JP6146211B2 - 質量分析データ処理方法及び該方法を用いた質量分析装置 - Google Patents
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Description
[ステップA1]分析対象である試料を液体クロマトグラフやキャピラリ電気泳動などにより分離し、その溶出液を分取・分画して多数のサンプルを調製する(以下、分取・分画により得られた個々のサンプルを「分画試料」と呼ぶ)。なお、試料を分取・分画する際には一般に、予め設定した一定の時間間隔で分画を行うか又は一定量の試料液を繰り返し採取するように分画を行うことにより、試料に含まれる様々な物質ができるだけ漏れなくいずれかの分画試料に含まれるようにする。
[ステップA3]各分画試料に対するMS1スペクトルにおいて、同定対象の物質群に由来すると推測し得るピークを見つけ、これをプリカーサイオン候補として選択する。
[ステップA4]上記ステップA3において選択された複数のプリカーサイオン候補の中から同定対象の物質群に由来する可能性の高い候補を選択し、それをプリカーサイオンに設定して当該分画試料に対するMS2分析を実行する。1回のイオン解離操作によって十分に小さな断片にまで解離しないような場合は、イオンを多段階に解離させるnが3以上のMSn分析を実行する。
[ステップA5]ステップA4におけるMSn分析で得られたMSnスペクトルから収集したピーク情報に対し、データベース検索やデノボシーケンスサーチなどの既存の手法を用いることで、分画試料に含まれる物質を同定する。或いは、その物質の構造を解析する。
即ち、図7に示すように、分画の順番(液体クロマトグラフの場合には実質的には保持時間(Retention Time=RT))にMS1スペクトルを並べ、或る分画及び質量電荷比における信号強度値をそれぞれ例えば濃淡や表示色に対応させることにより、実際には3次元データである多数のMS1スペクトルをヒートマップ(heatmap)と呼ばれる2次元画像で表すことができる。このヒートマップにおいて濃く示される点は重要なピークであると考えられるから、このようなピークを見つけて該ピークの位置、つまりはヒートマップ上での位置座標(RT,m/z)をプリカーサイオン候補として選択すればよい。
a)分画試料間で各分画試料に対するマススペクトルの信号強度を正規化するように信号強度値を修正する正規化処理ステップと、
b)前記正規化処理ステップにおいて正規化された各分画試料に対するマススペクトルデータに基づいて作成される、分離用パラメータ及び質量電荷比を2軸としその2軸に直交する軸に信号強度をとった3次元グラフにおいて、質量電荷比毎に分離用パラメータ軸方向に信号強度を並べて得られる2次元波形のベースラインを求めてこれを該2次元波形から差し引く減算処理ステップと、
を有することを特徴としている。
a)各種物質が含まれる試料を所定の分離用パラメータに従って分離し、それを分画して得られた複数の分画試料をそれぞれ質量分析してマススペクトルデータを収集する分析実行部と、
b)分画試料間で各分画試料に対するマススペクトルの信号強度を正規化するように信号強度値を修正する正規化処理部と、
c)前記正規化処理部により正規化された各分画試料に対するマススペクトルデータに基づいて作成される、分離用パラメータ及び質量電荷比を2軸としその2軸に直交する軸に信号強度をとった3次元グラフにおいて、質量電荷比毎に分離用パラメータ軸方向に信号強度を並べて得られる2次元波形のベースラインを求めてこれを該2次元波形から差し引く減算処理部と、
を備えたことを特徴としている。
これにより、主要なピーク及びその近傍でベースラインの極端な変動が抑えられるので、ピーク近傍でのベースライン除去が過大になることを避けることができる。
上記減算処理ステップによるベースライン減算処理によってコンタミナントピークが除去されたマススペクトルに基づいて、MSn分析(nは2以上の整数)のためのプリカーサイオンを決定するプリカーサイオン選択ステップ、をさらに有するものとするとよい。
上記減算処理部によるベースライン減算処理によってコンタミナントピークが除去されたマススペクトルに基づいて、MSn分析(nは2以上の整数)のためのプリカーサイオンを決定するプリカーサイオン決定部と、
該プリカーサイオン決定部により決定されたプリカーサイオンを解離対象に設定したうえで、該プリカーサイオンが得られる分画試料に対するMSn分析を実行するように各部を制御するMSn分析制御部と、
をさらに備える構成とすることができる。
いま、保持時間に従って各分画試料に順に連続的に付与された分画番号をw(ただしw=1,2,…)、一つの分画試料においてそれぞれ質量電荷比に対応するサンプリング点に質量電荷比の順に連続的に付与されたサンプリング番号をm(ただしm=1,2,…)とする。したがって、wは或る保持時間、mは或る質量電荷比に対応している。また、分画番号w及びサンプリング番号mにおけるMS1スペクトルの信号強度をRwmとする。さらに、分画試料毎に、主要なピーク及びその近傍を除いたサンプリング点集合Nwを、次の(1)式で定義する。
Nw={m|Rwm <α1Mw } …(1)
ここで、Mw =max{Rwm|m=1,2,…}である。また、パラメータα1(0<α1<1}はピーク近傍か否かを判定するための閾値であり、このα1がピーク近傍の質量電荷比範囲を決定する。
R'w+1m=Rw+1m×(ΣRwm'/ΣRw+1m') …(2)
なお、(2)式の分母及び分子のΣは、分画番号がw、w+1である分画試料に対するMS1スペクトルにおいて、いずれも主要なピーク及びピーク近傍を除く質量電荷比範囲でのデータの集合Nw∩Nw+1に含まれるm'についての総和である。このとき、総和を計算する範囲を主要なピークの影響がない質量電荷比範囲に限定する理由は、ペプチド等の目的物質を含む分画試料においてそれら目的物質由来のピークの信号強度が、正規化処理によって過小になることを避けるためである。
なお、上述したように、隣接する分画試料におけるMS1スペクトルを基準とするのではなく、或る一つの分画試料、例えば1番目の分画試料におけるMS1スペクトルを基準として、他の全ての分画試料におけるMS1スペクトルの信号強度を正規化するようにしてもよい。
ベースライン減算処理の演算手法は以下の通りである。
rwm =min{ Rwm ,α2Am } …(3)
ここで、Am=Average{Rwm |w=1,2,… }である。ただし、パラメータα2(0<α2<1}はこの2次元波形上でピーク近傍か否かを判定するための閾値であり、このα2がピーク近傍の保持時間範囲(分画試料の範囲)を決定する。
<Rwm>=Rwm−Σrw+w'm …(4)
ここでΣはw'=−HからHまでの総和であり、このパラメータHは移動平均を求めるためのウインドウの半値幅である。
このようにして、分画試料に依らず同じ質量電荷比に現れるコンタミナントピークを効果的に除去することができる。一方で、元の試料に含まれる目的物質に由来するピークは限られた分画試料にのみ現れるので、保持時間方向にみた2次元波形においてベースラインとはならず、上記処理では除去されずに残る。その結果、コンタミナントピークのみを効果的に除去したMS1スペクトルを得ることができる。
例えば、自動的にプリカーサイオンを決定する場合には、予め設定された測定時間の制約からMS2分析の実行回数Nを計算し、多数のプリカーサイオン候補の中から信号強度の高い順にN個のピークを抽出してプリカーサイオンと定めることができる。また、同じ分画試料に対してレーザ光照射を多数回繰り返すと、目的物質自体が枯渇して信号が出なくなるおそれもある。そこで、一つの分画試料に対しMS2分析を実行する回数に制約を設けた上で、上記のようなアルゴリズムで以てプリカーサイオンを決定してもよい。また、目的物質の保持時間や質量電荷比についての事前情報が得られている場合には、そうした情報を利用してプリカーサイオン候補を絞り込んだ上で適宜の数のプリカーサイオンを決定してもよい。
11…液体クロマトグラフ(LC)部
12…分取分画部
13…質量分析(MS)部
2…制御部
3…データ処理部
31…スペクトルデータ収集部
32…正規化処理部
33…ベースライン減算処理部
34…二次元ピーク検出部
35…プリカーサイオン選択処理部
4…入力部
5…表示部
Claims (8)
- 各種物質が含まれる試料を所定の分離用パラメータに従って分離し分画して得られた複数の分画試料をそれぞれ質量分析することで収集されたマススペクトルデータを処理するデータ処理方法であって、
a)分画試料間で各分画試料に対するマススペクトルの信号強度を正規化するように信号強度値を修正する正規化処理ステップと、
b)前記正規化処理ステップにおいて正規化された各分画試料に対するマススペクトルデータに基づいて作成される、分離用パラメータ及び質量電荷比を2軸としその2軸に直交する軸に信号強度をとった3次元グラフにおいて、質量電荷比毎に分離用パラメータ軸方向に信号強度を並べて得られる2次元波形のベースラインを求めてこれを該2次元波形から差し引く減算処理ステップと、
を有することを特徴とする質量分析データ処理方法。 - 請求項1に記載の質量分析データ処理方法であって、
前記正規化処理ステップでは、主要なピークが出現する範囲を除外した質量電荷比又は質量電荷比範囲におけるマススペクトルの信号強度に基づいて正規化を行うことを特徴とする質量分析データ処理方法。 - 請求項1又は2に記載の質量分析データ処理方法であって、
前記減算処理ステップでは、前記2次元波形の中で所定の上限値を超える信号強度を該所定の上限値又はそれよりも小さい所定の値に置換したうえでベースラインを差し引く処理を実行することを特徴とする質量分析データ処理方法。 - 請求項1〜3に記載の質量分析データ処理方法であって、
前記減算処理ステップによるベースライン減算処理によってコンタミナントピークが除去されたマススペクトルに基づいて、MSn分析(nは2以上の整数)のためのプリカーサイオンを決定するプリカーサイオン選択ステップ、をさらに有することを特徴とする質量分析データ処理方法。 - a)各種物質が含まれる試料を所定の分離用パラメータに従って分離し、それを分画して得られた複数の分画試料をそれぞれ質量分析してマススペクトルデータを収集する分析実行部と、
b)分画試料間で各分画試料に対するマススペクトルの信号強度を正規化するように信号強度値を修正する正規化処理部と、
c)前記正規化処理部により正規化された各分画試料に対するマススペクトルデータに基づいて作成される、分離用パラメータ及び質量電荷比を2軸としその2軸に直交する軸に信号強度をとった3次元グラフにおいて、質量電荷比毎に分離用パラメータ軸方向に信号強度を並べて得られる2次元波形のベースラインを求めてこれを該2次元波形から差し引く減算処理部と、
を備えたことを特徴とする質量分析装置。 - 請求項5に記載の質量分析装置であって、
前記正規化処理部は、主要なピークが出現する範囲を除外した質量電荷比又は質量電荷比範囲におけるマススペクトルの信号強度に基づいて正規化を行うことを特徴とする質量分析装置。 - 請求項5又は6に記載の質量分析装置であって、
前記減算処理部は、前記2次元波形の中で所定の上限値を超える信号強度を該所定の上限値又はそれよりも小さい所定の値に置換したうえでベースラインを差し引く処理を実行することを特徴とする質量分析装置。 - 請求項5〜7のいずれかに記載の質量分析装置であり、選択された特定の質量電荷比を持つプリカーサイオンを1段階又は多段階解離させ、それによって生成されたプロダクトイオンを質量分析するMSn分析(nは2以上の整数)が可能な質量分析装置において、
前記減算処理部によるベースライン減算処理によってコンタミナントピークが除去されたマススペクトルに基づいて、MSn分析(nは2以上の整数)のためのプリカーサイオンを決定するプリカーサイオン決定部と、
該プリカーサイオン決定部により決定されたプリカーサイオンを解離対象に設定したうえで、該プリカーサイオンが得られる分画試料に対するMSn分析を実行するように各部を制御するMSn分析制御部と、
をさらに備えることを特徴とする質量分析装置。
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