JP5786776B2 - 物質同定方法及び該方法に用いられる質量分析システム - Google Patents

Description

本発明は、ＭＳⁿ測定（ただしｎは２以上の整数）を行うことが可能な質量分析装置を用いて試料に含まれる物質を同定する物質同定方法、及び、該方法により試料中の物質を同定するための質量分析システムに関する。

生命科学の研究や医療、医薬品開発などの分野においては、生体試料を対象として、タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖など様々な物質を網羅的に同定することがますます重要になってきている。特にタンパク質やペプチドを対象とするこうした網羅的な解析手法はショットガン・プロテオミクス（Shotgun Proteomics）と呼ばれている。こうした解析のためには、ＬＣ（液体クロマトグラフ）やＣＥ（キャピラリ電気泳動）などのクロマトグラフィと、ＭＳⁿ型質量分析装置（タンデム型質量分析装置）とを組み合わせた分析手法が非常に威力を発揮している。

ＭＳⁿ型質量分析装置を用いた生体試料中の各種物質の一般的な網羅的同定法の手順は次のとおりである。
［ステップ１］分析対象である試料に含まれる各種物質をＬＣ、ＣＥ等により分離し、その溶出液を分取・分画して多数のサンプルを調製する（以下、分取・分画により得られた個々のサンプルを「分画試料」と呼ぶ）。なお、試料を分取・分画する際には、予め決めた一定の時間間隔で分画を行う又は一定量の試料液を採取するように分画を行うことにより、該試料中の物質ができるだけ漏れなくいずれかの分画試料に含まれるようにする。

［ステップ２］各分画試料に対しＭＳ¹測定をそれぞれ行ってＭＳ¹スペクトルを取得し、該ＭＳ¹スペクトル上で同定対象の物質群に由来すると推測し得るピークを選択する。
［ステップ３］上記ステップ２で選択されたピークをプリカーサイオンに設定して当該分画試料に対しＭＳ²測定を実行し、その測定結果に基づくデータベース検索やデノボシーケンスサーチを行い、その分画試料に含まれる物質を同定する。

［ステップ４］充分な確度で特定の物質が同定されなかった場合には、ＭＳ¹スペクトル上で見つけた別のピークをプリカーサイオンに設定してＭＳ²測定を実行するか、或いは、ＭＳ²スペクトル上で観測される特定のイオンをプリカーサイオンとしたさらに高次（つまりｎが３以上）のＭＳⁿ測定を実行し、その測定結果に基づくデータベース検索やデノボシーケンスサーチなどにより、分画試料に含まれる物質を同定する。
［ステップ５］上記ステップ２〜４の処理を複数の分画試料に対してそれぞれ行い、元の試料に含まれている様々な物質を網羅的に同定する。

上記のような網羅的同定において、高い確度で以て物質を同定するには、同一の分画試料に含まれる物質の種数が少ない（できれば１種類のみである）ことが望ましい。しかしながら、そのためには１つの分画の時間を短くする必要があり、そうすると分画数自体が非常に多くなってしまう。そこで、限られた測定時間又は測定回数でできるだけ多くの物質を同定するためには、つまり、網羅的同定のスループットを向上させるためには、ＭＳ¹スペクトル上で観測される複数のピークの中で、同定に成功する確率（以下「同定確率」という）が高いピークを優先的にプリカーサイオンとして選択し且つ適切な測定条件で以てＭＳⁿ測定を行う必要がある。

或る試料に対して得られたＭＳ¹スペクトル上で観測されるピークの中からＭＳ²測定のためのプリカーサイオンを選択する方法としては、ピーク強度が高いものから順に選択する方法が従来知られている（特許文献１参照）。或る１つの試料に対してＭＳ²測定を実行する時間や回数に制約がある場合には、ピーク強度の高い順に所定個数のピークに対応するイオンをプリカーサイオンとして選択する等の制御が行われている。他方、測定時間又は測定回数が充分に確保できる場合には、プリカーサイオンの選択個数に制約を設けずに、信号強度が所定閾値以上であるピークを全て抽出してプリカーサイオンとする方法も知られている。

これらの方法はあくまでも、ピーク強度の高いイオンが同定確率が高いとの仮定に基づいていると考えられる。この仮定自体は定性的に誤りであるというわけではないが、ピーク強度の高さは必ずしも同定確率の高さを示すものではない。そのため、プリカーサイオン候補であるピークが複数存在するときに、いずれのピークでも同程度の高い確率で以て同定に至る場合と、一部のピークしか同定に至ることが期待できない場合とがあるが、ピーク強度からそうした状況の相違を充分に識別することはかなり困難である。即ち、ＭＳ¹スペクトル上の各ピークに対する同定確率を事前に、つまりＭＳ²測定の実行前に、定量的に評価する方法は従来確立されておらず、このことが網羅的同定の効率を下げる大きな要因となっている。

特許第３７６６３９１号公報

アレクセイ・ナコルチェフスキー（Aleksey Nakorchevsky）、ほか１名、「エクスプローリング・データ-デペンデント・アクイジション・ストラテジーズ・ウィズ・ジ・インストゥルメント・コントロール・ライブラリーズ・フォー・ザ・サーモ・サイエンティフィック・インストゥルメンツ（Exploring Data-Dependent Acquisition Strategies with the Instrument Control Libraries for the Thermo Scientific Instruments）」、58th ASMS Conference、2010年

換言すれば、ＭＳ^n-1スペクトル上の各ピークに対する同定確率を定量的に評価することが可能であれば、そうした定量的な評価結果に基づいて、より適切なピークをプリカーサイオンとして選択したりより適切な順序で複数のピークをプリカーサイオンとして選択したりすることが可能である。こうした課題に対し、本願出願人は、既に特願２０１１−２４４６００号において、ＭＳ²測定を実行する前にそのＭＳ²測定結果を利用した物質同定の確率を定量的に推定する新規の手法を提案している。

本発明は上記提案の同定確率推定手法の技術思想を利用して、試料中に含まれる多数の物質を効率的に、つまりはできるだけ少ない測定回数で以て又はできるだけ短い測定時間で以て得られた質量分析データに基づき高い確度で同定することができる、物質同定方法、及び該方法に用いられる質量分析システムを提供することを主たる目的としている。

上記課題を解決するために成された第１発明は、各種物質が含まれる試料を分離用パラメータに従って分離し分画することで得られた複数の分画試料に対しＭＳⁿ測定（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することで得られたＭＳⁿスペクトルに基づいて、各分画試料に含まれる物質を同定する物質同定方法であって、
a)所定の試料から得られた複数の分画試料に対するＭＳ^n-1測定により求まるＭＳ^n-1ピークのＳＮ比、及び該各ＭＳ^n-1ピークをプリカーサイオンとして実行されたＭＳⁿ測定の結果に基づく物質同定の結果を利用して、同種試料に由来するＭＳ^n-1ピークのＳＮ比と複数のＭＳ^n-1ピークをＳＮ比順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳⁿ測定及び同定を実行していったときに充分な確度で何らかの物質が同定できたピークの累積数との関係を示す同定確率推定モデルを求め、該同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶する同定確率推定モデル構築ステップと、
b)同定対象である目的試料から得られた少なくとも１つの分画試料に対するＭＳ^n-1測定が終了した状況で、そのＭＳ^n-1測定により求まったＭＳ^n-1ピークの中で、プリカーサイオンの候補となる複数のＭＳ^n-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出するピークＳＮ比算出ステップと、
c)前記同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、前記ピークＳＮ比算出ステップで算出されたＭＳ^n-1ピークのＳＮ比から該ＭＳ^n-1ピークの同定確率推定値を算出する同定確率推定ステップと、
d)前記プリカーサイオン候補となる複数のＭＳ^n-1ピークについてそれぞれ推定された同定確率推定値を用いて、該複数のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定の優先順位を決定するＭＳⁿ測定順位決定ステップと、
を有することを特徴としている。

また上記課題を解決するために成された第２発明は、各種物質が含まれる試料を分離用パラメータに従って分離し分画することで得られた複数の分画試料に対しＭＳⁿ測定（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することで得られたＭＳⁿスペクトルに基づいて、各分画試料に含まれる物質を同定するために用いられる質量分析システムであって、
a)所定の試料から得られた複数の分画試料に対するＭＳ^n-1測定により求まるＭＳ^n-1ピークのＳＮ比、及び該各ＭＳ^n-1ピークをプリカーサイオンとして実行されたＭＳⁿ測定の結果に基づく物質同定の結果を利用して求められた、同種試料に由来するＭＳ^n-1ピークのＳＮ比と複数のＭＳ^n-1ピークをＳＮ比順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳⁿ測定及び同定を実行していったときに充分な確度で何らかの物質が同定できたピークの累積数との関係を示す同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶しておく同定確率推定モデル情報記憶手段と、
b)同定対象である目的試料から得られた少なくとも１つの分画試料に対するＭＳ^n-1測定が終了した状況で該分画試料に対するＭＳⁿ測定を実行するに先立って、そのＭＳ^n-1測定により求まったＭＳ^n-1ピークの中で、プリカーサイオンの候補となる複数のＭＳ^n-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出するピークＳＮ比算出手段と、
c)前記同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、前記ピークＳＮ比算出手段で算出されたＭＳ^n-1ピークのＳＮ比から該ＭＳ^n-1ピークの同定確率推定値を算出する同定確率推定手段と、
d)前記プリカーサイオン候補となる複数のＭＳ^n-1ピークについてそれぞれ推定された同定確率推定値を用いて、該複数のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定の優先順位を決定するＭＳⁿ測定順位決定手段と、
を備え、前記ＭＳⁿ測定順位決定手段で決定された優先順位に従って前記分画試料に対するＭＳⁿ測定を実行することを特徴としている。

本発明において、試料に含まれる各種物質を分離する手段はＬＣ、ＣＥなどである。該手段がＬＣなどカラムを用いたものである場合には、上記分離用パラメータとは時間（保持時間）である。即ち、或る１つの分画試料は所定の時間範囲内にカラムから溶出してきた１乃至複数の物質を含む。また、試料に含まれる各種物質を分離する手段がＣＥである場合には、上記分離用パラメータとは移動度である。

また、ＭＳⁿスペクトルに基づいて物質を同定する同定方法は特に限定されず、例えばデノボシーケンスサーチ、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ、など任意のアルゴリズムを用いることができる。ただし、同定確率推定モデル構築ステップ（及び手段）において同定を実行するときと、目的試料から得られた同定試料に対して同定を実行するときとでは、同じアルゴリズムを使用する必要がある。

第１発明に係る物質同定方法において同定確率推定モデル構築ステップでは、ＭＳ^n-1測定、ＭＳⁿ測定、及びその測定結果を利用した同定結果（同定の成否）が全て得られているデータを用いて、同定確率推定モデル情報を求める。同定確率推定モデルは、複数（通常はかなり多数）のＭＳ^n-1ピークのＳＮ比と、その複数のＭＳ^n-1ピークをＳＮ比の高い順又は低い順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳⁿ測定及び同定を実行していったときに充分な確度で何らかの物質が同定できた、つまりは同定に成功したピークの累積数と、の関係を示す。したがって、この同定確率推定モデルは、全てのＭＳ^n-1ピークの中で、或るＳＮ比を示す１つのＭＳ^n-1ピークよりもＳＮ比が高い又は低いＭＳ^n-1ピークが同定成功となる割合を示している。なお、或るＭＳ¹ピークのＳＮ比は、そのＭＳ¹ピークの信号強度と、該ピークが存在するＭＳ¹スペクトル（ノイズ除去などの加工がされていないプロファイル）から求めたノイズレベルとから求まるものとすることができる。

具体的には、複数のＭＳ^n-1ピークをＳＮ比の高い順又は低い順に１つずつ選択した累積数と、その中で同定に成功したＭＳ^n-1ピークの総数との関係は、階段状に増加する形状になる。そこで、上記同定確率推定モデル構築ステップでは例えば、ＭＳⁿピークの累積数と同定成功数との連続的な関係を求めるべくフィッティングを行って滑らかなフィッティングカーブを求め、このカーブの形状を示す関数式又はその関数式に含まれる係数、定数を同定確率推定モデル情報とすればよい。

なお、適切な同定確率推定モデルは試料の種類、より厳密には試料に含まれる各種物質の種類に依存する。換言すれば、同定対象の物質の種類が同一又は類似していれば、同一の同定確率推定モデル情報を用いることができる。例えば生体試料中のタンパク質を同定するといった目的に対しては、同定済みのタンパク質を各種物質として含む試料について得られたＭＳ^n-1ピーク等に基づいて同定確率推定モデル情報を取得しておけばよい。

含有物質が未知である試料から得られた或る１つの分画試料に対してＭＳ^n-1測定を行うことで得られたＭＳ^n-1スペクトル上で観測される複数のＭＳ^n-1ピークについて、例えばＭＳⁿ測定を実行する前に、ピークＳＮ比算出ステップでは各ＭＳ^n-1ピークのＳＮ比を算出する。ＳＮ比の算出方法は同定確率推定モデル作成時と同方法とする。同定確率推定ステップでは、同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、各ＭＳ^n-1ピークのＳＮ比から同定確率推定値をそれぞれ算出する。これにより、実際に或るＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定を行うことなく、そのＭＳⁿ測定を実行した結果に基づく同定成否の推定確率が定量的に求まる。さらにＭＳⁿ測定順位決定ステップでは、プリカーサイオン候補となる複数のＭＳ^n-1ピークについて上述したようにそれぞれ推定された同定確率推定値を用いて、該複数のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定の優先順位を決定する。

例えば、１つの分画試料に対してプリカーサイオン候補として抽出されるＭＳ^n-1ピークの個数が１つの分画試料に対して実施されるＭＳⁿ測定実行回数を超えている場合には、上記優先順位に従って順に所定個数のプリカーサイオン候補に対してＭＳⁿ測定を実行すればよい。この場合、優先順位の低い１乃至複数個のプリカーサイオン候補についてはＭＳⁿ測定が実行されない。

１つの分画試料に対して実施が許可されるＭＳⁿ測定実行回数が１つの分画試料に対してプリカーサイオン候補として抽出されるＭＳ^n-1ピークの個数を超えている場合には、１つのＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定を複数回実行し、その各ＭＳⁿ測定で得られたＭＳⁿスペクトルデータを積算することが可能である。ＭＳⁿスペクトルデータ積算によって積算前に比べてＭＳⁿスペクトルのＳＮ比が向上し、それによって同定確率の改善が期待できる。その同定確率の改善の程度は元の同定確率が高いほど大きいとは限らない。即ち、ＭＳ^n-1ピークに対する２回目又は３回目（或いはそれ以上の回数）のＭＳⁿ測定を実行する場合にそのときの優先順位は、同定確率推定値ではなく同定確率の改善の程度に基づいて決められることが好ましい。

そこで、第１発明に係る物質同定方法では、好ましくは、
前記プリカーサイオン候補となる複数のＭＳ^n-1ピークについて前記同定確率推定ステップにおいてそれぞれ推定された同定確率推定値に基づいて、同一のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定を複数回行ってその測定結果を積算したときの同定確率の増加度合である同定確率増分推定値を求める同定確率増分推定ステップをさらに有し、
前記ＭＳⁿ測定順位決定ステップでは、前記同定確率推定ステップによる各ＭＳ^n-1ピークの同定確率推定値と、前記同定確率増分推定ステップによる同定確率増分推定値とに基づいて、同一ＭＳ^n-1ピークに対する複数回のＭＳⁿ測定を許容する条件の下で複数のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定の優先順位を決定するとよい。
また、第２発明に係る質量分析システムでも同様である。

さらにまた、上記物質同定方法では、１つの分画試料に対するＭＳⁿ測定実行回数の上限の下で、前記ＭＳⁿ測定順位決定ステップで決定された優先順位と各ＭＳ^n-1ピークのＳＮ比とに基づいて、複数のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定を実行するための測定シーケンスを決定するＭＳⁿ測定シーケンス決定ステップを有するものとするとよい。
ここでいう測定シーケンスとは、同一のＭＳ^n-1ピークに対する複数回のＭＳⁿ測定の実行を含めた同一分画試料に対する全てのＭＳⁿ測定の手順のことである。

この発明によれば、１つの分画試料に対するＭＳⁿ測定回数に拘わらず、同定される物質数の期待値が常に最大となるように測定シーケンスが定められる。これにより、同じ測定時間又は測定回数の下で最大限の数の物質の同定が可能となる。

また、第１発明に係る物質同定方法では、前記目的試料に対する測定に先立って前記所定の試料に対する測定を実行し、前記同定確率モデル構築ステップではその測定結果に基づいて同定確率推定モデルを作成することが好ましい。同定確率モデル構築用の所定試料に対する測定を目的試料に対する測定の直前に実行することにより、例えばノイズ環境が殆ど同一である等、測定条件がほぼ揃う。それにより、所定試料について求めた同定確率推定モデルの適用精度が向上し、同定確率推定値自体の精度も向上して、より的確な優先順位を求めることが可能となる。

また、第１発明に係る物質同定方法では、分画試料に対するＭＳⁿ測定の実行に先立って、前記ピークＳＮ比算出ステップ、前記同定確率推定ステップ、前記ＭＳⁿ測定順位決定ステップ、及びＭＳⁿ測定シーケンス決定ステップによる一連の処理により該分画試料に対するＭＳⁿ測定の測定シーケンスを決定するとよい。この場合、１つの分画試料に対して決められた測定シーケンスに従って複数のＭＳ^n-1ピークのそれぞれをプリカーサイオンとしたＭＳⁿ測定を実行すればよいので、ＭＳⁿ測定の制御は簡単で済む。

また、第１発明に係る物質同定方法では、分画試料に対するＭＳⁿ測定の実行に先立って、前記ピークＳＮ比算出ステップ、前記同定確率推定ステップ、前記ＭＳⁿ測定順位決定ステップ、及びＭＳⁿ測定シーケンス決定ステップによる一連の処理により該分画試料に対するＭＳⁿ測定の測定シーケンスを決定するとともに、該測定シーケンスに従ってＭＳⁿ測定を開始しその測定の途中段階で得られた同定結果を利用してその測定シーケンスを変更するようにしてもよい。

例えば、測定シーケンスに従って順次異なる又は同一のＭＳ^n-1ピークについてＭＳⁿ測定を実行する途中で、ＭＳⁿ測定結果に基づく同定ができない状態が続いたならば、その時点でその測定シーケンスに従ったＭＳⁿ測定を中止し、次の分画試料に対するＭＳⁿ測定及び同定処理に移行してもよい。これにより、同定確率推定モデルと実際の同定結果との乖離がある程度存在する場合に、無駄なＭＳⁿ測定の実行をできるだけ少なくし、同定効率が下がることを回避することができる。

第１発明に係る物質同定方法及び第２発明に係る質量分析システムによれば、ＭＳ^n-1測定結果から複数のＭＳ^n-1ピークがプリカーサイオン候補として抽出された場合に、そのＭＳⁿ測定や同定処理を行う前に、同定される物質数の期待値が最大になるようにプリカーサイオンを選択したり、異なる又は同一のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定の順序を定めたりすることができる。それにより、例えば、従来と同程度の数の物質の同定を成功させるのに要する測定時間を短縮する又は測定回数を減らすことができる。また、従来と同じ測定時間や測定回数であれば、それだけ多くの物質を同定することができるようになる。

本発明に係る物質同定方法を実施する質量分析システムの概略ブロック構成図。 本発明に係る物質同定方法における同定確率推定モデル構築の際の処理フローチャート。 本発明に係る物質同定方法において同定確率推定モデルに基づくＭＳ²測定シーケンス最適化処理のフローチャート。 ノイズレベル評価処理を説明するためのＭＳ¹プロファイル（マススペクトル）の一例を示す図。 ２つのＭＳ¹プロファイルに対するノイズレベル算出結果例を示す図。 質量電荷比m/zとＳＮ比とに対するＭＳ¹ピークの分布状況の一例を示す図。 ＭＳ¹ピークをＳＮ比で順位付けしたときの、同定に成功したＭＳ¹ピークの経験累積分布関数の概念を示す模式図。 同定に成功したＭＳ¹ピークの経験累積分布関数、該分布関数に対するフィッティング関数、及び該フィッティング関数に基づく同定確率推定値の変化を示す図。 通常のデータ積算回数（１回）における同定確率の推定値とＭＳ¹ピークのＳＮ比との関係、並びに２及び３倍のデータ積算時の同定確率増分推定値とＭＳ¹ピークのＳＮ比との関係を示す図。 ＳＮ比が相違する５個のＭＳ^n-1ピークに対する同定確率推定値並びに２及び３倍のデータ積算による同定確率増分推定値を示す図。

以下、本発明に係る物質同定方法の一実施例、及び該方法による物質同定を実施するための質量分析システムの一実施例について、添付の図面を参照して詳細に説明する。

本発明に係る物質同定方法は、目的試料からＬＣ等により分離・分画されることで得られた多数の分画試料に対し、それぞれＭＳ^n-1測定を実行して得られるＭＳ^n-1スペクトル上に現れる１又は複数のＭＳ^n-1ピークをプリカーサイオンに選出して該プリカーサイオンに対するＭＳⁿ測定を行い、それにより得られるＭＳⁿスペクトルを利用して目的試料に含まれる各種物質を同定する質量分析システム（又は化合物同定システム）において、実際にＭＳⁿ測定を実行する前に、ＭＳ^n-1スペクトル上のＭＳ¹ピークについて物質の同定が成功する確率を定量的に推定し、それに基づいてＭＳⁿピークの選択の順序等を含むＭＳⁿ測定シーケンスを最適化又はそれに近い状態とするための処理に特徴を有する。

まず、本発明におけるＭＳⁿ測定シーケンス最適化方法を１つの具体例を挙げて説明する。
この例による方法では、予備的に、つまり同定対象である目的試料の測定及び同定処理に先立って、多くの物質を含む同定確率推定モデル構築用試料（以下、単に「モデル構築用試料」という）に対する測定及び同定処理の結果を利用して、同定確率推定モデルを作成しておく。この同定確率推定モデルは、ＭＳ²測定及び同定実行前のＭＳ¹ピークをプリカーサイオンとしてＭＳ²測定及び同定処理を実行したと仮定したときに同定が成功する確率を推測するための参照データである。モデル構築用試料は目的試料と同種、例えば目的試料がペプチド混合物である場合にはモデル構築用試料もペプチド混合物であることが好ましい。

図２は同定確率推定モデル構築処理の手順を示すフローチャートである。図２により同定確率推定モデルを作成する手順を詳細に説明する。

［ステップＳ１１］同定確率推定モデル構築用データの収集
まず、モデル構築用試料をＬＣで分離して、所定の分画時間毎に分取された多数の分画試料を調製する。そして、各分画試料に対しＭＳ¹測定が実施され、ＭＳ¹スペクトルデータが収集される。さらに、このＭＳ¹スペクトルデータに基づいて抽出される各ＭＳ¹ピークに対して、１回のＣＩＤ操作を加えたＭＳ²測定が実施されてＭＳ²スペクトルデータが収集され、そのＭＳ²スペクトルデータを用いた同定処理が試みられる。

上述したように保持時間に応じて分画された各分画試料に含まれる物質を同定する場合には、各分画試料のＭＳ¹スペクトルを保持時間の順に並べて３次元的なＭＳ¹スペクトルを求める。そして、該３次元ＭＳ¹スペクトルに対して質量電荷比m/z−保持時間の２次元平面上でピーク検出を行ってＭＳ¹ピークを抽出し、該ＭＳ¹ピークの質量電荷比をプリカーサイオンとしてＭＳ²測定を行いＭＳ²スペクトルを取得する。そして、そのＭＳ²スペクトルに基づいて所定の同定アルゴリズム（例えばデノボシーケンスサーチやＭＳ／ＭＳイオンサーチなど）により物質の同定を試みる。この同定はＭＳ¹ピーク毎に行われるから、３次元ＭＳ¹スペクトルから抽出されるＭＳ¹ピーク毎に同定の成功又は失敗（同定できず）が決まる。

［ステップＳ１２］ＭＳ¹スペクトルのノイズレベルの評価
後述する同定確率はＭＳ¹スペクトルのノイズレベルの影響を受ける。そこで、モデル構築用試料に対するＭＳ¹スペクトルのノイズレベルを評価する。本例では、次のステップＳ１２１〜Ｓ１２３の手順により、 ＭＳ¹測定により得られた生データ（加工されていないデータ）であるＭＳ¹ロー（raw）プロファイル（以下、単に「ロープロファイル」という）からノイズレベルを分画試料毎に、つまりＭＳ¹スペクトル毎に評価する。以下の説明では、離散化されたロープロファイルの信号強度をＲ_mとおく。ただし、ｍ＝０、１、…は、評価対象である試料のロープロファイルの、サンプリング点における質量電荷比の順序を示す番号である。ロープロファイルに含まれるサンプリング点全体の集合はＭで表すものとする。

［ステップＳ１２１］ピーク部分及びピーク近傍の情報の除外
ロープロファイルの最大ピーク強度をＰ^(max)とおく。つまり、次の(1)式のようにおく。
Ｐ^(max)＝ max Ｒ_m …(1)
（ただしｍ∈Ｍ）
ここで、ピーク近傍の判定用閾値μ（０＜μ＜１）を適宜に選び、信号強度が最大ピーク強度Ｐ^(max)のμ倍以上であるサンプリング点をピーク部分であるとみなす。そして、ピーク部分に含まれるサンプリング点、つまり信号強度がμ・Ｐ^(max)以上であるサンプリング点からの距離がｗ以内であるサンプリング点、を除いたサンプリング点の集合Ｍ’(ｗ，μ)を求める。図４（ａ）はm/z 1060-m/z 1080の範囲についてＭＳ¹スペクトルのロープロファイルに対しサンプリング点集合Ｍ’(ｗ，μ)を求めた例であり、図４（ｂ）は（ａ）のm/z 1070-m/z 1075の範囲の拡大図である。

［ステップＳ１２２］局所的な信号変動量の算定
次に、上記ピーク部分とピーク近傍とを除外したサンプリング点集合Ｍ’(ｗ，μ)において、通過帯域が半値幅ｗであるフィルタによりロープロファイルを平滑化した、平滑化プロファイル^*Ｒ_m(ｗ，μ)を求める。つまり、^*Ｒ_m(ｗ，μ)は次の(2)式で求まる。
^*Ｒ_m(ｗ，μ)＝｛１／（２ｗ＋１）｝ΣＲ_m' …(2)
（ただしｍ∈Ｍ’(ｗ，μ)）
ここで、Σはｍ’＝−ｗからｗまでの総和である。この平滑化プロファイル^*Ｒ_m(ｗ，μ)と元のロープロファイルとの差を局所的な信号変動量と定義し、ΔＲ_m(ｗ，μ)で表す。つまり、ΔＲ_m(ｗ，μ)は次の(3)式で求まる。
ΔＲ_m(ｗ，μ)＝Ｒ_m−^*Ｒ_m(ｗ，μ) …(3)

［ステップＳ１２３］局所的な信号変動量に基づくノイズレベルの算定
ここでは、上記局所的な信号変動量ΔＲ_m(ｗ，μ)の２乗平均のｃ倍をノイズレベルＮ(Ｒ_m；ｗ，μ)と定義する。ｃはノイズレベルを定義するための適当な定数である。つまり、Ｎ(Ｒ_m；ｗ，μ)の定義式は次の(4)式である。
Ｎ(Ｒ_m；ｗ，μ) ＝ｃ・√｛ΣΔＲ_m(ｗ，μ)²｝ …(4)
なお、ノイズレベルの定義は上記説明のものに限定されるわけではなく、ＭＳ¹スペクトルのノイズレベルを適切に定義できる方法でありさえすればよい。
実際の２つのＭＳ¹ロープロファイルに基づいて、上記方法によりノイズレベルＮ(Ｒ_m；ｗ，μ)を算定した結果の例を図５に示す。

［ステップＳ１３］同定成功ＭＳ¹ピークの抽出
図６は、モデル構築用試料由来の全てのＭＳ¹ピークの質量電荷比m/zとＳＮ比とをプロットした結果の例である。ここで、ＳＮ比はピーク強度とステップＳ１２で求めたノイズレベルとの比である。図６に□印で示したプロット点はＭＳ¹ピークを示している。また、●印で示したプロット点は、そのＭＳ¹ピークをプリカーサイオンとしたＭＳ²測定によって物質同定が可能であった、即ち、同定に成功したＭＳ¹ピークを示している。図６を見ると、この例では、ＳＮ比が大きいほど同定に成功するＭＳ¹ピークの割合が大きくなる傾向にあることが分かる。これは本例に限らず、一般的な傾向である。

［ステップＳ１４］ＭＳ¹ピークのＳＮ比と同定成功ＭＳ¹ピーク累積数との関係付け
ＳＮ比の大きい順にＭＳ¹ピークを抽出して「１」から順位付けし（つまりＭＳ¹ピークをＳＮ比が大きい順にソートして順位を付け）、その順位毎にそれまでに同定に成功したＭＳ¹ピークの数（累積数）を求めると、図７に示すように、累積数が右上がりの階段状に変化するグラフが描ける。図７中の実線で示す階段状の折れ線は、例えば、順位１のＳＮ比を示すＭＳ¹ピークは同定に成功し、順位１よりも低いＳＮ比である順位３のＳＮ比を示すＭＳ¹ピークは同定に失敗したことを意味している。この折れ線は、或るＳＮ比以上を示すＭＳ¹ピークのうち幾つのＭＳ¹ピークが同定に成功したのかを示す経験累積分布関数である。

ただし、図６から分かるように、この例では、同一の質量電荷比に対する複数のＭＳ¹ピーク（ＳＮ比は同一とは限らない）に対してそれぞれ個別に同定が行われている。そのため、質量電荷比の重なりが多いと、同定の成否に対する質量電荷比の重なりの影響が相対的に強くなり過ぎるおそれがある。そこで、これを避けるために、同一の質量電荷比であるＭＳ¹ピークＮ個（Ｎは２以上の整数）に対してそれぞれ同定がなされた場合には、個々の同定は１／Ｎ回であるとみなして経験累積分布関数を求めるほうが好ましい。図７に示した例では、順位１、２、４、５、及び８において同定に成功した場合を表しているが、図７中の実線は質量電荷比の重複を考慮しない経験累積分布関数である。ここで、順位２及び８に含まれる同定に成功した複数のＭＳ¹ピークが同一質量電荷比を有していた場合には、重複を考慮してその順位２、８のＭＳ¹ピークをそれぞれ１／２とカウントして、経験累積分布関数を図７中に一点鎖線で示すように修正する。

図６に示したＭＳ¹ピークの同定成否分布の例について、上述したように質量電荷比の重複を考慮した経験累積分布関数を求めると、図８中に示すような階段状のプロファイルが得られる。順位が大きくなるほど、つまりはＭＳ¹ピークのＳＮ比が下がるほど、同定に成功するＭＳ¹ピークの数は減るため、同定成功累積数は頭打ちになることが分かる。

［ステップＳ１５］同定確率推定モデルとパラメータの算出
ステップＳ１４で得られた階段状のプロファイルに対し解析的な関数を用いてフィッティングを行うことにより、ＳＮ比に従ったＭＳ¹ピークの累積数と同定成功累積数との滑らかなカーブ状の関係を求める。ここでは、フィッティング関数の形状として、次の(5)式の双曲線関数を用いた。
Ｎ^(ident)tanh（ｎ／Ｎ^(all)σ） …(5)
ただし、ｎは或る順位よりも上位順位であるＭＳ¹ピークの総数であり、Ｎ^(all)及びＮ^(ident)はそれぞれＭＳ¹ピークの総数及び同定に成功したＭＳ¹ピークの総数である。また、σはフィッティング関数の立ち上がりの速さを定めるパラメータであり、先に求めた階段状のプロファイルにフィットするように算出する。図８中に階段状のプロファイルにフィットさせたフィッティング関数を一点鎖線で示している。このフィッティング関数のカーブが同定確率推定モデルであり、σはこのモデルを規定するパラメータである。

なお、(5)式のフィッティング関数の傾きが１であるということは１００％、その傾きが０．５であるということは５０％の確率で以て同定に成功することを示している。したがって、フィッティング関数の微分である次の(6)式により、或るＭＳ¹ピークに対し、その順位値ｎから同定に成功する確率を推定することができる。
（Ｎ^(ident)／Ｎ^(all)σ）sech²（ｎ／Ｎ^(all)σ） …(6)
図８には上記微分関数で示される推定同定確率も重ねて示してある。

以上のような手順で、同定確率推定モデルを定めるパラメータσを算出することができるから、同定確率を推定するためにはこのパラメータσを記憶しておけばよい（ステップＳ１６）。

次に、上記のような同定確率推定モデルのパラメータが予め用意されている状況の下で、目的試料をＬＣで分離し分取することで得られた分画試料をＭＳ¹測定して求まるＭＳ¹スペクトルに基づいて、プリカーサイオンとして適切なＭＳ¹ピークを選択するとともに最適なＭＳ²測定のための測定シーケンスを決定する際の処理手順を、図３に示すフローチャートに従って説明する。

［ステップＳ２１］目的試料由来のＭＳ¹測定データの収集
まず、目的試料から調製された多数の分画試料に対してそれぞれＭＳ¹測定が実行され、ＭＳ¹スペクトルデータが収集される。そして、各分画試料のＭＳ¹スペクトルを保持時間の順に並べて３次元的なＭＳ¹スペクトルを求め、該３次元ＭＳ¹スペクトルに対して質量電荷比m/z−保持時間の２次元平面上でピーク検出を行ってＭＳ¹ピークを抽出する。これは試料の相違はあるものの、基本的にはステップＳ１１と同じ処理である。

［ステップＳ２２］ＭＳ¹スペクトルのノイズレベルの評価
次に、ステップＳ１２（Ｓ１２１〜Ｓ１２３）と同様の処理を行うことで、各分画試料に対するＭＳ¹スペクトルのノイズレベルをそれぞれ評価する。

［ステップＳ２３］ＭＳ¹ピークのＳＮ比の算出
ステップＳ２１で抽出されたＭＳ¹ピーク毎に、そのピーク強度と該ピークが存在する分画試料に対してステップＳ２２で算出されたノイズレベルとからＳＮ比を算出する。

［ステップＳ２４］同定確率推定モデルに基づくＳＮ比からの同定確率の推定
上述したようにパラメータσに基づいて同定確率推定モデル、つまりは図８に示したフィッティング関数が求まる。そして、このフィッティング関数の横軸を各順位に対応するＳＮ比に変換すれば、与えられたＳＮ比に対応する同定確率推定値ｐ₁（ｒ⁽¹⁾）が求まるカーブが得られる。ここで ｒ⁽¹⁾はＭＳ¹ピークのＳＮ比である。各順位をＳＮ比に変換するためには、例えば、ＭＳ¹ピークをＳＮ比に応じてソートする際に得られる順位とＳＮ比との関係を示す情報をテーブル等の形式で保持しておき、このテーブルを用いればよい。図９には、図８に示したフィッティング関数から求めた同定確率推定値ｐ₁（ｒ⁽¹⁾）のカーブを示す。このカーブを用いて、ＭＳ¹ピーク毎にそのＳＮ比から同定確率推定値を算出する。なお、この同定確率推定値ｐ₁（ｒ⁽¹⁾）のカーブが滑らかでないのは、同定確率推定モデル作成に使用したＭＳ¹ピークのＳＮ比が規則的なものでないからである。

［ステップＳ２５］データ積算回数を増加させたときの同定確率増分の推定
ステップＳ２４で得られる同定確率推定値ｐ₁（ｒ⁽¹⁾）は、通常の、つまりは同定確率推定モデル作成に用いたＭＳ²スペクトルデータと同条件のデータ積算回数で求めたＭＳ²スペクトルデータを用いた場合の同定確率である。即ち、同定確率推定モデル作成時にはＭＳ²スペクトルデータの積算を行っていないから、１回のＭＳ²測定により得られたデータである。それに対し、同じプリカーサイオンに対してＭＳ²測定をｕ回実行して、それら測定で得られたデータを積算すると、つまりデータ積算回数をｕ倍にすると、ＭＳ²スペクトルのＳＮ比は√ｕ倍になり、同定確率が向上することが期待される。このときの同定確率はＭＳ¹ピークのＳＮ比が√ｕ倍になった場合の同定確率にほぼ等しいと考えられる。すると、同じＭＳ¹ピークに対してＭＳ²スペクトルデータ積算回数を２倍（ｕ＝２）及び３倍（ｕ＝３）にした際の同定確率は、それぞれｐ₁（√２ｒ⁽¹⁾）、ｐ₁（√３ｒ⁽¹⁾） と表される。したがって、２回目、３回目のＭＳ²スペクトルデータ積算による同定確率の増分推定値はそれぞれ、(7)、(8)式に示すようになる。
ｐ₂（ｒ⁽¹⁾）＝ｐ₁（√２ｒ⁽¹⁾）−ｐ₁（ｒ⁽¹⁾） …(7)
ｐ₃（ｒ⁽¹⁾）＝ｐ₁（√３ｒ⁽¹⁾）−ｐ₁（√２ｒ⁽¹⁾） …(8)
この同定確率増分推定値ｐ₂（ｒ⁽¹⁾）及びｐ₃（ｒ⁽¹⁾）を示すカーブを図９に示す。

［ステップＳ２６］各ＭＳ¹ピークに対するＭＳ²測定の優先順位の決定
ステップＳ２４において得られた通常のＭＳ²スペクトルデータ積算（この例では積算なし）における各ＭＳ¹ピークに対する同定確率推定値と、ステップＳ２５で得られた２回目及び３回目のＭＳ²スペクトルデータ積算における各ＭＳ¹ピークに対する同定確率増分推定値とを用いて、ＭＳ²測定を実行する上でプリカーサイオンとして選択するＭＳ¹ピークの優先順位を決定する。

いま一例として、或る１つの分画試料に対するＭＳ¹スペクトル上で、Ｐ_A、Ｐ_B、Ｐ_C、Ｐ_D、Ｐ_Eの５個のＭＳ¹ピークがプリカーサイオン候補として抽出され、それらＭＳ¹ピークのＳＮ比が図１０中に示す位置にある場合を考える。なお、図１０（ａ）は図９と同じグラフであり、図１０（ｂ）は図１０（ａ）に示した各曲線をスムージングして得られたグラフである。ここでは、図１０（ｂ）を用いてＭＳⁿ測定の優先順位を決定するが、図１０（ａ）を用いてもよい。

図１０（ｂ）において、各ＭＳ¹ピークＰ_A、Ｐ_B、Ｐ_C、Ｐ_D、Ｐ_Eに対応して引かれた縦の破線とｐ₁（ｒ⁽¹⁾）、ｐ₂（ｒ⁽¹⁾）、ｐ₃（ｒ⁽¹⁾）の各曲線との交点が、それらＭＳ¹ピークにおける同定確率推定値及び同定確率増分推定値である。そこで、同定に成功する確率が高い順に、つまりは図中に白抜き下向き矢印で示す順で、各ＭＳ¹ピークの同定確率推定値又は同定確率増分推定値を抽出してゆき、それを、各ＭＳ¹ピークをプリカーサイオンとしたＭＳ²測定の優先順位とする。ただし、或る１つのＭＳ¹ピークについて同定確率増分推定値は２回目以降のＭＳ²測定にしか適用されないから、同定確率増分推定値が同定確率推定値を上回ってもその同定確率推定値が抽出された後に初めて同定確率増分推定値が抽出されることになる。

図１０（ｂ）の例では、同定に成功する確率が高い順に、まず、ｐ₁（ｒ⁽¹⁾）の曲線上で４個のＭＳ¹ピーク、Ｐ_A→Ｐ_B→Ｐ_C→Ｐ_Dが順に抽出される。なお、図１０（ｂ）においてｐ₁（ｒ⁽¹⁾）の曲線上で抽出された点（上記交点）は○印で示している。さらに同定確率が下がる方向に進むと、ｐ₁（ｒ⁽¹⁾）の曲線上のＰ_Eに対応した同定確率推定値よりもｐ₂（ｒ⁽¹⁾）の曲線上のＰ_Dに対応した同定確率増分推定値のほうが値が大きい。これは、ＭＳ¹ピークＰ_Eをプリカーサイオンとした１回目のＭＳ²測定を実行するよりも、ＭＳ¹ピークＰ_Dをプリカーサイオンとした２回目のＭＳ²測定を実行してＭＳ²スペクトルデータ積算を行ったほうが同定確率が高まることを意味している。そこで、ｐ₂（ｒ⁽¹⁾）の曲線上で１つのＭＳ¹ピークＰ_Dを抽出し、引き続いて、同じ理由でｐ₂（ｒ⁽¹⁾）の曲線上で２つのＭＳ¹ピーク、Ｐ_C→Ｐ_Bを順に抽出する。なお、図１０（ｂ）においてｐ₂（ｒ⁽¹⁾）の曲線上で抽出された点（上記交点）は□印で示している。

さらに同定確率が下がる方向に進むと、ｐ₁（ｒ⁽¹⁾）の曲線上のＰ_Eに対応した同定確率推定値よりもｐ₃（ｒ⁽¹⁾）の曲線上のＰ_Dに対応した同定確率増分推定値のほうが値が大きい。これは、ＭＳ¹ピークＰ_Eをプリカーサイオンとした１回目のＭＳ²測定を実行するよりも、ＭＳ¹ピークＰ_Dをプリカーサイオンとした３回目のＭＳ²測定を実行してＭＳ²スペクトルデータ積算を行ったほうが同定確率が高まることを意味している。そこで、ｐ₃（ｒ⁽¹⁾）の曲線上で１つのＭＳ¹ピークＰ_Dを抽出し、引き続いて、同じ理由でｐ₃（ｒ⁽¹⁾）の曲線上で２つのＭＳ¹ピーク、Ｐ_C→Ｐ_Bを順に抽出する。なお、図１０（ｂ）においてｐ₃（ｒ⁽¹⁾）の曲線上で抽出された点（交点）は△印で示している。

さらに同定確率が下がる方向に進むと、ｐ₁（ｒ⁽¹⁾）の曲線上のＭＳ¹ピークＰ_Eに対応した同定確率推定値が最も高いから、ここで初めてｐ₁（ｒ⁽¹⁾）の曲線上のＭＳ¹ピークＰ_Eを抽出する。引き続いて、ｐ₂（ｒ⁽¹⁾）の曲線上のＭＳ¹ピークＰ _E に対応した同定確率推定値よりも高い同定確率を示す、ｐ ₁ （ｒ⁽¹⁾）の曲線上のＭＳ¹ピークＰ _E を抽出し、同様の理由で次に、ｐ₃（ｒ⁽¹⁾）の曲線上のＭＳ¹ピークＰ _E を抽出する。

即ち、図１０（ｂ）の同定確率推定値及び同定確率増分推定値に従ったＭＳ²測定の優先順位は次のようになる。
（ｉ）Ｐ_A→Ｐ_B→Ｐ_C→Ｐ_Dの順に１回目のＭＳ²測定を実行。
（ii）Ｐ_D→Ｐ_C→Ｐ_Bの順に２回目のＭＳ²測定を実行し、得られたＭＳ²スペクトルデータを積算。
（iii）Ｐ_D→Ｐ_C→Ｐ_Bの順に３回目のＭＳ²測定を実行し、得られたＭＳ²スペクトルデータを積算。
（iv）Ｐ_Eに対するＭＳ²測定を実行。
（ｖ）Ｐ_Eに対する２回目のＭＳ²測定を実行し、得られたＭＳ²スペクトルデータを積算。
（vi）Ｐ_Eに対する３回目のＭＳ²測定を実行し、得られたＭＳ²スペクトルデータを積算。
以上のように、プリカーサイオン候補である複数のＭＳ¹ピークのＳＮ比と、同定確率推定モデルに基づく、ＳＮ比と同定確率推定値及び同定確率増分推定値との関係を示す曲線とを用いて、各ＭＳ¹ピークを対象とするＭＳ²測定の優先順位を決定することができる。

［ステップＳ２７］ＭＳ²測定シーケンスの最適化
ステップＳ２６ではＭＳ²測定の優先順位が決定されるが、常に、その優先順位に従って全てのＭＳ²測定を実行可能であるというわけではない。何故なら、一般に、１つの分画試料から得られたＭＳ¹スペクトル上でプリカーサイオンとして抽出されるＭＳ¹ピークの数は不定であるのに対し、測定時間や同定のためのデータ処理時間或いは測定回数などに制約があるのが一般的であるからである。そこで、１つの分画試料に対するＭＳ²測定回数の条件を与えることにより、複数のプリカーサイオンに対するＭＳ²測定の順序を規定するＭＳ²測定シーケンスの最適化を行う。ここでいう、最適なＭＳ²測定シーケンスとは、与えられたＭＳ²測定回数の制約の下で、同定される物質（この例ではペプチド）の総数の期待値が最大になるような測定シーケンスである。上述した、Ｐ_A、Ｐ_B、Ｐ_C、Ｐ_D、Ｐ_Eの５個のＭＳ¹ピークがプリカーサイオン候補として存在する場合について例示する。

いま１つの分画試料に対して延べ９回のＭＳ²測定が可能であるとする。即ち、ＭＳ²測定回数の制約が９である。ステップＳ２６で定められた優先順位に従えば、（ｉ）〜（iii）のＭＳ²測定の実行が可能である。そこで、ＭＳ¹ピークＰ_Aに対しては１回のみのＭＳ²測定を行ってＭＳ²スペクトルデータ積算なしとし、ＭＳ¹ピークＰ_Bに対しては２回のＭＳ²測定を行って得られたＭＳ²スペクトルデータを積算（２倍積算）し、ＭＳ¹ピークＰ_C、Ｐ_Dに対しては各３回のＭＳ²測定を行って得られたＭＳ²スペクトルデータをそれぞれ積算（３倍積算）するのが、最適なＭＳ²測定シーケンスである。ただし、例えばＭＡＬＤＩ等のイオン源では、同一の分画試料に対して繰り返しＭＳ²測定を行うとサンプルが劣化して信号強度が下がる傾向にあるため、ＳＮ比が相対的に小さいＭＳ¹ピークに対して優先的にＭＳ²測定を実行することが好ましい。このようなサンプル劣化を考慮した９回のＭＳ²測定の順序、つまり測定シーケンスは、ＭＳ¹ピークＰ_Dに対して３回のＭＳ²測定→ＭＳ¹ピークＰ_Cに対して３回のＭＳ²測定→ＭＳ¹ピークＰ_Bに対して２回のＭＳ²測定→ＭＳ¹ピークＰ_Aに対して１回のみのＭＳ²測定、となる。

他の例として、１つの分画試料に対して延べ１２回のＭＳ²測定が可能である場合を考える。即ち、ＭＳ²測定回数の制約が１２である。上記優先順位に従えば、（ｉ）〜（ｖ）までのＭＳ²測定が可能である。そこで、ＭＳ¹ピークＰ_Aに対しては１回のみのＭＳ²測定を行ってＭＳ²スペクトルデータ積算なしとし、ＭＳ¹ピークＰ_Eに対しては２回のＭＳ²測定を行って得られたＭＳ²スペクトルデータを積算（２倍積算）し、ＭＳ¹ピークＰ_B、Ｐ_C、Ｐ_Dに対しては各３回のＭＳ²測定を行って得られたＭＳ²スペクトルデータをそれぞれ積算（３倍積算）するのが、最適なＭＳ²測定シーケンスである。また、サンプル劣化を考慮した１２回のＭＳ²測定の順序、つまり測定シーケンスは、ＭＳ¹ピークＰ_Eに対して２回のＭＳ²測定→ＭＳ¹ピークＰ_Dに対して３回のＭＳ²測定→ＭＳ¹ピークＰ_Cに対して３回のＭＳ²測定→ＭＳ¹ピークＰ_Bに対して３回のＭＳ²測定→ＭＳ¹ピークＰ_Aに対して１回のみのＭＳ²測定、となる。

即ち、ＭＳ²測定シーケンス最適化のための定性的な基準は次のとおりである。
（１）ＳＮ比が大きいＭＳ¹ピークに対しては１回のみのＭＳ²測定を行い、図１０中のｐ₂（ｒ⁽¹⁾）の曲線のピーク付近にＳＮ比が位置するＭＳ¹ピークは２回のＭＳ²測定による２倍積算を行い、ｐ₃（ｒ⁽¹⁾）の曲線のピーク付近にＳＮ比が位置するＭＳ¹ピークは３回のＭＳ²測定による３倍積算を行うとよい。
（２）ＭＳ²測定実施可能延べ回数が少ないときには、ＭＳ²スペクトルデータ積算の不要な（つまり、ＳＮ比の大きな）ＭＳ¹ピークをＭＳ²測定対象として選択する。ＭＳ²測定実施可能延べ回数が増えるに従い、最適なＭＳ²測定回数が２回又は３回である（つまりＳＮ比が相対的に小さい）ＭＳ¹ピークについても選択する。

なお、上述した最適なＭＳ²測定シーケンスは、その分画試料に対するＭＳ²測定開始前に、つまりは実際にＭＳ²測定を全く行うことなく求められるものであり、あくまでも既知の同定確率推定モデルを参照して求められたものである。したがって、推定の確度は高いとはいえ、或る分画試料に対して求まった最適なＭＳ²測定シーケンスが絶対的に正しいとは限らない。そこで、或る分画試料に対するＭＳ²測定が途中まで進んだ段階で、それまでの該分画試料に対する同定結果を踏まえて、以降のＭＳ²測定の順序を改めて最適化するようにしてもよい。

以上のように、本発明に係る物質同定方法によれば、同定確率推定モデルのパラメータを目的試料の測定に先立って求めておくことにより、該同定確率推定モデルを利用した簡易な演算及び処理によって、同定される物質数が最大又はそれに近い状態となるように、複数のＭＳ¹ピークをプリカーサイオンとしたＭＳ²測定の適切な順序及び測定回数を、実際のＭＳ²測定実行前に定めることができる。したがって、定められたＭＳ²測定シーケンスに従ってプリカーサイオンを選択しながらＭＳ²測定を実行し、その測定結果を利用して物質同定を実施することにより、きわめて効率的に物質同定を行うことができる。

次に、上記物質同定方法を実施するための質量分析システムの一実施例を図１により説明する。図１は本実施例による質量分析システムの概略構成図である。
図１において、分析部１は、液体試料中の各種物質を保持時間に応じて分離するＬＣ部１１と、ＬＣ部１１で分離された物質を含む試料を分取・分画してそれぞれ異なる分画試料を調製する分取分画部１２と、複数の分画試料のうちの１つを選択して該分画試料に対する質量分析を実行するＭＳ部１３と、を含む。図示しないが、ＭＳ部１３は、ＭＡＬＤＩイオン源、イオントラップ、及び飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）を含むＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦＭＳであり、ＭＳ¹測定だけでなく、イオントラップにおいてプリカーサイオン選択と衝突誘起解離（ＣＩＤ）操作とを１乃至複数回繰り返した後にＴＯＦＭＳで質量分析を行うＭＳⁿ測定が可能となっている。ただし、ＭＳ¹測定及びＭＳ²測定のみを実行すればよい場合（ｎが３以上のＭＳⁿ測定が不要である場合）には、イオントラップとＴＯＦＭＳとの組み合わせに代えて、三連四重極型質量分析計のような、より簡単な構成の質量分析装置を利用することができる。

制御部２は上記分析部１中の各部の動作をそれぞれ制御する。分析部１のＭＳ部１３で得られたデータはデータ処理部３に入力され、データ処理部３で処理されて例えばその結果が表示部４に出力される。データ処理部３は機能ブロックとして、ＭＳ¹スペクトルデータやＭＳⁿスペクトルデータなどの測定データを収集するスペクトルデータ収集部３１、上記ステップＳ１２〜Ｓ１６に対応した処理を実行する同定確率推定モデル構築部３２、同定確率推定モデル構築部３２により得られたパラメータを記憶しておく同定確率推定パラメータ記憶部３３、上記ステップＳ２２〜Ｓ２４に対応した処理を実行する同定確率推定値算出部３４、上記ステップＳ２５に対応した処理を実行する同定確率増分算出部３５、上記ステップＳ２６に対応した処理を実行するＭＳⁿ測定優先順位決定部３６、上記ステップＳ２７に対応した処理を実行するＭＳⁿ測定シーケンス最適化部３７、及び所定のアルゴリズムに従って同定処理を実行する同定処理部３８、を含む。なお、データ処理部３や制御部２は、パーソナルコンピュータをハードウエア資源とし、該パーソナルコンピュータにインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアを実行することにより、上記のような各機能ブロックが具現化される構成とすることができる。

目的試料に対する網羅的同定を実行するに先立って、制御部２の制御の下に分析部１は同定確率推定モデル構築用試料から得られる各分画試料に対するＭＳ¹測定、ＭＳ²測定を実行する。同定処理部３８は、収集されたＭＳ¹、ＭＳ²スペクトルデータに基づいて同定処理を実行し、同定確率推定モデル構築部３２はそれらスペクトルデータ及び同定結果に基づいて同定確率推定モデルを作成する。そして、この同定確率推定モデルを再現するパラメータが同定確率推定パラメータ記憶部３３に格納される。

目的試料に対する網羅的同定時には、制御部２の制御の下に分析部１は、まず、目的試料から得られる各分画試料に対するＭＳ¹測定を実行し、スペクトルデータ収集部３１はＭＳ¹スペクトルデータを収集する。同定確率推定値算出部３４は、各分画試料に対するＭＳ¹スペクトルデータ毎に、同定確率推定パラメータ記憶部３３から読み出したパラメータに基づき再現した同定確率推定モデルを利用して、プリカーサイオン候補である複数のＭＳ¹ピークの同定確率推定値を算出する。また、同定確率増分算出部３５は、同じ同定確率推定モデルを利用して、ＭＳ¹ピークに対する２回目、３回目のＭＳ²測定を実行してデータ積算を行ったと仮定した場合の同定確率増分推定値を算出する。そして、ＭＳⁿ測定優先順位決定部３６は、分画試料毎に、複数のＭＳ¹ピークに対する同定確率推定値及び同定確率増分推定値からＭＳ²測定の優先順位を決定する。ＭＳⁿ測定シーケンス最適化部３７は与えられたＭＳⁿ測定回数条件やサンプル劣化の考慮有無などの付加的な条件に従って、同定される物質数が最大となるような最適なＭＳ²測定シーケンスを分画試料毎に求める。

上述したように分画試料毎に求まった最適なＭＳ²測定シーケンスは制御部２に送出され、制御部２はこのＭＳ²測定シーケンスに従って分析部１を制御することにより、目的試料から得られる各分画試料に対するＭＳ²測定を実行する。同定処理部３８は、先に収集された目的試料由来の各分画試料に対するＭＳ¹スペクトルデータと、新たに収集された目的試料由来の各分画試料に対するＭＳ²スペクトルデータとに基づいて同定処理を実行し、目的試料中の物質の同定を実行する。その同定結果は表示部４の画面上に表示される。以上のようにして、本実施例の質量分析システムでは、限られた測定時間又は測定回数で、より多数の物質の同定に至ることができる。

以上説明した実施例の動作は、最適なＭＳ²測定シーケンスが求まったあとに該シーケンスに従って自動的にＭＳ²測定が実行されるようにしたものであるが、最適なＭＳⁿ測定シーケンスを表示部４の画面上に一旦表示し、ユーザ（分析担当者）によるＭＳ²測定実行指示を受けて初めて目的試料に対するＭＳ²測定及び同定処理を実行するようにしてもよい。こうした構成とすれば、ユーザが自らの判断や経験に従ってＭＳ²測定シーケンスを適宜に手直ししてＭＳ²測定を実行させるようにすることができる。

なお、上記実施例では説明を簡単にするためにＭＳ¹ピークの同定確率を推定しその結果からＭＳ²測定シーケンスを求める場合について説明したが、これを拡張してＭＳ^n-1ピークをプリカーサイオンとしたＭＳⁿ測定を実行する前に、そのＭＳ^n-1ピーク毎の同定確率を推定し、その結果からＭＳⁿ測定シーケンスを求めることが可能であることは明らかである。

また、上記実施例は本発明の一実施例であり、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。

１…分析部
１１…ＬＣ部
１２…分取分画部
１３…ＭＳ部
２…制御部
３…データ処理部
３１…スペクトルデータ収集部
３２…同定確率推定モデル構築部
３３…同定確率推定パラメータ記憶部
３４…同定確率推定値算出部
３５…同定確率増分算出部
３６…ＭＳⁿ測定優先順位決定部
３７…ＭＳⁿ測定シーケンス最適化部
３８…同定処理部
４…表示部

Claims (12)

1. 各種物質が含まれる試料を分離用パラメータに従って分離し分画することで得られた複数の分画試料に対しＭＳⁿ測定（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することで得られたＭＳⁿスペクトルに基づいて、各分画試料に含まれる物質を同定する物質同定方法であって、
   a)所定の試料から得られた複数の分画試料に対するＭＳ^n-1測定により求まるＭＳ^n-1ピークのＳＮ比、及び該各ＭＳ^n-1ピークをプリカーサイオンとして実行されたＭＳⁿ測定の結果に基づく物質同定の結果を利用して、同種試料に由来するＭＳ^n-1ピークのＳＮ比と複数のＭＳ^n-1ピークをＳＮ比順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳⁿ測定及び同定を実行していったときに充分な確度で何らかの物質が同定できたピークの累積数との関係を示す同定確率推定モデルを求め、該同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶する同定確率推定モデル構築ステップと、
   b)同定対象である目的試料から得られた少なくとも１つの分画試料に対するＭＳ^n-1測定が終了した状況で、そのＭＳ^n-1測定により求まったＭＳ^n-1ピークの中で、プリカーサイオンの候補となる複数のＭＳ^n-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出するピークＳＮ比算出ステップと、
   c)前記同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、前記ピークＳＮ比算出ステップで算出されたＭＳ^n-1ピークのＳＮ比から該ＭＳ^n-1ピークの同定確率推定値を算出する同定確率推定ステップと、
   d)前記プリカーサイオン候補となる複数のＭＳ^n-1ピークについてそれぞれ推定された同定確率推定値を用いて、該複数のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定の優先順位を決定するＭＳⁿ測定順位決定ステップと、
   を有することを特徴とする物質同定方法。
   
2. 請求項１に記載の物質同定方法であって、
   前記プリカーサイオン候補となる複数のＭＳ^n-1ピークについて前記同定確率推定ステップにおいてそれぞれ推定された同定確率推定値に基づいて、同一のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定を複数回行ってその測定結果を積算したときの同定確率の増加度合である同定確率増分推定値を求める同定確率増分推定ステップをさらに有し、
   前記ＭＳⁿ測定順位決定ステップでは、前記同定確率推定ステップによる各ＭＳ^n-1ピークの同定確率推定値と、前記同定確率増分推定ステップによる同定確率増分推定値とに基づいて、同一ＭＳ^n-1ピークに対する複数回のＭＳⁿ測定を許容する条件の下で複数のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定の優先順位を決定することを特徴とする物質同定方法。
3. 請求項２に記載の物質同定方法であって、
   １つの分画試料に対するＭＳⁿ測定実行回数の上限の下で、前記ＭＳⁿ測定順位決定ステップで決定された優先順位と各ＭＳ^n-1ピークのＳＮ比とに基づいて、複数のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定を実行するための測定シーケンスを決定するＭＳⁿ測定シーケンス決定ステップを有することを特徴とする物質同定方法。
   
4. 請求項１〜３のいずれかに記載の物質同定方法であって、
   前記目的試料に対する測定に先立って前記所定の試料に対する測定を実行し、前記同定確率モデル構築ステップではその測定結果に基づいて同定確率推定モデルを作成することを特徴とする物質同定方法。
5. 請求項２又は３に記載の物質同定方法であって、
   前記分画試料に対するＭＳⁿ測定の実行に先立って、前記ピークＳＮ比算出ステップ、前記同定確率推定ステップ、前記ＭＳⁿ測定順位決定ステップ、及びＭＳⁿ測定シーケンス決定ステップによる一連の処理により該分画試料に対するＭＳⁿ測定の測定シーケンスを決定することを特徴とする物質同定方法。
6. 請求項５に記載の物質同定方法であって、
   前記分画試料に対するＭＳⁿ測定の実行に先立って、前記ピークＳＮ比算出ステップ、前記同定確率推定ステップ、前記ＭＳⁿ測定順位決定ステップ、及びＭＳⁿ測定シーケンス決定ステップによる一連の処理により該分画試料に対するＭＳⁿ測定の測定シーケンスを決定するとともに、該測定シーケンスに従ってＭＳⁿ測定を開始しその測定の途中段階で得られた同定結果を利用してその測定シーケンスを変更することを特徴とする物質同定方法。
7. 各種物質が含まれる試料を分離用パラメータに従って分離し分画することで得られた複数の分画試料に対しＭＳⁿ測定（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することで得られたＭＳⁿスペクトルに基づいて、各分画試料に含まれる物質を同定するために用いられる質量分析システムであって、
   a)所定の試料から得られた複数の分画試料に対するＭＳ^n-1測定により求まるＭＳ^n-1ピークのＳＮ比、及び該各ＭＳ^n-1ピークをプリカーサイオンとして実行されたＭＳⁿ測定の結果に基づく物質同定の結果を利用して求められた、同種試料に由来するＭＳ^n-1ピークのＳＮ比と複数のＭＳ^n-1ピークをＳＮ比順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳⁿ測定及び同定を実行していったときに充分な確度で何らかの物質が同定できたピークの累積数との関係を示す同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶しておく同定確率推定モデル情報記憶手段と、
   b)同定対象である目的試料から得られた少なくとも１つの分画試料に対するＭＳ^n-1測定が終了した状況で該分画試料に対するＭＳⁿ測定を実行するに先立って、そのＭＳ^n-1測定により求まったＭＳ^n-1ピークの中で、プリカーサイオンの候補となる複数のＭＳ^n-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出するピークＳＮ比算出手段と、
   c)前記同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、前記ピークＳＮ比算出手段で算出されたＭＳ^n-1ピークのＳＮ比から該ＭＳ^n-1ピークの同定確率推定値を算出する同定確率推定手段と、
   d)前記プリカーサイオン候補となる複数のＭＳ^n-1ピークについてそれぞれ推定された同定確率推定値を用いて、該複数のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定の優先順位を決定するＭＳⁿ測定順位決定手段と、
   を備え、前記ＭＳⁿ測定順位決定手段で決定された優先順位に従って前記分画試料に対するＭＳⁿ測定を実行することを特徴とする質量分析システム。
   
8. 請求項７に記載の質量分析システムであって、
   前記プリカーサイオン候補となる複数のＭＳ^n-1ピークについて前記同定確率推定手段においてそれぞれ推定された同定確率推定値に基づいて、同一のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定を複数回行ってその測定結果を積算したときの同定確率の増加度合である同定確率増分推定値を求める同定確率増分推定手段をさらに有し、
   前記ＭＳⁿ測定順位決定手段は、前記同定確率推定手段による各ＭＳ^n-1ピークの同定確率推定値と、前記同定確率増分推定手段による同定確率増分推定値とに基づいて、同一ＭＳ^n-1ピークに対する複数回のＭＳⁿ測定を許容する条件の下で複数のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定の優先順位を決定することを特徴とする質量分析システム。
9. 請求項８に記載の質量分析システムであって、
   １つの分画試料に対するＭＳⁿ測定実行回数の上限の下で、前記ＭＳⁿ測定順位決定手段により決定された優先順位と各ＭＳ^n-1ピークのＳＮ比とに基づいて、複数のＭＳ^n-1ピークに対するＭＳⁿ測定を実行するための測定シーケンスを決定するＭＳⁿ測定シーケンス決定手段と、
   決定された前記測定シーケンスに従って前記分画試料に対するＭＳⁿ測定を実行するＭＳⁿ測定実行制御手段と、
   をさらに備えることを特徴とする質量分析システム。
10. 請求項７〜９のいずれかに記載の質量分析システムであって、
    前記目的試料に対する測定に先立って前記所定の試料に対する測定を実行し、前記同定確率モデル構築手段はその測定結果に基づいて同定確率推定モデルを作成することを特徴とする質量分析システム。
11. 請求項８又は９に記載の質量分析システムであって、
    前記分画試料に対するＭＳⁿ測定の実行に先立って、前記ピークＳＮ比算出手段、前記同定確率推定手段、前記ＭＳⁿ測定順位決定手段、及びＭＳⁿ測定シーケンス決定手段による一連の処理により該分画試料に対するＭＳⁿ測定の測定シーケンスを決定することを特徴とする質量分析システム。
12. 請求項１１に記載の質量分析システムであって、
    前記分画試料に対するＭＳⁿ測定の実行に先立って、前記ピークＳＮ比算出手段、前記同定確率推定手段、前記ＭＳⁿ測定順位決定手段、及びＭＳⁿ測定シーケンス決定手段による一連の処理により該分画試料に対するＭＳⁿ測定の測定シーケンスを決定するとともに、該測定シーケンスに従ってＭＳⁿ測定を開始しその測定の途中段階で得られた同定結果を利用してその測定シーケンスを変更することを特徴とする質量分析システム。

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