１番目のＭＳ¹ピークである。ここでｊの値は特に意味はなく、例えば質量電荷比の小さい順に連番とすればよい。

Ｐ_wjの和集合はいずれかの２Ｄピークに含まれるＭＳ¹ピークの全体に相当するので、次の(6)式が成り立つ。
∪_w｛Ｐ_wj｜∃ｊＰ _wj ∈ Ｐ_k ^(2D)｝＝Ｐ _k ^(2D) …(6)
なお、∪ _w はｗに関する和集合を意味する。
以下、こうして抽出されたＭＳ¹ピークであるＰ_wjをＭＳ²測定のプリカーサイオン候補として、適切なプリカーサイオン選択と積算回数の最適化を行う。

［ステップＳ２３］ＭＳ¹スペクトルのノイズレベルの評価
次に、上記ステップＳ１２（Ｓ１２１〜Ｓ１２３）と同様の処理を行うことで、各分画試料におけるＭＳ¹スペクトル毎にそれぞれノイズレベルを評価する。

［ステップＳ２４］各ＭＳ¹ピークのＳＮ比の算出
ステップＳ２２で抽出されたＭＳ¹ピークＰ_wj毎に、そのピーク強度、及び該ピークが存在する分画試料についてステップＳ２３で算出されたノイズレベルからＳＮ比を算出する。

［ステップＳ２５］同定確率推定モデルに基づくＳＮ比からの同定確率の推定
上記(5)式に示したフィッティング関数の傾きが１であるということは１００％、その傾きが０．５であるということは５０％の確率で以て同定に成功することを示している。したがって、フィッティング関数の微分である次の(7)式により、或る１つのＭＳ¹ピークに対して、その順位値ｍから、同定に成功する確率を推定することができる。
（Ｎ^(ident)／Ｎ^(all)σ）sech²（ｍ／Ｎ^(all)σ） …(7)
図８には上記(7)式による微分関数で示される推定同定確率（図８中右側の目盛り）も重ねて示してある。

図８の横軸（順位）を各順位に対応するＳＮ比に変換すると、与えられたＳＮ比に対応する同定確率の推定値ｐ₁(ｒ)が得られる。ここでｒはＭＳ¹ピークのＳＮ比である。したがって、ＭＳ¹ピークＰ_wjのＳＮ比をｒ_wjとすると、ＭＳ¹ピークＰ_wjの同定確率の推定値はｐ₁(ｒ_wj)となる。この推定値ｐ₁(ｒ_wj)は、通常の、つまり同定確率推定モデル作成に用いたデータと同条件の積算回数でＭＳ²測定を行った場合において推定される同定確率である。これに対し、同一ＭＳ¹ピークに対するＭＳ²測定の回数、つまりは積算回数をｎ倍にしたとすると、ＭＳ²スペクトルのＳＮ比は理想的には√ｎ倍になるから、ＳＮ比の改善に伴って同定確率も向上することが期待される。そこで、ここでは、積算回数がｎ倍であるときの同定確率はＭＳ¹ピークのＳＮ比が√ｎ倍になった場合の同定確率に等しいと想定する。即ち、同じＭＳ¹ピークに対して積算回数をｎ倍にしたときの同定確率の推定値ｐ_n(ｒ_wj)は、次の(8)式で求められるものとする。
ｐ_n(ｒ_wj)＝ｐ₁(√(ｎ)ｒ_wj) …(8)

説明を簡略化するために、同定確率推定モデル作成に用いたデータと同条件である通常の積算回数を１回積算（積算なし）であるとし、ｎ倍の積算をｎ回積算であるとする。この場合、ＭＳ¹ピークＰ_wjをｎ回ＭＳ²測定して積算したときの同定確率ｐ_wj ⁽ⁿ⁾は次の(9)式で求められる。
ｐ_wj ⁽ⁿ⁾＝ｐ_n(ｒ_wj)＝ｐ₁(√(ｎ)ｒ_wj) …(9)
なお、実際の積算回数に戻すには、通常の積算回数を乗じればよい。

［ステップＳ２６］プリカーサイオン選択及び積算回数の最適化問題に関する目的関数の設定
ここでは、多数の物質の同定確率の期待値を最大化するためのプリカーサイオン選択及び積算回数の最適化問題を、ＭＳ²測定対象となるＭＳ¹ピークＰ_wjに対する同定確率ｐ_wj ⁽ⁿ⁾の和の最大化であると定義する。この問題を線形計画問題の１つである0-1整数計画問題に帰着させ、以下の手順で定式化する。
即ち、ＭＳ¹ピークＰ_wjに対するＭＳ²測定の回数について、以下の二値をとる0-1変数ｘ_wj ⁽ⁿ⁾を定義する。
ｘ_wj ⁽ⁿ⁾＝１ ：ＭＳ¹ピークＰ_wjに対してｎ回積算のＭＳ²測定を実施する
ｘ_wj ⁽ⁿ⁾＝０ ：それ以外
上記定義は全てのｎに対してｘ_wj ⁽ⁿ⁾＝０であるときは、ＭＳ¹ピークＰ_wjに対してＭＳ²測定を全く行わないことを意味する。また、ｘ_wj ⁽¹⁾＝１且つｎ＝１以外の全てのｎに対してｘ_wj ^(ｎ) ＝０であるときは、ＭＳ¹ピークＰ_wjに対して１回のみＭＳ²測定を行う、つまり積算を実行しないことを意味する。なお、後述する制約(10)式により、ｗ、ｊの組毎にｘ_wj ⁽ⁿ⁾＝１となるｎはたかだか一つであり、その他のｎに対してはｘ_wj ⁽ⁿ⁾＝０であることを保証される。

上記0-1変数ｘ_wj ⁽ⁿ⁾を用いると、最大化すべき同定確率の和は次の(10)式で表される。
f(ｘ_wj ⁽ⁿ⁾)＝Σｐ_wj ⁽ⁿ⁾ｘ_wj ⁽ⁿ⁾ …(10)
ここで、Σはｗ、ｊ、ｎについての総和である。つまり、(10)式は、対象としている全ての分画試料について各分画試料で抽出された全てのプリカーサイオン候補であるＭＳ₁ピークの組み合わせにおいて、積算回数を１から所定値までの範囲で変化させたときの、それぞれの総和である。この(10)式のｆを最大化すべき目的関数とする。このとき、同定確率ｐ_wj ⁽ⁿ⁾は同定確率推定モデルとＭＳ¹ピークＰ_wjのＳＮ比とから求めることができる既知の値である。

［ステップＳ２７］目的関数を最大化するに際しての制約条件の設定
上記目的関数ｆの最大化に際して、以下の制約条件を設定する。
（Ａ）ＭＡＬＤＩイオン化質量分析装置の利用を想定した場合、測定を実行する毎に少しずつ試料は消費されていく。そのため、測定の繰り返しによって試料は枯渇していくため、１つの分画試料に対して実施できる測定回数、つまり積算回数の総和には上限がある。そこで、或る１つの分画試料ｗに対する積算回数の上限をＵ_wとおく。
（Ｂ）測定時間等の制約から、対象としている全ての分画試料に亘る積算回数の総和にも上限がある。そこで、この総積算回数の上限をＵ^(Total)とおく。
（Ｃ）上記条件のほかに、下記２つの条件を課すものとする。
・ＭＳ¹ピークＰ_wj毎に積算回数は一意的に選択される（複数の値をとらない）。
・同一質量電荷比を持つＭＳ¹ピークが連続する複数の分画試料において存在する場合であっても、いずれか１つの分画試料におけるＭＳ¹ピークのみをＭＳ²測定の対象とする。

上記制約条件（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ次の(11)〜(13)式の不等式により表される。
Σｎｘ_wj ⁽ⁿ⁾≦Ｕ_w …(11)
(11)式は任意のｗについて成り立ち、Σはｊ、ｎについての総和である。
Σｎｘ_wj ⁽ⁿ⁾≦Ｕ^(Total) …(12)
(12)式においてΣはｗ、ｊ、ｎについての総和である。
Σｘ_wj ⁽ⁿ⁾≦１ …(13)
(13)式は任意のｋについて成り立ち、Σはｗ、ｊ、ｎについての総和である。
ただし、(13)式の左辺に含まれるｗ、ｊに関する総和はＭＳ¹ピークＰ_wjが存在する特定の２ＤピークＰ_k ^(2D)に含まれる範囲で和をとるものとする。

［ステップＳ２８］制約条件の下で目的関数を最大化する最適変数の算出及び該変数からプリカーサイオン選択と積算回数への変換
(11)式〜(13)式の制約条件の下で、(10)式に示した目的関数を最大化する0-1変数ｘ_wj ⁽ⁿ⁾を求める問題は一般に0-1整数計画問題と呼ばれる。0-1整数計画問題の解法については様々な手法があるが、いずれも一般によく知られているので、ここではその解法については説明を略す。いずれにしても、(10)式を最大化する0-1変数を調べると、最適な0-1変数ｘ_wj ⁽ⁿ⁾の組が得られる。そこで、その最適変数の組からｘ_wj ⁽ⁿ⁾＝１であるｗ、ｊ、ｎの組を全て抽出する。抽出されたｗ、ｊの組で表されるＭＳ¹ピークＰ_wjが選択すべきプリカーサイオンであり、それらｗ、ｊと組をなすｎが、そのプリカーサイオンに対する最適な積算回数である。こうして、多くの物質の同定確率が全体として高くなるような、最適なプリカーサイオンの選択と積算回数の最適化が実現できる。

ＭＳ²測定のプリカーサイオンとすべきＭＳ¹ピークが決まったならば、そのＭＳ¹ピークが得られる分画試料に対し、該ＭＳ¹ピークを対象とするＭＳ²測定を規定の回数だけ実行するように測定を実施すればよい。

なお、一般にＳＮ比が低いＭＳ¹ピークはＳＮ比が高いＭＳ¹ピークよりも試料枯渇の影響を受け易い。そこで、同一分画試料において複数のＭＳ¹ピークがプリカーサイオンとして選択されている場合には、ＳＮ比が低いＭＳ¹ピークをＳＮ比が高いＭＳ¹ピークよりも優先的にＭＳ²測定することが望ましい。これにより、より多くの物質を同定できる可能性が高くなる。

また、上述した最適なＭＳ²プリカーサイオン選択及び積算回数の最適化は、ＭＳ²測定を実行する前に求められるものであり、あくまでも既知の同定確率推定モデルを参照して求められたものである。したがって、同定確率の推定の確度は高いとはいえ、それに基づくプリカーサイオンの選択及び積算回数の最適化が絶対的に正しいとは限らない。そこで、ＭＳ²測定が途中まで進んだ段階で、それまでの実際のＭＳ²測定結果を用いた同定結果を踏まえて、以降の測定を最適化する処理を行うようにしてもよい。

また、上記説明では、ｎ回積算によってＳＮ比が√ｎ倍になると仮定して同定確率を求めたが、モデル作成用サンプルをｎ回積算でＭＳ²測定した場合の同定結果から、図２のステップＳ１１〜Ｓ１５の手順に沿ってフィッティングを行い、ｎ回積算時の同定確率モデルを作成することも可能である。この場合には、(7)、(8)式で示したようなｎ回積算の際の同定確率の推定は不要になり、ｎ回積算に対応した同定確率モデルに基づいて直接的にｎ回積算の際の同定確率を求めることができる。

以上のように、本発明に係る物質同定方法によれば、同定確率推定モデルのパラメータを目的試料の測定に先立って求めておくことにより、該同定確率推定モデルを利用した簡易な演算及び処理によって、同定される物質数が最大又はそれに近い状態となるように、同一のＭＳ¹ピークに対する積算回数を、実際のＭＳ²測定実行前に定めることができる。したがって、定められたＭＳ²測定シーケンスに従ってプリカーサイオンを選択しながらＭＳ²測定を実行し、その測定結果を利用して物質同定を実施することにより、きわめて効率的に物質同定を行うことができる。

次に、上記物質同定方法による物質同定を実施するための質量分析装置の一実施例を図１により説明する。図１は本実施例による質量分析装置の概略構成図である。

図１において、分析部１は、液体試料中の各種物質を保持時間に応じて分離するＬＣ部１１と、ＬＣ部１１で分離された物質を含む試料を分取・分画してそれぞれ異なる分画試料を調製する分取分画部１２と、複数の分画試料のうちの１つを選択して該分画試料に対する質量分析を実行するＭＳ部１３と、を含む。図示しないが、ＭＳ部１３は、ＭＡＬＤＩイオン源、イオントラップ、及び飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）を含むＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦＭＳであり、ＭＳ¹測定だけでなく、イオントラップにおいてプリカーサイオン選択と衝突誘起解離操作とを１乃至複数回繰り返した後にＴＯＦＭＳで質量分析を行うＭＳⁿ測定が可能となっている。ただし、ＭＳ¹測定及びＭＳ²測定のみを実行すればよい場合（ｎが３以上のＭＳⁿ測定が不要である場合）には、イオントラップとＴＯＦＭＳとの組み合わせに代えて、三連四重極型質量分析計のような、より簡単な構成の質量分析装置を利用することができる。

制御部２は上記分析部１中の各部の動作をそれぞれ制御する。分析部１のＭＳ部１３で得られたデータはデータ処理部３に入力され、データ処理部３で処理されて例えばその結果が表示部４に出力される。データ処理部３は機能ブロックとして、ＭＳ¹スペクトルデータやＭＳⁿスペクトルデータなどの測定データを収集するスペクトルデータ収集部３１、上記ステップＳ１２〜Ｓ１６に対応した処理を実行する同定確率推定モデル構築部３２、同定確率推定モデル構築部３２により得られたパラメータを記憶しておく同定確率推定パラメータ記憶部３３、上記ステップＳ２２〜Ｓ２５に対応した処理を実行する同定確率推定値算出部３４、ＭＳ²測定条件最適化部３５に含まれ、上記ステップＳ２６に対応した処理を実行する目的関数設定部３５１、上記ステップＳ２７に対応した処理を実行する制約条件設定部３５２、上記ステップＳ２８に対応した処理を実行するプリカーサイオン選択・積算回数算出処理部３５３、及び所定のアルゴリズムに従って同定処理を実行する同定処理部３８、を含む。なお、データ処理部３や制御部２は、パーソナルコンピュータをハードウエア資源とし、該パーソナルコンピュータにインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアを実行することにより、上記のような各機能ブロックが具現化される構成とすることができる。

目的試料に対する網羅的同定を実行するに先立って、制御部２の制御の下に分析部１は同定確率推定モデル構築用試料から得られる各分画試料に対するＭＳ¹測定、ＭＳ²測定を実行する。同定処理部３８は、収集されたＭＳ¹、ＭＳ²スペクトルデータに基づいて同定処理を実行し、同定確率推定モデル構築部３２はそれらスペクトルデータ及び同定結果に基づいて同定確率推定モデルを作成する。そして、この同定確率推定モデルを再現するパラメータが同定確率推定パラメータ記憶部３３に格納される。

目的試料に対する網羅的同定時には、制御部２の制御の下に分析部１は、まず、目的試料から得られる各分画試料に対するＭＳ¹測定を実行し、スペクトルデータ収集部３１はＭＳ¹スペクトルデータを収集する。同定確率推定値算出部３４は、各分画試料に対するＭＳ¹スペクトルデータ毎に、同定確率推定パラメータ記憶部３３から読み出したパラメータに基づき再現した同定確率推定モデルを利用して、プリカーサイオン候補である複数のＭＳ¹ピークの同定確率推定値を算出する。目的関数設定部３５１は、同定確率推定値を利用して、ＭＳ²測定の際のプリカーサイオン選択及び積算回数を最適化するために(10)式に示した目的関数を定める。また、制約条件設定部３５２は、(11)〜(13)式に示した制約条件を示す不等式を定める。そして、プリカーサイオン選択・積算回数算出処理部３５３は、目的関数を最大化する最適変数を求め、該最適変数に基づいて、同定のために適したプリカーサイオンを選択するとともにプリカーサイオン毎に積算回数を決定する。そして、こうして求まったプリカーサイオンや積算回数を基づいて、最適なＭＳ²測定シーケンスを作成する。

上述したように求まった最適なＭＳ²測定シーケンスは制御部２に送出され、制御部２はこのＭＳ²測定シーケンスに従って分析部１を自動的に制御することにより、目的試料から得られる各分画試料に対するＭＳ²測定を実行する。同定処理部３８は、先に収集された目的試料由来の各分画試料に対するＭＳ¹スペクトルデータと、新たに収集された各ＭＳ¹ピークに対するＭＳ²スペクトルデータとに基づいて同定処理を実行し、目的試料中の物質の同定を実行する。その同定結果は表示部４の画面上に表示される。以上のようにして、本実施例の質量分析装置では、限られた測定時間又は測定回数で、より多数の物質の同定に至ることができる。

以上説明した実施例の動作は、最適なＭＳ²測定シーケンスが求まったあとに該シーケンスに従って自動的にＭＳ²測定が実行されるようにしたものであるが、最適なＭＳⁿ測定シーケンスを表示部４の画面上に一旦表示し、ユーザ（分析担当者）によるＭＳ²測定実行指示を受けて初めて目的試料に対するＭＳ²測定及び同定処理を実行するようにしてもよい。こうした構成とすれば、ユーザが自らの判断や経験に従ってＭＳ²測定シーケンスを適宜に手直ししてＭＳ²測定を実行させるようにすることができる。

なお、上記実施例は本発明の一実施例であり、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。

１…分析部
１１…ＬＣ部
１２…分取分画部
１３…ＭＳ部
２…制御部
３…データ処理部
３１…スペクトルデータ収集部
３２…同定確率推定モデル構築部
３３…同定確率推定パラメータ記憶部
３４…同定確率推定値算出部
３５…ＭＳ²測定条件最適化部
３５１…目的関数設定部
３５２…制約条件設定部
３５３…プリカーサイオン選択・積算回数算出処理部
３８…同定処理部
４…表示部

Claims (10)

1. 各種物質が含まれる試料を分離用パラメータに従って分離し分画することで得られた複数の分画試料に対しＭＳⁿ測定（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することで得られたＭＳⁿスペクトルに基づいて、各分画試料に含まれる物質を同定する物質同定方法であって、
   a)所定の試料から得られた複数の分画試料に対するＭＳ^n-1測定により求まるＭＳ^n-1ピークのＳＮ比、及び該各ＭＳ^n-1ピークをプリカーサイオンとして実行されたＭＳⁿ測定の結果に基づく物質同定の結果を利用して、同種試料に由来するＭＳ^n-1ピークのＳＮ比と複数のＭＳ^n-1ピークをＳＮ比順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳⁿ測定及び同定を実行していったときに充分な確度で何らかの物質が同定できたピークの累積数との関係を示す同定確率推定モデルを求め、該同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶する同定確率推定モデル構築ステップと、
   b)同定対象である目的試料から得られた時間的に連続する２以上の分画試料に対するＭＳ^n-1測定が終了した状況で、それらＭＳ^n-1測定により求まったＭＳ^n-1ピークの中でＭＳⁿ測定のためのプリカーサイオンの候補である複数のＭＳ^n-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出し、前記同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、前記プリカーサイオン候補である複数のＭＳ^n-1ピークのＳＮ比から各ＭＳ^n-1ピークの同定確率推定値を算出する同定確率推定ステップと、
   c)同一のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定を複数回行ってその測定結果を積算したときの同定確率の改善度合を想定した上で、所定の複数の分画試料に対する全てのプリカーサイオン候補であるＭＳ^n-1ピークについて前記同定確率推定ステップにおいてそれぞれ推定された同定確率推定値に基づいて、ＭＳ^n-1ピークの選択の組み合わせを変えるとともに積算回数を１から所定回数まで変化させたときの同定確率の総和を最大化する目的関数を定め、少なくとも、前記所定の複数の分画試料に対するＭＳⁿ測定の実行回数の総和、及び、１つの分画試料に対するＭＳⁿ測定の実行回数の総和を制約条件として前記目的関数を最大化する解を求めることにより、ＭＳⁿ測定すべきＭＳ^n-1ピークと各ＭＳ^n-1ピークに対する積算回数を求める測定条件最適化ステップと、
   を有することを特徴とする物質同定方法。
   
2. 各種物質が含まれる試料を分離用パラメータに従って分離し分画することで得られた複数の分画試料に対しＭＳⁿ測定（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することで得られたＭＳⁿスペクトルに基づいて、各分画試料に含まれる物質を同定する物質同定方法であって、
   a)所定の試料から得られた複数の分画試料に対するＭＳ^n-1測定により求まるＭＳ^n-1ピークのＳＮ比、及び該各ＭＳ^n-1ピークをプリカーサイオンとして実行されたＭＳⁿ測定の結果に基づく物質同定の結果を利用して、同種試料に由来するＭＳ^n-1ピークのＳＮ比と複数のＭＳ^n-1ピークをＳＮ比順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳⁿ測定及び同定を実行していったときに充分な確度で何らかの物質が同定できたピークの累積数との関係を示す同定確率推定モデルを求め、該同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶するステップであって、同一のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定を複数回行ってその測定結果を積算する回数を変えたときの物質同定の結果を利用して、積算回数毎の同定確率推定モデルを求め、該同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶する同定確率推定モデル構築ステップと、
   b)同定対象である目的試料から得られた時間的に連続する２以上の分画試料に対するＭＳ^n-1測定が終了した状況で、それらＭＳ^n-1測定により求まったＭＳ^n-1ピークの中でＭＳⁿ測定のためのプリカーサイオンの候補である複数のＭＳ^n-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出し、前記同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、前記プリカーサイオン候補である複数のＭＳ^n-1ピークのＳＮ比から各ＭＳ^n-1ピークの同定確率推定値を積算回数毎に算出する同定確率推定ステップと、
   c)所定の複数の分画試料に対する全てのプリカーサイオン候補であるＭＳ^n-1ピークについて前記同定確率推定ステップにおいてそれぞれ推定された同定確率推定値に基づいて、ＭＳ^n-1ピークの選択の組み合わせを変えるとともに積算回数を１から所定回数まで変化させたときの同定確率の総和を最大化する目的関数を定め、少なくとも、前記所定の複数の分画試料に対するＭＳⁿ測定の実行回数の総和、及び、１つの分画試料に対するＭＳⁿ測定の実行回数の総和を制約条件として前記目的関数を最大化する解を求めることにより、ＭＳⁿ測定すべきＭＳ^n-1ピークと各ＭＳ^n-1ピークに対する積算回数を求める測定条件最適化ステップと、
   を有することを特徴とする物質同定方法。
   
3. 請求項１に記載の物質同定方法であって、
   前記測定条件最適化ステップでは、積算回数をｍ倍にした際の同定確率をＳＮ比が√ｍ倍である同定確率と想定することを特徴とする物質同定方法。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の物質同定方法であって、
   前記目的試料に対する測定に先立って前記所定の試料に対する測定を実行し、前記同定確率モデル構築ステップではその測定結果に基づいて同定確率推定モデルを作成することを特徴とする物質同定方法。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の物質同定方法であって、
   前記測定条件最適化ステップは、線形計画問題として前記目的関数及び制約条件を定め、該目的関数を最大化する解を求めることを特徴とする物質同定方法。
6. 請求項５に記載の物質同定方法であって、
   前記測定条件最適化ステップは、0-1整数計画問題として前記目的関数及び制約条件を定め、変数が１となるＭＳ¹ピーク及び積算回数を前記目的関数を最大化する解として求めることを特徴とする物質同定方法。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の物質同定方法であって、
   前記測定条件最適化ステップによりＭＳⁿ測定すべきＭＳ^n-1ピークが求まったあとに、その中でＳＮ比の小さいＭＳ^n-1ピークから優先的にＭＳⁿ測定を実行することを特徴とする物質同定方法。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の物質同定方法であって、
   ＭＳⁿ測定の実行に先立って、前記同定確率推定ステップ及び前記測定条件最適化ステップにおける一連の処理の結果に基づいてＭＳⁿ測定の測定シーケンスを決定することを特徴とする物質同定方法。
9. 請求項８に記載の物質同定方法であって、
   ＭＳⁿ測定の実行に先立って、前記同定確率推定ステップ及び前記測定条件最適化ステップにおける一連の処理の結果に基づいてＭＳⁿ測定の測定シーケンスを決定するとともに、該測定シーケンスに従ってＭＳⁿ測定を開始しその測定の途中段階で得られた同定結果を利用してその測定シーケンスを変更することを特徴とする物質同定方法。
10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の物質同定方法を用いて物質同定を行うＭＳⁿ測定可能な質量分析装置であって、
    前記測定条件最適化ステップで得られた結果に基づくＭＳⁿ測定の測定シーケンスに従って自動的にプリカーサイオン及び積算回数を自動的に設定したＭＳⁿ測定を実施する制御部を備えることを特徴とする質量分析装置。